JP6931059B2 - 豚用混合ワクチン - Google Patents
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Description
Mhyoに対して、様々な市販のワクチンが存在し、これらは養豚業の業務の大部分で日常的に使用されている。一般に、これらのワクチンは、典型的には非経口注射によって投与される、サブユニットタンパク質および/またはバクテリン(すなわち、死菌、無処理または処理)などの非複製免疫原を含む。いくつかの例は、RespiSure(商標)(Zoetis)、Ingelvac(商標)M.hyo(Boehringer Ingelheim)およびM+Pac(商標)(Merck Animal Health)である。
PCV2の場合:血液およびリンパ組織におけるウイルス量の減少;肥育豚において:死亡率および体重減少の減少および、
PRRSVの場合:肥育豚について:成長および飼料効率の改善につながる、壊死性間質性肺炎による呼吸器疾患の軽減。繁殖豚について:経胎盤ウイルス移行の減少、および早産、死産またはミイラ化変性仔豚などの生殖機能障害および生存仔豚における衰弱および離乳後呼吸器疾患の改善。
PCV2の非複製抗原の場合:ORF2タンパク質は、組み換え発現系から得られるか、またはレプリコン粒子を介して送達および発現され;AlphaVaxによって開発されたように、レプリコン粒子は欠損アルファウイルス粒子である。発現されるORF2配列の親PCV2は、PCV2血清型a、b、cまたはdの何れかであり得るか、またはこれらの血清型のうちの1つ以上からのキメラ由来であり得る。
Mhyoに対して:Mhyoによって引き起こされる肺病変、例えばコンソリデーションがある(consolidated)肺炎など、および慢性呼吸器疾患の予防または軽減;
ローソニア(Lawsonia)に対して:ローソニア(Lawsonia)によるコロニー形成および糞便排出の減少および腸過形成を伴う回腸炎、豚出血性腸症または豚腸腺腫症の徴候の軽減。
−本混合ワクチンは、約1〜約9%w/vの量のスクワランを含み、好ましくはスクワランは、2〜5%w/vの量で含まれる;
−本混合ワクチンは、約1〜約10%w/vの量のビタミンE−アセテートを含み、好ましくは、ビタミンE−アセテートは、3〜5%w/vの量で含まれる;
−ビタミンE−アセテートは、好ましくは、酢酸DL−アルファ−トコフェロールである;
−混合ワクチンは、水相および油性エマルションの混合物から、約20:80〜約80:20の体積比で調製される。
−水中油型エマルションはサブミクロンエマルションであり;より好ましくは、油滴は500nm以下のD50を有する。
−本混合ワクチンは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ(Mycoplasma hyopneumoniae)由来の非複製抗原も含む;
−本混合ワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス(Lawsonia intracellularis)由来の非複製抗原も含んでいる;
−本混合ワクチンはマーカーワクチンである;および
−本混合ワクチンは豚用である。
−PCV2由来の非複製抗原、および生PRRSVを含む水相を調製する工程;および
−スクワランおよびビタミンE−アセテートを含む油性エマルションと前記水相を混合する工程
を含む。
−凍結乾燥形態の生PRRSVを調製する工程;
−PCV2由来の非複製抗原を含む水相を調製する工程;
−スクワランおよびビタミンE−アセテートを含む油性エマルションと前記水相を混合する工程;および
−水相および油性エマルションの前記混合物を用いて前記凍結乾燥生PRRSVを再構成する工程
を含む。
さらなる態様において、本発明は、本発明による混合ワクチンの調製方法に関し、この方法は、
−凍結乾燥形態の生PRRSVを調製する工程;
−凍結乾燥形態の非複製ローソニア(Lawsonia)抗原を調製する工程;
−PCV2由来の非複製抗原を含む水相を調製する工程;
−スクワランおよびビタミンE−アセテートを含む油性エマルションと前記水相を混合する工程;および
−水相および油性エマルションの前記混合物を用いて前記凍結乾燥生PRRSVおよび前記非複製ローソニア(Lawsonia)抗原を再構成する工程
を含む。
−PCV2由来の非複製抗原を含む水相およびスクワランおよびビタミンE−アセテートを含む油性エマルションの混合物を調製する工程;および
−前記混合物を用いて凍結乾燥形態の生PRRSVを再構成する工程
を含む。
さらなる態様において、本発明は、豚用の混合ワクチンの製造のための、PCV2由来の非複製抗原および生PRRSVの使用であって、このワクチンが、スクワランとビタミンE−アセテートを含む水中油型エマルションであることを特徴とする使用に関する。
1.混合ワクチンの調製
本発明による混合ワクチンは以下のように調製した:
2x濃度の油性エマルションは100gあたり次のものを含有する:
ポリソルベート80(Tween 80):3.24g;
スクワラン:6.75g;
DL−アルファトコフェロールアセテート:7.94g;
注射用水:82.07g
この油性エマルションは、次の後続工程段階に従って調製した:
−Tween 80およびスクワランの必要量を秤量し、ビーカー中で合わせた:
−Tween 80/スクワラン混合物を室温で低エネルギー混合(マグネチックスターラー)により均質化し、
−酢酸DL−アルファトコフェロールの必要量を秤量し、均質化したTween 80/スクワラン混合物に添加し、
−室温で低エネルギー混合することによって、合わせた混合物を再び均質化し、
−混合物を65〜75℃に加熱し、
−注射用水を65〜75℃に加熱し、
−N18ロッド付きのUltra Turraxによる高エネルギー混合を使用して、加熱した油相および水を5〜15分間、予め混合し、温度を65℃から55℃に低下させ、
−予備混合物を800barでマイクロフルイダイザーに3回通し、冷却スパイラルで温度を50℃未満に保った。
本発明の油性エマルションを生PRRSVの試料とともに温置し、何らかの殺ウイルス効果が生じるか否かを判定した。
3.1.導入
実施例1のように調製され、Mhyo、ローソニア(Lawsonia)およびPCV2の非複製抗原とともに、水中で微小流動化(microfluidised)されたスクワラン、ビタミンE−アセテートおよびポリソルベート80を含む、生PRRSVなしの混合ワクチンを動物において試験した。ワクチン接種は、3週齢で筋肉内経路によりワンショット用量として与えた。Mhyoの効力は、ワクチン接種4週間後に攻撃感染によって試験した。いくつかの他のアジュバントを比較した。
この実験に対して84匹のSPF仔豚を使用した。12匹の動物の6つの群に、3週齢(+/−3日)で1回、筋肉内にワクチン接種した。12匹の豚の1つの群はワクチン未接種のままにして、負荷試験の対照群とした。ワクチン接種前およびワクチン接種の2日後に直腸温を測定した。さらに、SVEA群に対しては、局所反応について注射部位を毎週触診した。ワクチン接種の4週間後に、全ての動物に病原性Mhyo株を感染させた。負荷試験の3週間後、全ての動物を安楽死させ、死後に肺病変について調べた。全ての動物から、ワクチン接種前、負荷試験前および死後に血液試料を採取した。
いくつかのワクチン処方物を試験したが、これらは使用した処方物のタイプおよびアジュバントの点が異なるだけであり;抗原含有量は同じであった。以下のアジュバントを試験した:
・Amphigen:レシチン入りの鉱物油の水中油
・SVEA:スクワラン、ビタミンE−アセテートおよびTween80入りの微小流動化(microfluidised)水中油型エマルション
・SVEA+Al(OH)3:0.2%w/v水酸化アルミニウム入りのSVEA(Porcilis PCV Mhyoの場合と同じ)
・MF59+DDA:MF59は、スクワレン、ポリソルベート80およびSpan85入りの水中油型エマルションであり;DDAはカチオン性脂質:ジメチルジオクタデシルアンモニウムである。
負荷試験:
負荷試験材料は、Mhyo、病原性野外株、豚血清入りのFRIIS培地中の新鮮な3日間培養物であった。9CCUを含有する10mLの培養物を2日連続で動物1匹に対して気管内投与した。全ての動物を通常の獣医学的管理下に置いた。
ワクチン接種は3週齢であったが、そのとき、動物はまだその母豚と一緒であった。用量は3mLであり、頸部右側に筋肉内投与した。離乳は4週齢であった。負荷試験の1週間前に、豚を負荷試験施設に移した。
血液試料(頸静脈由来)をワクチン接種直前(T=0)、負荷試験直前(T=4)および死後(T=7)に採取した。血清が得られるまで、試料を周囲温度で保持した。(Elisaを介した)PCV2またはローソニア(Lawsonia)に対する血清試料中の関連抗体の存在は、標準的な手順に従って決定した。
ワクチン接種直前、ワクチン接種4時間後、ワクチン接種後2日間にわたり毎日および5週間にわたり毎週、SVEA群の注射部位を局所反応について検査した。ワクチン接種の5週間後に依然として局所反応を示した動物は、局所反応が消失するまで毎週個別に触診した。
直腸温を測定し、ワクチン接種の1日前および直前、ワクチン接種の4時間後ならびに1および2日後に臨床観察(0=正常、1=低活動性、2=嘔吐、3=臥位)を行った。
この実験の終了時、負荷試験の3週間後に、全ての豚を安楽死させた。個々の動物における局所反応について注射部位を調べた。Goodwin&Whittlestoneスコアに従って、個々に各豚について%肺病変スコアを記録した。
ワクチン接種部位の触診によって監視し、温度について調べた群は、SVEAをアジュバントとして添加されたワクチンを投与された群(群2)であった。これらは、監視期間を通して検出可能な局所的腫脹および温度上昇が観察されなかったことを示した。
表2は、混合ワクチンに対する広い効力が達成困難であることを実証しており;試験したアジュバントのうちのいくつかは、病原体の1つまたはさらには2つに対して防御的であるとして示され得る免疫を誘導し;これは、低いMhyo肺病変スコアに関して、またはPCV2およびローソニア(Lawsonia)に対する十分に高い特異的抗体タイターとしての何れかである。しかし、SVEAアジュバント添加ワクチンについてのみ、3つ全ての病原体に効果的となるのに十分な防御であった。他のアジュバントは何れもその広範な効力レベルに達しなかった。
さらなるワクチン接種−負荷実験を実施し、それによって豚に本発明による4種混合ワクチンをワクチン接種し、4回の個別の実験において、このワクチンを4つの成分全て:Mhyo、ローソニア(Lawsonia)、PCVおよびPRRSVの効力について試験した。
4種混合ワクチンは、Porcilis PRRS凍結乾燥ワクチンを用いて上記のように調製した。
この実験には24匹のSPF仔豚を使用した。12匹の動物の1つの群に、約3週齢で1回、筋肉内にワクチン接種した。12匹の豚の1つの群はワクチン未接種のままにして、負荷試験の対照群とした。ワクチン接種の4週間後に、全ての動物に病原性Mhyo株を用いて負荷試験を行った。負荷試験の3週間後、全ての動物を安楽死させ、死後に肺病変について調べた。全ての動物から、ワクチン接種前、負荷試験前および死後に血液試料を採取した。
負荷試験材料は、豚血清入りのFRIIS培地中の新鮮な3日間培養物としてのMhyo病原性野外株由来であった。動物1匹につき、それぞれ10および9CCUを含有する10mLの培養物を2日連続で気管内投与した。全ての動物を通常の獣医学的管理下に置いた。
この実験の終了時、負荷試験の3週間後に、全ての豚を安楽死させた。Goodwin&Whittlestoneスコア(上出)に従って、個々に各豚について%肺病変スコアを記録した。
本発明による4種混合ワクチンを用いた豚のワクチン接種は、Mhyo攻撃感染により誘発される感染および疾患の徴候を防御するのに有効であった。また、血清学によって測定した場合、ローソニア(Lawsonia)およびPCV2に対する防御の良好な発達もあった。
4種混合ワクチンは、Porcilis PRRS凍結乾燥ワクチンを用いて上記のように調製した。
仔豚を10匹ずつの処置群に割り当てた。仔豚は、およそ5週齢のときに皮内または筋肉内にワクチン接種した:
−1群にSVEAアジュバント中の4種混合ワクチンを筋肉内にワクチン接種した:PCV2−Orf2(2500AU/mL)、Mhyo(1.0PCVU/mL)、ローソニア(Lawsonia)(5000AU/mL)および105TCID50/用量のPRRSVとともに処方したワクチンの単回2mL用量。PRRSワクチンを溶解してからワクチン接種するまでの時間は1時間であった。
温度の読み取りは有意な結果を示さなかった。
2つのワクチン接種群からの仔豚は全て、試料日付22(3週p.v.)で既に抗PCV2抗体について100%血清転換に達した。実際のタイターはその後さらに増加し、SD35からプラトーに達した。ワクチン未接種の対照は、負荷試験後にのみ血清転換したが、20%を超える血清転換には到達しなかった。
リンパ節および扁桃腺におけるPCVの徴候について免疫組織学的スクリーニングおよびスコア化を行った。結果から、両ワクチン接種群において、スコアが平均0.3であり、一方ワクチン未接種の対照群において、IHCスコアが平均1.6であったことが示された。
群1についてのローソニア(Lawsonia)血清学は、SD22からのタイターの上昇を示したが、一方で、対照群においては、ローソニア(Lawsonia)タイターは着実な減少を示した。
PRRSVについての血清学的結果は、典型的にはSP(試料対陽性)比として表す。この比が0.4を上回ると、試料はPRRSV血清転換について陽性と見なされる。PRRSVについての表4のセクションは、これらのSP値を表す。これらは、陽性対照群2(id経路によるPRRSVワクチン)の動物がPRRSV血清転換に対して強く陽性であったことを示し;それにもかかわらず、群1の動物(im経路による4種混合ワクチン)もまた良好な血清転換率に達した。ワクチン未接種対照は、0.05を上回るSP比が見られなかったので、PRRSVについていかなる血清転換も殆ど示さなかった。
本発明による4種混合ワクチンによる豚のワクチン接種は、PCV2攻撃感染により誘発される感染および疾患の徴候を防御するのに有効であった。また、血清学によって測定した場合、ローソニア(Lawsonia)およびPRRSVに対する防御の良好な発達があった。
4種混合ワクチンは、Prime Pac PRRS凍結乾燥ワクチンを用いて上記のように調製した。
3週齢豚の3つの群に4種混合ワクチンを接種し、5週間後に病原性ローソニア(Lawsonia)細菌による攻撃感染を行った。一方の群には完全4種ワクチンを与え、他方の群にはローソニア(Lawsonia)抗原を除く全ての同じ成分を含む対照ワクチンを与えた。第3群には対照ワクチンを与えたが、これらは負荷試験の前に集団にローソニア(Lawsonia)感染がないことを確認するために負荷試験時に剖検したので、負荷試験を行わなかった。
豚は雄雌混合であり、混血アメリカン・ヨークシャー−ランドレース−デュロック(mixed American Yorkshire−Landrace−Duroc)種であった。水および齢に適切な飼料を自由に摂取させた。
回腸炎に対するスコアは、組織病理学による回腸炎の顕微鏡的病変スコアおよび回腸の肉眼的病変重症度スコアに基づいた。
糞便排出:
負荷試験から14日後(dpc)に群間で有意差は見られなかった。しかし、20dpcでの糞便排出の結果から、この時点でワクチン接種豚が排出していたローソニア(Lawsonia)はプラセボ群よりも有意に少ないことが示され(p=0.0134)、これによって、ワクチン接種物による、より早期の回復が示される。
20dpcで回収された回腸擦過物のqPCRから、プラセボワクチンを投与された群においてローソニア(Lawsonia)による有意により多くのコロニー形成が示された(p=0.0094)。
負荷試験後、プラセボワクチンを投与された群と比較した場合、4種ワクチン接種豚において1日の重量増加も有意に改善された(p=0.0337)。
本発明による4種混合ワクチンによる豚のワクチン接種は、ローソニア(Lawsonia)攻撃感染により誘発される感染および疾患の徴候を防御するのに有効であった。
4種混合ワクチンを上記のように調製し、これに、ワクチン接種の直前に、PrimePac(商標)PRRSワクチンのアンプルの再構成からのPRRSVが含まれるようにした。
この試験の目的は、3週齢豚のワクチン接種および4.5週間後に病原性PRRSVを用いて負荷試験を行うことにより、本発明による混合ワクチンのPRRS分画の免疫原性を評価することであった。
鼻腔あたり2mLの希釈負荷試験材料を用いて、鼻腔内にPRRSV負荷試験を行った。負荷試験ウイルスを投与直前に調製し、使用前および使用中は氷上で維持した。総負荷試験用量は、動物1匹あたりおよそ4.2log10TCID50であった。
負荷試験の直前および続いてその後に、呼吸促迫および嗜眠の臨床所見を記録した。臨床スコアは、0:正常から3:重度の呼吸困難および/または頻呼吸および/またはストレス時の顕著な腹式呼吸の範囲で示され、豚の急速な動きを短時間誘発することによってストレスが誘発された。
関与する肺の%での肺病変スコアの中央値は、プラセボワクチン群については20%であり、それに対して4種ワクチン群については7%であった(p=0.0014)。
本発明による4種混合ワクチンによる豚のワクチン接種は、PRRSV攻撃感染により誘発される感染および疾患の徴候を防御するのに有効であった。
Claims (13)
- スクワランおよびビタミンE−アセテートを含む水中油型エマルションであることを特徴とする、豚サーコウイルス2型(PCV2)由来の非複製抗原および生きている豚生殖器・呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)を含む混合ワクチン。
- 1〜9%w/vの量でスクワランを含む、請求項1に記載の混合ワクチン。
- 1〜10%w/vの量でビタミンE−アセテートを含む、請求項1または2に記載の混合ワクチン。
- 前記水中油型エマルションがサブミクロンエマルションである、請求項1〜3の何れか1項に記載の混合ワクチン。
- マイコプラズマ・ハイオニューモニエ(Mycoplasma hyopneumoniae)(Mhyo)由来の非複製抗原も含む、請求項1〜4の何れか1項に記載の混合ワクチン。
- ローソニア・イントラセルラリス(Lawsonia intracellularis)(ローソニア(Lawsonia))由来の非複製抗原も含む、請求項1〜5の何れか1項に記載の混合ワクチン。
- 少なくとも2つの容器を含むキットオブパーツ(kit of parts)であって、
1つの容器が、スクワランおよびビタミンE−アセテートを含む水中油型エマルション中にPCV2由来の非複製抗原を含み;
1つの容器が、凍結乾燥形態の生PRRSVを含む、キットオブパーツ。 - 請求項1〜6の何れか1項に記載の混合ワクチンの調製方法であって、
−PCV2由来の非複製抗原および生PRRSVを含む水相を調製する工程;および
−スクワランおよびビタミンE−アセテートを含む油性エマルションと前記水相とを混合する工程
を含む、方法。 - 請求項1〜6の何れか1項に記載の混合ワクチンの調製方法であって、
−凍結乾燥形態の生PRRSVを調製する工程;
−PCV2由来の非複製抗原を含む水相を調製する工程;
−スクワランおよびビタミンE−アセテートを含む油性エマルションと前記水相とを混合する工程;および
−水相および油性エマルションの前記混合物を用いて前記凍結乾燥生PRRSVを再構成する工程
を含む、方法。 - 請求項1〜6の何れか1項に記載の混合ワクチンの調製方法であって、
−PCV2由来の非複製抗原を含む水相およびスクワランおよびビタミンE−アセテートを含む油性エマルションの混合物を調製する工程;および
−前記混合物を用いて凍結乾燥形態の生PRRSVを再構成する工程
を含む、方法。 - PCV2およびPRRSVに対する豚のワクチン接種での使用のための、スクワランおよびビタミンE−アセテート、PCV2由来の非複製抗原および生PRRSVを含む、水中油型エマルション。
- 豚用混合ワクチンの製造のための、PCV2由来の非複製抗原および生PRRSVの使用であって、
前記ワクチンが、スクワランおよびビタミンE−アセテートを含む水中油型エマルションであることを特徴とする、使用。 - PCV2およびPRRSVに対する豚のワクチン接種の方法であって、請求項1〜6の何れか1項に記載の混合ワクチンの前記豚への投与による、方法。
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