KR101549744B1 - 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 마이코플라즈마성 폐렴 예방을 위한 혼합백신 조성물 - Google Patents

돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 마이코플라즈마성 폐렴 예방을 위한 혼합백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명의 혼합백신은 종래의 백신으로 치료하기 어려운 국내에서 발생한 신규한 돼지의 써코바이러스 2형 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 균주에 의하여 발생할 수 있는 질병을 효과적으로 예방할 수 있다.
또한 개별백신을 2회 접종하는 것에 비하여 부작용을 최소화할 수 있으며 다른 종류의 혼합백신에 비하여 돼지의 써코바이러스 2형 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 항원간에 간섭현상을 최소화할 수 있다.

Description

돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 마이코플라즈마성 폐렴 예방을 위한 혼합백신 조성물{Mixed vaccine composition for Porcine circovirus type 2 and Porcine Mycoplasma hyopneumoniae}
본 발명은 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 마이코플라즈마성 폐렴 예방을 위한 혼합백신 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규한 돼지 써코바이러스 2형과 신규한 마이코플라즈마 하이오뉴모니에를 동시에 효과적으로 예방할 수 있는 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 마이코플라즈마성 폐렴 예방을 위한 혼합백신 조성물에 관한 것이다.
돼지의 써코바이러스 2형 (PCV-2; Porcine circovirus 2)은 이유자돈의 이유자돈 전신성소모성증후군 (Postweaning multisystemic wasting syndrome; PMWS)의 중요한 원인체로 밝혀진 바이러스이다.　 ‘이유자돈 전신성소모성증후군(PMWS)'이란 이유자돈에서의 소모성 증상을 특징으로 하는 돼지의 질병으로, 캐나다, 미국, 북 아일랜드, 유럽, 한국, 일본, 대만 등의 국가에서 보고되고 있다. ‘전신성소모성증후군 (PMWS)'에 걸리면 이유자돈에서 폐사나 위축, 증체량의 감소를 초래하며, 보통 6개월에서 1년간 지속되기 때문에 매우 심각한 경제적 피해를 가져오게 된다.
삭제
새로운 동물 바이러스과인 써코비리대 (Circoviridae)로 분류된 돼지 써코바이러스는 PMWS 임상증상 및 병리소견을 나타내는 돼지에서 지속적으로 확인되었다.　 PMWS 증상의 돼지에서 분리된 PCV-2는 PRRS 바이러스와 돼지 파보바이러스 등의 복합감염 형태 또는 글래서씨병, 마이코플라즈마, 흉막폐렴 등의 질병을 일으키는 세균의 2차 감염에 의해 이유자돈에서 PMWS 증상을 나타낸다. 이 질병은 일반적으로 건강상태가 좋은 돈군에서 발생하며 이환률은 낮으나, 5-12주령의 돼지에 있어서 비교적 높은 폐사율을 보인다. 또한 호흡기 질병으로 5~7 주령이 이유자돈에서는 잘 발생하지 않는 흉막폐렴이 급성으로 발병하여 많은 수의 자돈들이 폐사하고, 흉막폐렴 예방백신을 접종하여도 크게 개선되지 않는 사례가 보고 되고 있다.
돼지써코바이러스와 관련된 질환으로는 이미 언급한 이유자돈 전신성 소모성 증후군 (PMWS; postweaning multisystemic wasting syndrome) 이외에 돼지 피부염 신부전 증후군 (PDNS; porcine dermatitis and nephropathy syndrome), 복합 돼지 호흡기 질병 (PRDC; porcine respiratory disease complex), 모돈유산폐사 증후군 (SAMS; sow abortion and mortality syndrome), 번식장애 등에서 관련성이 입증되고 있다.
한편, 돼지의 Mycoplasma성 폐렴의 원인체로 잘 알려진 Mycoplasma hyopneumoniae (마이코플라즈마 하이오뉴모니아)는 돼지 인플루엔자 바이러스 및 기타 여러 원인체가 관여하여 발생하는 PRDC(Porcine Respiratory Disease Complex)의 원인체로 알려져 있다. 마이코플라스마 하이오뉴모니아에는 세포 벽이 결핍된 천천히 성장하는 박테리아로, 기도의 섬모층 세포에서 콜로니를 이루어, 면역 시스템에 거의 노출되지 않는다. 일반적으로 어린 돼지에게서 관찰되는 폐 병변은 내피 세포의 과다 형성, 및 단핵 세포의 혈관주위 및 세기관지 주위 축적의 증가를 특징으로 한다. M. 하이오뉴모니아에 감염 후, 돼지 내에서 면역 반응이 관찰되며, 저항성이 유도된다. 임상적 징후 및 병변 확장은 M. 하이오뉴모니아에의 병원성 용량 및 폐에서의 방어 반응의 결과이다. 폐렴의 경제적 연관성은 최초 M. 하이오뉴모니아에 감염에 후속되는 통상의 2차 감염에 의해 크게 영향받는다. M. 하이오뉴모니아에는 또한 돼지 호흡기 복합 감염증 (PRDC)과 연관된다. PRDC 의 임상적 징후를 갖는 돼지로부터 가장 흔하게 단리되는 병원체는 면역 시스템의 세포를 감염시키거나, 또는 심각한 면역병리를 초래한다. 또한 M. 하이오뉴모니아는 돼지의 심외막염(pericarditis)와 관절염(Arthritis)에서도 분리 확인되며, 만성적인 질환으로 생산성감소 및 경제적 손실의 원인이 된다.
한편, 돼지의 써코바이러스 2형 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니에는 여러종류의 아종이 존재하며 이 경우 교차반응으로 인하여 종래의 백신으로는 한계가 있었다. 또한 혼합백신의 경우 혼합되어 있는 개별 항원이 서로 간섭현상을 일으켜 효능을 감소시킬 수 있는 문제가 발생하였다.
본 발명에 사용된 용어를 설명한다.
용어,"생독 백신"은 살아있는 바이러스 활성 성분을 포함하는 백신을 의미한다. 용어, "약독화(attenuation)"란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 바이러스의 약독화는 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 바이러스 서열의 특정 결실 또는 바이러스 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다.
용어, "사독 백신"은 불활화 백신 또는 사균 백신이라고도 하며, 죽은 바이러스를 포함한 백신이다. 이의 예로는 전 바이러스 백신(whole-virus vaccine)과 분할 백신(split vaccine)이 있으며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 제조가능하다. 예컨대 전 바이러스 백신은 바이러스 전체에 포르말린을 처리하여 제조할 수 있으며, 분할 백신은 바이러스에 에테르를 처리하여 외피만을 분쇄, 수득하여 제조할 수 있다.

[선행기술문헌]
[특허문헌]
대한민국 공개특허공보 제2010-0005453호 (2010.01.15)
대한민국 공개특허공보 제2011-0123725 (2011.11.15)
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 종래의 백신으로 치료하기 어려운 국내에서 발생한 신규한 돼지의 써코바이러스 2형 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 균주를 동정하고 이를 약독화 또는 사독화하고 이들을 혼합한 혼합백신을 제공하는 것이다.
상술한 첫번째 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 12462BP로 기탁된 돼지 써코바이러스 2형 및 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 12463BP로 기탁된 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 에서 유래하며, 이들을 약독화 또는 사독화시켜 유효성분으로 함유하는 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 마이코플라즈마성 폐렴 예방을 위한 혼합백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 돼지 써코바이러스 2형은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니에는 서열번호 2로 표시되는 16S rRNA를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 혼합백신 조성물은 돼지 써코바이러스 2형과 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니에가 7 : 3 ~ 3 : 7의 부피비로 혼합된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 돼지 써코바이러스 2형의 역가는 1.0 x 105 TCID50/ml(tissue culture infective dose 50%) 이상이고, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 사독백신은 균주 역가가 1.0 x 108 CCU/ml 이상일 수 있다.
본 발명의 혼합백신은 종래의 백신으로 치료하기 어려운 국내에서 발생한 신규한 돼지의 써코바이러스 2형 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 균주에 의하여 발생할 수 있는 질병을 효과적으로 예방할 수 있다.
또한 개별백신을 2회 접종하는 것에 비하여 부작용을 최소화할 수 있으며 다른 종류의 혼합백신에 비하여 돼지의 써코바이러스 2형 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 항원간에 간섭현상을 최소화할 수 있다.
도 1은 본 발명의 혼합백신을 접종한 돼지의 서혜 임파절의 소절 내에 림프구를 나타낸 사진으로서 서혜 임파절의 소절 내에 림프구가 정상적으로 차지하고 있다.
도 2는 양성대조군 서혜임파절을 나타낸 사진으로서 서혜 임파절의 소절 내에 임파구가 매우 소실되어 있으며, 대식세포 내에 바이러스 소체들이 관찰된다.
도 3은 본 발명의 혼합백신을 접종한 돼지의 혼합 백신군 폐장으로서 염증이나 임파조직의 증식없이 정상소견을 나타낸다.)
도 4는 양성 대조군 폐장으로서 기관지 주위 임파조직의 증식으로 기관지가 압박되어 폐포내 공기가 없는 무기폐 소견이 나타난다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이 돼지의 써코바이러스 2형 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니에는 여러종류의 아종이 존재하며 이 경우 교차반응으로 인하여 종래의 백신으로는 한계가 있었다. 또한 혼합백신의 경우 혼합되어 있는 개별 항원이 서로 간섭현상을 일으켜 효능을 감소시킬 수 있는 문제가 발생하였다.
이에 본 발명에서는 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 12462BP로 기탁된 돼지 써코바이러스 2형 및 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 12463BP로 기탁된 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 에서 유래하며, 이들을 약독화 또는 사독화시켜 유효성분으로 함유하는 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 마이코플라즈마성 폐렴 예방을 위한 혼합백신 조성물을 제공한다. 이를 통해 종래의 백신으로 치료하기 어려운 국내에서 발생한 신규한 돼지의 써코바이러스 2형 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 균주에 의하여 발생할 수 있는 질병을 효과적으로 예방할 수 있다. 또한 개별백신을 2회 접종하는 것에 비하여 부작용을 최소화할 수 있으며 다른 종류의 혼합백신에 비하여 돼지의 써코바이러스 2형 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 항원간에 간섭현상을 최소화할 수 있다.
구체적으로 본 발명자들은 신규한 돼지 써코바이러스 2형을 동정하고 이를 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 12462BP로 기탁하였다. 상기 기탁된 신규한 돼지 써코바이러스 2형은 서열번호 1의 1767bp의 염기서열을 가지며 전 기존의 유전자 염기 배열순서가 밝혀진 다른 돼지 써코바이러스 2형과의 관계를 분석해본 결과 스페인에서 분리된 돼지 써코바이러스 2b형 (AF055394)과 가장 유전자적 특성의 유사성(99.6%)이 높은 것으로 확인하였다.
또한 본 발명자들은 신규한 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니에를 동정하고 이를 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 12463BP로 기탁하였다. 상기 기탁된 신규한 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니에는 서열번호 2로 표시되는16S rRNA 서열을 가지며 GenBank 번호 Y00149.1 (ATCC 27719 균주)와 가장 유사한 것(99.4%)으로 나타났다.
한편, 질병 원인 바이러스인 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 약독화 또는 사독화는 통상적인 방법으로 시행될 수 있다. 즉, 항원(원인 바이러스)을 포름알데히드, 포르말린, 파라포름알데히드, 베타-프로피올락톤, 에틸렌이민 또는 이의 유도체와 같은 화학제에 노출시키거나 열, 방사선 조사 등의 방법으로 사독할 수 있다. 약독화는 질병 원인균의 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 균주의 염기서열의 특정 결실 또는 균주의 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다.
약독화 또는 사독화된 본 발명의 신규한 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니에를 유효성분으로 혼합하여 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 마이코플라즈마성 폐렴 예방을 위한 혼합백신 조성물을 제조한다. 이 경우 혼합백신의 제조방법은 통상의 약독화 또는 사독화된 바이러스의 혼합백신의 제조방법을 적용할 수 있으며, 바람직하게는 1000 rpm으로 회전하는 혼합기(shaking machine)에 1시간 동안 회전과 진동을 동반한 방법에 의하여 혼합하여 제조할 수 있다.
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이 경우 바람직하게는, 상기 혼합백신 조성물은 돼지 써코바이러스 2형과 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니에가 7 : 3 ~ 3 : 7의 부피비로 혼합된 것일 수 있다. 만일 상기 조성비를 벗어나면 개별항원간에 간섭현상이 발생할 우려가 있다.
한편, 본 발명의 혼합백신 조성물은 본 발명의 항원들을 개별적으로 접종하는 것에 비하여 부작용을 최소화할 수 있으며 다른 종류의 혼합백신에 비하여도 간섭현상을 최소화할 수 있다(실시예 3 참조).
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 혼합백신에서 돼지 써코바이러스 2형의 역가는 1.0 x 105 TCID50/ml(tissue culture infective dose 50%) 이상이고, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 사독백신은 균주 역가가 1.0 x 108.0 CCU/ml 이상일 때 항체 형성 유도가 가장 높게 증가됨을 확인할 수 있다(표 10 참조).
본 발명의 백신 조성물에는 상술한 약독화 또는 사독화 항원 이외에 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 여기서 약제학적으로 허용 가능한 담체는 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않고, 화학적으로 불활성이며, 투여되는 피험체에게 독성이 아닌 담체 매질을 의미한다. 각종 담체들이 당 기술분야에 공지되어 있으며, 증류수, 염수 또는 미네랄수가 포함될 수 있다.
또한 본 발명의 조성물에는 약제학적 또는 수의학적으로 허용될 수 있는 하나 이상의 보존제를 포함할 수 있다. 예를 들어 EDTA염, 메티올레이트 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에 당업자에게 공지된 기술에 따라 아쥬번트를 첨가할 수 있다. 아쥬번트의 예로는 수산화알루미늄과 같은 광물겔, 리조레시틴과 같은 계면활성제, 사포닌이나 사포닌 유도체와 같은 글리코시드, 란티딘, Avridine, 카보폴(carbopol), 폴리포스파젠, DDA(dimethyldioctadecylammonium bromide), 퀼 에이(quil A), 암피겐, 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 제약기술 분야 및 수의학 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 표준기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 백신의 함량은 의학기술분야 및 수의학 기술분야의 당업자들이 투여 대상 개체의 연령, 성별, 체중, 종족 및 상태와 같은 인자 및 투여 경로를 고려하여 결정할 수 있다. 이 조성물은 단독으로 투여하거나 또는 다른 면역학적 항원 또는 백신 조성물 또는 치료제 조성물과 함께 투여하거나 후속투여를 할 수 있다.
본 발명의 백신이 사용될 수 있는 제형의 예로는 구강, 비강, 항문, 질, 위 내 투여용의 현탁액, 시럽 등과 같은 액상 제제 및 피하, 내피, 근육 내, 또는 정맥 내 투여용의 멸균 현탁 또는 에멀션제제를 포함할 수 있다. 또한 사용 전에 약제학적으로 허용 가능한 희석제에 재현탁되는 가용성 성분 또는 미립자의 고체 제제일 수 있다. 가용성 성분 또는 미립자는 코아세르베이션, 바이아세르베이션, 응고, 분무건조, 기포건조, 침전, 동결건조 등 약제학 분야 및 수의학 분야의 당업자에게 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다.
상기 백신은 수의학적으로 허용되는 다양한 경로를 통해 돼지에 투여될 수 있다. 예를 들어, 근육주사 또는 피내주사 등으로 투여될 수 있다. 투여경로에 따라 수의학 분야의 당업자들이 투여량을 결정할 수 있다. 예컨대 모돈의 경우 2회를, 자돈의 경우 1회를 접종할 수 있으나, 1차 접종으로 면역이 완전히 형성되어 2차 접종이 필요 없는 장점이 있다.
이때, 양돈 농장에서 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 마이코플라즈마성 폐렴 예방을 위해 모돈에게 분만후 2-3주가 경과된 시점에서 백신을 직접 접종할 수 있다.
결국, 본 발명의 혼합백신은 종래의 백신으로 치료하기 어려운 국내에서 발생한 신규한 돼지의 써코바이러스 2형 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 균주에 의하여 발생할 수 있는 질병을 효과적으로 예방할 수 있다.
또한 개별백신을 2회 접종하는 것에 비하여 부작용을 최소화할 수 있으며 다른 종류의 혼합백신에 비하여 돼지의 써코바이러스 2형 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 항원간에 간섭현상을 최소화할 수 있다.
이하, 본 발명을 바람직한 실시예 및 실험예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 설명하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 신규한 돼지 써코바이러스 2형과 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 예방 혼합 사독백신
1-1-1. 신규한 돼지 써코바이러스 2형 동정
서울대학교 병리실에 의뢰된 이유후 전신성 소모성 증후군(postweaning multisystemic wasting syndrome) 증상이 있는 돼지에서 분리된 porcine circovirus type 2 (PCV2; KCTC 12462BP)로서 5계대 배양한 바이러스를 백신주로 사용하였다.
1-1-2. 돼지 써코바이러스 2형 백신균주의 염기배열 특성
백신주로 사용되는 돼지 써코바이러스 2형의 염기배열 순서를 분석한 결과 전체 유전자 크기는 1767 base pair(서열번호 1)로서 기존의 유전자 염기 배열순서가 밝혀진 다른 돼지 써코바이러스 2형과의 관계를 분석해본 결과 스페인에서 분리된 돼지 써코바이러스 2b형 (AF055394)과 가장 유전자적 특성의 유사성(99.6%)이 높은 것으로 확인하였다.
1-1-3. 돼지 써코바이러스 2형 예방 사독백신 제조 방법
PK-15 세포가 75 % 단층화(monolayer)된 175 cm2 세포 배양플라스크(30ml)를 준비하였다. 단층화된 플라스크의 배양액을 버린 후에 세포 세척용 PBS 10ml을 넣어 3회 세척하였다. 상층액을 버린 후 상기 기탁된 돼지 써코바이러스 2형을 5ml 접종하였다. 바이러스 접종 후 1시간동안 37℃에서 배양한다. 이때, 10분마다 한번씩 좌우로 흔들어 주었다. 1시간 후, 15ml의 5% FBS(Fetal Bovine Serum) 이 포함된 DMEM 배양액을 첨가한다. 24시간 후, 플라스크 안의 배양액을 버리고, PBS 10ml 을 넣어 세척하고, 준비된 glucosamine 3ml (300mM; Sigma G1514)을 첨가한다. 30분 동안 37℃에서 배양 후 glucosamine을 전부 버린 후 다시 PBS로 세척하였다. 2.5% FBS가 첨가된 DMEM 배양액을 50ml 다시 첨가한 후 4-5일간 37℃에서 배양하였다.
배양이 끝난 돼지 써코바이러스 2형이 담긴 175 cm2를 -80oC 초저온 냉동고에 넣었다. 2시간 후, 꺼내어 상온에서 녹인다. 다 녹은 후, 다시 -80oC 초저온 냉동고에 넣는다. 이렇게 총 3회를 반복한 후에 완전히 녹이고 50ml tube에 분주한다. 7000rpm 10분동안 원심을 돌린다. 상층액을 회수한 후, 0.8μm, 0.45μm 실린지 필터를 이용하여 필터링하였다. 2L 플라스크에 증식된 바이러스를 옮기고 바이러스 1200ml에 0.7 %의 농도로 포르말린 10ml을 넣는다. 4도의 shaking 배양기에서 24시간동안 반응시키면서 바이러스를 불활화 한다. 24시간 후, 알루미늄[All(OH)3 gel] 젤을 전체 용량의 10%인 (1,200*1/9=133) 133ml 만큼 첨가하였다. 12시간 동안 shaking 배양기에서 잘 혼합한 후, 멸균된 100ml 병에 담았다.
1-2-1. 마이코플라즈마균 하이오뉴모니에 사용 균주
2011년 8월 도축장에서 채취한 마이코플라즈마 폐렴 병소를 나타낸 돼지 폐장 조직으로부터 분리한 WKMH-9 마이코플라즈마 균주(KCTC 12463BP)를 기탁하고 이를 백신균주로 사용하였다. 마이코플라즈마균주의 16S rRNA 유전자(서열번호 2) 분석 결과 GenBank 번호 Y00149.1 (ATCC 27719 균주)와 가장 유사한 것으로 나타났다.
1-2-2. 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 예방 사독백신 제조 방법
마이코플라즈마 하이오뉴모니에 균주 WKMH-9 를 말혈청 20%, 돼지혈청 10%, 효모 추출액 0.5% 가 첨가된 Friis 배양액 300ml 에 접종하여 37℃ 의 5% CO2 shaking 배양기에서 배양하였다. 2주 정도 배양 후 마이코플라즈마균이 증식하면서 배양액이 노란색으로 변화되면 수거하여 색조의 변화를 기반으로 한 Color Change Unit (CCU)로 역가를 측정한 후 균주 농도를 108 CCU/ml 로 맞추었다. 배양된 마이코플라즈마 균주 300 ml 에 포르말린을 0.2% 농도(6ml)로 첨가하였다. 4℃의 shaking 배양기에서 24시간 이상 마이코플라즈마 균주를 불활화 시킨 후 알루미늄 젤[All(OH)3 gel] 을 10% 농도(33ml)로 첨가하였다. 12시간 동안 shaking incubator에서 잘 혼합한 후, 멸균된 100ml 병에 담았다.
1-3. 돼지 써코바이러스 2형과 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 혼합백신 조성
돼지 써코바이러스 2형과 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 혼합백신은 2ml로 구성하며, 돼지 써코바이러스 2형 사독백신은 바이러스 역가가 1.0 x 105 TCID50/ml(tissue culture infective dose 50%) 이상의 농도로 1ml을 함유하고, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 사독백신은 균주 역가가 1.0 x 108.0 CCU/ml 이상의 농도로 lml 이 함유되도록 하여 총 2ml의 혼합백신을 제조하였다.
<실시예 2> 혼합 사독백신의 돼지 질병예방 시험
2-1 효능평가
혼합백신의 효능 평가를 위하여 백신군과 대조군으로 실험디자인을 설정하여 실험실내 공격 시험을 실시하였다. 백신군은 혼합백신 접종 후 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)과 마이코플라즈마균을 함께 공격 접종하는 돈군으로, 양성 대조군은 백신 접종을 하지 않고 돼지 써코바이러스 2형과 마이코플라즈마균을 함께 공격 접종하는 돈군으로, 음성 대조군은 백신 및 공격 접종을 하지 않은 돈군으로 구분하였다.
그룹 실험두수 백신접종 공격접종
(7주령)		 부검 실시
(11주령)
3주령 1회접종
백신군 5 O PCV2 + MHP O
양성 대조군 3 X PCV2 + MHP O
음성 대조군 3 X X O
2-2. 실험 결과
2-2-1. 돼지 써코바이러스 2형에 의한 서혜 임파절 병변 분석
돼지 써코바이러스 2형에 의한 병변의 척도인 표 2는 각 군별 서혜 임파절 병변 스코어로서 서혜 임파절 병변 분석에서 혼합백신을 접종한 백신군의 경우 5두 중 3두에서 특이적인 병변이 나타나지 않았으며(스코어 0, 도 1), 나머지 2두는 약한 림프구 소실(스코어 1)을 나타냈다. 양성 대조군의 경우 3두 중 1두에서 림프소절의 심한 림프구 소실을 보였으며(스코어 3), 나머지 2두에서는 림프소절 등 전체적으로 매우 심한 림프구 소실을 나타냈다(스코어 4, 도 2). 전체적으로 혼합 백신을 접종한 군이 양성 대조군에 비하여 유의적인 차이를 보이며 서혜 임파절 병변이 적게 나타난 것으로 확인되었다.
개체번호 혼합백신군 양성대조군 음성대조군
1 0 4 0
2 1 4 0
3 0 3 0
4 1 - -
5 0 - -
2-2-2. 마이코플라즈마균에 의한 폐장 병변 분석
마이코플라즈마균에 의한 병변 정도에 따라 각 군별 폐렴 병변 점수 비교한 결과를 표 3에 나타내었다. 백신군의 경우 5두 중 3두에서는 병변 소견이 나타나지 않았으며(스코어 0, 도 3), 2두에서는 일부에서 기관지 주위에 약한 림프구 증식 소견이 관찰되었다(스코어 1). 양성 대조군의 경우 공시돈 3두 중 2두에서는 다발적으로 기관지 주위 림프조직의 증식이 관찰되었고(스코어 3, 도 4), 나머지 1두에서는 기관지 상피세포의 괴사와 기관지 주위 림프조직의 증식, 폐포 허탈 등이 관찰되었다(스코어 4). 병변 분석 결과 유의적인 차이를 보이며 혼합 백신을 접종한 군이 양성 대조군에 비하여 병변이 적게 나타난 것으로 확인되었다.
개체번호 혼합 백신군 양성 대조군 음성 대조군
1 0 3 0
2 1 3 0
3 2 4 0
4 0 - -
5 0 - -
<실시예 3> 개별 백신 2회 투여(돼지 써코바이러스 2형 + 마이코플라즈마 하이오뉴모니에)와 혼합백신 1회 투여 비교
그룹 실험두수 접종백신 접종연령
1 25 혼합백신 2ml 1회 3주
2 25 개별백신 1ml 씩 2회
 3주
상기 표 4와 같이 그룹을 구성하고 각 그룹에 대하여 백신을 접종한 후 3주령에 혼합백신 및 개별 백신 접종 30분(표 5), 1시간(표 6), 4시간(표 7), 24시간(표 8) 후에 각 개체별 임상 증상을 관찰하고 항목에 따라 그 결과를 표 5 ~ 8에 기록하였다. 개별백신 접종은 본 발명의 혼합백신 성분을 혼합하지 않고 개별적으로 접종한 것이다.
그룹 시험
두수		 접종
일령		 임상 증상 발현 두수
쇼크 발열 구토 식욕
저하		 화농 위축 폐사 체온
1 25 3주령 0 0 0 0 0 0 0 39.36
2 25 3주령 0 1 1 2 0 0 0 40.07
그룹 시험
두수		 접종
일령		 임상 증상 발현 두수
쇼크 발열 구토 식욕
저하		 화농 위축 폐사 체온
1 25 3주령 0 0 0 0 0 0 0 39.19
2 25 3주령 0 1 0 2 0 0 0 39.71
그룹 시험
두수		 접종
일령		 임상 증상 발현 두수
쇼크 발열 구토 식욕
저하		 화농 위축 폐사 체온
1 25 3주령 0 0 0 0 0 0 0 39.11
2 25 3주령 0 1 0 2 0 0 0 39.52
그룹 시험
두수		 접종
일령		 임상 증상 발현 두수
쇼크 발열 구토 식욕
저하		 화농 위축 폐사 체온℃
1 25 3주령 0 0 0 0 0 0 0 39.05
2 25 3주령 0 0 0 2 0 0 0 39.43
임상증상 관찰 결과, 혼합백신 1회 접종군에서는 백신 접종 후 특이적인 증상을 나타내는 개체는 없었고, 개별 백신 2회 접종군의 경우 전체적으로 혼합백신 군에 비하여 체온이 높게 나타났으며, 발열이나 구토, 식욕저하 증상을 보이는 개체들이 관찰되었다. 이를 통해 본 발명에서는 혼합백신이 아닌 개별백신으로 복수회 접종하는 경우 부작용이 나타나는 것을 확인할 수 있다.
<실시예 4> 항원양에 따른 혼합백신 항체 역가 실험

그룹
실험두수
(3주령)		 백신 항원량
PCV2
(TCID50/ml)		 Mycoplasma
hyopneumoniae (CCU/ml)
1 3 103 105
2 3 104 106
3 3 105 107
4 3 106 108
5 3 107 109
대조군 3 X X
표 9와 같이 5개의 그룹을 구성하고 혼합백신의 항체역가 농도를 달리하였다.
돼지 써코바이러스 2형 항체가 측정
검사할 혈청을 1:1000으로 희석하여 SERELISA PCV2 Ab Mono Blocking ELISA 키트(Synbiotics, Lyon, France)의 plate well에 100μl 분주하고, 양성 대조군 및 음성 대조군 샘플을 각 2개의 well에 100μl 씩 분주한다. 검사할 각 well을 필름으로 덮고, 37oC 에서 1시간 동안 보관하여 반응 시킨 후 세척액을 이용하여 4회 반복하여 세척하였다. Peroxidase가 표지된 conjugate 용액을 1:100으로 희석하여 각 well 에 분주하고 37oC 에서 1시간 동안 보관한다. 각 well을 세척한 후 발색제(buffered peroxidase substrate)를 100μl 씩 분주하고 빛을 차단하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응 중지 용액을 50μl 분주하여 반응을 멈추고 450 nm 파장으로 optical density(OD) 값을 측정한다. 양성 대조군의 OD 값이 0.600 이하, 음성 대조군의 OD 값이 0.800 이상 일 때 유효한 값으로 간주하며, 키트에 제공된 계산식에 의하여 측정값을 titer 로 환산하였을 때 검사 혈청의 titer 가 550 이상인 경우 양성으로 판정하였다.
마이코플라즈마 하이오뉴모니에 항체가 측정
채취한 혈액을 이용하여 마이코플라즈마에 대한 특이적인 항체를 상용화된 Mycoplasma Hyopneumoniae Antibody Test Kit(The herdChek M.hyo, Westbrook, ME, USA)를 이용하여 마이코플라즈마에 대한 항체를 측정한다. 측정하기 10-20분 전 마이코플라즈마 kit를 미리 상온에서 방치한다. 항원이 흡착된 plate에 원액의 양성대조혈청 및 음성대조혈청을 100μl씩 각 2개의 well에 분주하고, 혈청을 40배 희석하여 각각 100μl씩 에 분주하였다. 실온(18~25oC)에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 상층액을 제거하고 1x 세척액을 350μl씩 분주하여 털어버리는 방법으로 3회 세척하였다. 세척 후에 HRP anti-porcine IgG conjugate를 각 well에 100μl씩 분주하고 실온에서 30분 동안 반응하였다. 반응이 끝나면 상층액을 제거하고 1x 세척액을 350μl씩 분주하여 털어버리는 방법으로 3회 세척하였다. 세척 후에 TMB 발색제를 각 well에 100μl씩 분주하고 15분간 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 정지액을 각 well에 1000μl씩 분주하여 반응을 정지시키고 ELISA reader에서 650nm의 흡광도로 측정하였다. 키트와 함께 제공되는 음성대조 혈청은 O.D.값이 0.150 이하로 나타났고, 양성대조 혈청 O.D.값과 0.150 이상의 차이를 보여 판정 조건을 모두 충족하였다. 결과는 S/P값이 0.4이상일 경우 양성으로 판정하며, 본 실험에서는 S/P값의 증가를 비교하였다.
실험 결과
그룹 항체가 (평균±표준편차)
PCV2
(Titer)		 Mycoplasma
hyopneumoniae
(S/P ratio)
1 622±119 0.211±0.113
2 742±185 0.235±0.095
3 791±161 0.332±0.138
4 1,231±291 0.517±0.162
5 1,247±284 0.538±153
대조군 <150 < 0.1
표 10에서 알 수 있듯이, 돼지 써코바이러스 2형 항원은 105 TCID50/ml 이상, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 항원은 108 CCU/ml 이상 포함되어 있을 때 항체 형성 유도가 가장 높게 증가됨을 확인할 수 있었다.
본 발명은 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 마이코플라즈마성 폐렴 예방에 대단히 유용하다.
한국생명공학연구원 KCTC12462BP 20130731 한국생명공학연구원 KCTC12463BP 20130731
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Mixed vaccine composition for Porcine circovirus type 2 and Porcine Mycoplasma hyopneumoniae <130> 1040054 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1767 <212> DNA <213> Porcine circovirus type 2 <400> 1 accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60 agaagaatgg aagaagcgga ccccaacccc ataaaaggtg ggtgttcact ctgaataatc 120 cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg atcttccaat atccctattt gattatttta 180 ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt 240 ttgtgaagaa gcagactttt aataaagtga agtggtattt gggtgcccgc tgccacatcg 300 agaaagcgaa aggaacagat cagcagaata aagaatactg cagtaaagaa ggcaacttac 360 tgatcgagtg tggagctcct agatctcagg gacaacggag tgacctgtct actgctgtga 420 gtaccttgtt ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg 480 tcagaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg 540 attggaagac taatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg 600 ctgctaattt tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac aagtggtggg 660 atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccctggg 720 atgatctact gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agagactaaa ggtggaactg 780 tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840 cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tttatcggag gattacttcc ttggtatttt 900 ggaagaatgc tacagaacaa tccatggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960 catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt 1020 ttttattatt cattaagggt taagtggggg gtctttaaga ttaaattctc tgaattgtac 1080 atacatggtt acacggatat tgtattcctg gtcgtatata ctgttttcga acgcagtgcc 1140 gaggcctacg tggtctacat ttccagcagt ttgtagtctc agccacagct gatttctttt 1200 gttgtttggt tggaagtaat caatagtgga atctaggaca ggtttggggg taaagtagcg 1260 ggagtggtag gagaagggct gggttatggt atggcgggag gagtagttta cataggggtc 1320 ataggtgagg gctgtggcct ttgttacaaa gttatcatct agaataacag cactggagcc 1380 cactcccctg tcaccctggg tgatcgggga gcagggccag aattcaacct taacctttct 1440 tattctgtag tattcaaagg gcacagagcg ggggtttgag ccccctcctg ggggaagaaa 1500 gtcattaata ttgaatctca tcatgtccac cgcccaggag ggcgttttga ctgtggttcg 1560 cttgatagta tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgttg aagatgccat ttttccttct 1620 ccagcggtaa cggtggcggg ggtggacgag ccaggggcgg cggcggagga tctggccaag 1680 atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctccg gtaacgcctc cttggatacg tcatatctga 1740 aaacgaaaga agtgcgctgt aagtatt 1767 <210> 2 <211> 1537 <212> DNA <213> Porcine Mycoplasma hyopneumoniae <400> 2 cgcaatcatg agagtttgaa cctggctcag gataaacgct agctgtgtgc ttaatacatg 60 catgttgaac ggaatatttt agttcgctaa aatatttagt agcaaatggg tgagtaacac 120 gtacctaacg taccttttgg actgggataa ccattggaaa cagtggctaa taccagatat 180 gataaaaatt tgcatgaatt tttattcaaa ggagccttca agcttcacca agaaatgggg 240 gtgcgcaaca ttagttagtt ggtagggtaa aagcctacca agacgatgat gtttagcggg 300 gccaagaggt tgtaccgcca cactgggatt gagatacggc ccagactcct acgggaggca 360 gcagtaagga atattccaca ataagcgata gcttgatgga gcgacacagc gtgcaggatg 420 aagtctttcg ggatgtaaac tgctgttgta agggaagaaa aaactagata ggaaatgctc 480 tagtcttgac ggtaccttat tagaaagcga cggcaaacta tgtgccagca gccgcggtaa 540 tacataggtc gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa agcgtccgta ggttttttgt 600 taagtttaaa gttaaatgct aaagctcaac tttagtccgc tttagatact ggcaaaatag 660 aattatgaag aggttagcgg aattcctagt ggagtggtgg aatacgtaga tattaggaag 720 aacaccaata ggcgaaggca gctaactggt catatattga cactaaggga cgaaagcgtg 780 gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgat cattagttgg 840 tggcaaaagt cactaacaca gctaacgcgt taaatgatcc gcctgagtag tatgctcgca 900 agagtgaaac ttaaaggaat tgacgggaac ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960 ttgaagatac gcgtagaacc ttacccacgc ttgacattct cgcaaaacta tagagatata 1020 gccgaggcta acgagatcac agatggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1080 taggttaagt cctgcaacga gcgcaaccct tttcttaagt tgctaacatt tagttgagaa 1140 ccctaaagat actgccggcg caagccggag gaaggtgggg acgacgtcaa atcatcatgc 1200 ctcttacgag tggggcaaca cacgtgctac aatggctact acaatgagca gcaaaacagt 1260 gatgtcaagc taatctcaaa aaagtagtct cagttcggat tgaagtctgc aactcgactt 1320 catgaagtcg gaatcgctag taatcgcagg tcagctatac tgcggtgaat acgttctcgg 1380 gttttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagttggtaa tgcccaaagt cggtgagtta 1440 actacggaga ccattgccta aggcaggacc gatgactggg gtgaagtcgt aacaaggtat 1500 ccctacgaga acgtgggcat ggaacatctc ctttcta 1537

Claims (5)

  1. 약독화 또는 사독화 시킨 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 12462BP로 기탁된 돼지 써코바이러스 2b형; 및 약독화 또는 사독화 시킨 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 12463BP로 기탁된 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니에;를 유효성분으로 함유하며,
    바이러스 역가가 1.0 x 105 TCID50/ml(tissue culture infective dose 50%) 이상인 돼지 써코바이러스 2b형 및 역가가 1.0 x 108 CCU/ml 이상인 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니에가 7 : 3 ~ 3 : 7의 부피비로 혼합된,
    돼지 써코바이러스 2b형 및 돼지 마이코플라즈마성 폐렴 예방을 위한 혼합백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 돼지 써코바이러스 2b형은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 써코바이러스 2b형 및 돼지 마이코플라즈마성 폐렴 예방을 위한 혼합백신 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니에는 서열번호 2로 표시되는 16S rRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 써코바이러스 2b형 및 돼지 마이코플라즈마성 폐렴 예방을 위한 혼합백신 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
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