CN114364398A - 用于皮内施用的联合疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽医疫苗学领域，即猪用联合疫苗。特别地，本发明涉及用于进行保护以对抗猪圆环病毒2型(PCV2)和猪肺炎支原体(Mhyo)病原体感染的联合疫苗，其包含PCV2的非复制性免疫原和Mhyo的非复制性免疫原。该疫苗的特征在于它是包含角鲨烷、维生素E醋酸酯和二氧化硅的水包油乳剂。在另一个实施方案中，本发明涉及通过皮内施用来进行保护以对抗PCV2和Mhyo的病原体感染的联合疫苗。

Description

用于皮内施用的联合疫苗

技术领域

本发明涉及兽医疫苗学领域，即猪用联合疫苗。特别地，本发明涉及用于进行保护以对抗猪圆环病毒2型(PCV2)和猪肺炎支原体(Mhyo)的病原体感染的联合疫苗，其包含PCV2的非复制性免疫原和Mhyo的非复制性免疫原。该疫苗的特征在于它是包含角鲨烷、维生素E醋酸酯和二氧化硅的水包油乳剂。在另一个实施方案中，本发明涉及通过皮内施用来进行保护以对抗PCV2和Mhyo的病原体感染的联合疫苗。

背景技术

如今，集约化养猪很大程度上依赖于兽医医疗产品来保持动物健康并允许经济运行。仅次于优化饲料和农场管理系统，经常使用各种治疗方法：药物(例如激素或抗生素)和针对细菌或病毒病原体的疫苗接种。从幼年开始影响猪的一些最突出的疾病由细菌(例如猪肺炎支原体)和病毒(例如猪圆环病毒2型)引起。

猪肺炎支原体(Mhyo)是在世界范围内出现的引起(猪)地方性肺炎(一种猪慢性呼吸道疾病)的主要病原体。尤其是幼小仔猪易患这种高传染性疾病。这种细菌相对较小，缺乏细胞壁，属于柔膜菌属(Mollicutes)。这些细菌在宿主细胞上或宿主细胞中以寄生生活方式存活。由Mhyo导致的肺疾病主要是导致巩固性肺炎的免疫介导的病理学。细菌定殖并损伤肺纤毛上皮，导致纤毛活动丧失。根据住房条件和环境压力，这种疾病的最有问题的后果是它容易受到由其它细菌和病毒病原体引起的猪呼吸系统的不同的继发性感染。这产生所谓的：猪呼吸道疾病综合征(PRDC)，表现出严重的肺部病变。除了动物感到不适之外，由于生长速率和饲料转化率的性能降低以及兽医护理和抗生素使用的成本，地方性肺炎和PRDC对养猪业造成重要的经济损失。

猪圆环病毒2型(PCV2)与仔猪中观察到的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)有关。1996年发表了临床症状和病理，包括进行性消瘦、呼吸困难、呼吸急促和偶有黄疸和黄疸。称为PCV2的新因子与已知PCV不同，所述PCV是PK-15细胞的天然污染物。PCV2是圆环病毒属中一种非常小的无包膜病毒，它包含具有两个主要基因的环状单链DNA基因组。ORF2基因编码约233个氨基酸的病毒衣壳蛋白。重组表达的PCV2 ORF2蛋白形成病毒样颗粒，其作为亚单位疫苗是高效的。

现有多种针对Mhyo的商品化疫苗，这些疫苗常规用于大多数商品化的猪养殖操作。通常，这些疫苗包含非复制性免疫原，例如亚单位蛋白和/或菌苗(即完整或非完整的灭活细菌)，其通常通过肠胃外注射施用。一些示例是：

(Zoetis)、

M.hyo(Boehringer Ingelheim)和

(Merck Animal Health)。

用于预防性治疗动物(特别是猪)以对抗PCV2感染的常规疫苗可基于作为(非复制)免疫原的全灭活PCV2病毒。而且，在本领域中已经发现ORF2编码的衣壳蛋白(例如当重组表达时)适合作为PCV2的亚单位免疫原用于适当的疫苗。这是可以理解的，因为该亚基在体内的表现方式与病毒本身相同(它形成病毒样颗粒)，本质上的区别仅在于DNA和非结构蛋白不存在于衣壳内。在本领域中，一些针对PCV2的疫苗是可商购的。

PCV(购自MSD Animal Health,Boxmeer,The Netherlands)是一种用于保护猪以对抗猪圆环病毒2型的疫苗，其用于三周龄及以上的猪。当以两次注射(两次剂量)疫苗施用时，免疫持续时间(DOI)为22周，几乎完全覆盖猪的育肥期。Ingelvac

(购自BoehringerIngelheim,Ingelheim)是一种用于保护猪以对抗猪圆环病毒2型的疫苗，其用于两周龄及以上的猪，它被登记为一次注射(一剂)疫苗。

(购自Merial,Lyon,France)是一种用于保护猪以对抗猪圆环病毒2型，其用于三周龄及以上的猪。

PCV(购自Zoetis,Capelle a/d IJssel,The Netherlands)是一种用于保护猪以对抗猪圆环病毒2型的疫苗，其用于三周龄及以上的猪。其他PCV2疫苗被描述于例如WO2007/028823、WO2007/094893和WO2008/076915中。

为了限制动物的应激和管理员的成本和劳动力，已经制备了一些猪疫苗作为联合疫苗。示例是：可在施用前不久混合的Ingelvac CircoFLEX和Ingelvac MycoFLEX(Boehringer)，

PCV MH(Zoetis)和

PCV MHyo(MSD Animal Health)，其组合来自PCV2和Mhyo的抗原。

包含非复制性免疫原的疫苗的重要组分是佐剂。这为非复制性免疫原提供了免疫刺激，否则该免疫原将不是免疫原性的。这将触发免疫系统的不同途径，其基本机制还不清楚。在兽医疫苗中，多种化合物可用作佐剂，例如：矿物油，例如

或

或石蜡油；非矿物油，例如角鲨烯、角鲨烷，或植物油，例如油酸乙酯；铝盐，例如氢氧化铝或磷酸铝；多肽，例如二甲基甘氨酸或促凝素(tuftsin)；细菌细胞壁组分，例如脂质A和胞壁酰二肽；(合成)聚合物，例如普朗尼克类(pluronics)、葡聚糖、卡波姆、吡喃或皂苷；细胞因子；和toll样受体的刺激剂，例如含有非甲基化cpg基团的免疫刺激性寡脱氧核苷酸等。

研发佐剂化的联合疫苗中要克服的主要问题是防止将对免疫应答或疫苗安全性或稳定性产生负面影响的各种疫苗组分之间的相互作用。这种相互作用可以例如发生在免疫原本身之间，例如因为一些是相当粗的产物，例如Mhyo的菌苗。但是，对于PCV2和Mhyo，本领域已经表明这些病原体的各种类型的非复制性免疫原可以组合为有效的疫苗。然而，佐剂可能干扰或甚至损害疫苗免疫原。这也被提供上市许可的注册机构认可，例如：USDA施行法规9CFR 113.35用于检测包含活病毒的灭活疫苗中的杀病毒活性。其次，施用的特定途径可能对佐剂组合物的安全性具有显著影响：当肌内施用时佐剂可能是安全的，但皮下施用时则导致不可接受的安全问题。

复合联合疫苗开发中的这些潜在问题通常被认识到；参见例如来自EMEA的出版物：“Note for guidance:requirements for combined veterinary products”(EMEA,2000,CVMP/IWP/52/97-FINAL)；以及美国卫生和公众服务部，食品和药品管理局，生物评价和研究中心于1997年4月发布的：“Guidance for Industry,for the evaluation ofcombination vaccines for preventable diseases:Production,Testing and ClinicalStudies”，备案号97N-0029。这些出版物都警告当免疫原和佐剂组合时，干扰对疫苗的功效和安全性的影响。

因此难以开发一种诱导针对与多种病原体物种相关的免疫原的复杂组合的有效免疫应答的联合疫苗。此外，联合疫苗在动物中使用时应该是安全的，即不产生明显的副反应，例如发烧、局部肿胀、食欲不振等。此外，更实用的特性是相关的：联合疫苗理想地应该能够经济生产，在配制和储存期间足够稳定，并且在存在其它免疫原的情况下允许针对每种免疫原的效力测试方法。

总而言之，众所周知针对多种病原体的联合疫苗接种并不简单，并且需要实验来测定安全性和功效，特别是当联合的疫苗接种是含佐剂的联合疫苗时。

因此，需要克服现有技术中的一个或多个缺点，并提供对抗与PCV2和Mhyo感染相关的疾病的有效且安全的联合疫苗。

在大量动物的疫苗接种中，重要的是限制对其接种疫苗的动物和人的应激。此外，通过常规肌内途径的疫苗接种通常与动物的疼痛和应激相关，并且与副反应和感染的风险增加相关。克服与肌内施用相关的问题的一种可能性是通过向皮内施用进行疫苗接种，也称为皮内施用。皮内疫苗接种允许动物中更广泛的施用部位，为使用者提供增加的灵活性。这在接种大群猪时特别有用，因为它允许快速和非侵入性应用，对猪和施用者产生较小的压力。

P.Martelli等，Vet Microbiol.2014；168(2-4):357-64中描述了通过皮内施用商业灭活猪肺炎支原体全细胞疫苗(

MHYO ID ONCE-MSD Animal Health)诱导的全身和呼吸道局部免疫应答与通过肌内途径施用的两种商业疫苗和阴性对照的比较。

特别地，皮内施用的优点在于其可以通过无针疫苗接种装置进行，例如

接种器(可购自MSD Animal Health,Boxmeer,The Netherlands)。“皮内”施用本身不应等同于“无针”施用。只有当无针装置被“构造成用于皮内的疫苗接种”时，疫苗才确实被递送(至少部分地)到皮内。无针皮内施用比针头注射具有更小的侵入性，并且在动物体内产生更少的不良全身效应，并引起良好的免疫应答。它还降低了疫苗接种过程中猪之间的针头传播疾病的风险。

但是，提供适于皮内施用的安全有效的疫苗是困难的，因为疫苗的体积需要非常小，通常在约0.1至0.5ml的范围内。因此，免疫原以及疫苗的其它组分(例如可能的佐剂)需要非常浓缩，这增加了各种疫苗组分之间相互作用的风险。如上所述，组合来自PCV2和Mhyo的免疫原的疫苗是可商购的。然而，这些联合疫苗用于肌内施用，且不适合皮内施用。

发明目的

本发明的目的是提供一种适合皮内施用的对抗与PCV2和Mhyo感染相关的疾病的联合疫苗。具体而言，本发明的目的是提供一种可用于预防性治疗动物以对抗PCV2和Mhyo的感染的安全有效的疫苗。

发明内容

令人惊讶的是，发现通过设计特定的佐剂可以满足这些目的，然后可以克服现有技术的一个或多个缺点，所述佐剂能使得联合疫苗包含猪圆环病毒2型(PCV2)的非复制性免疫原和猪肺炎支原体(Mhyo)的非复制性免疫原，其中所述联合疫苗是包含角鲨烷、维生素E-醋酸酯和二氧化硅的水包油乳剂。

特别地，令人惊讶地发现包含PCV2的非复制性免疫原和Mhyo的非复制性免疫原的联合疫苗，其中所述联合疫苗是包含角鲨烷、维生素E-醋酸酯和二氧化硅的水包油型乳剂(即其中连续相是具有分散在其中的疏水液体的水相，不连续相，其中后者的相本身可具有分散在其中的第二相或另外的相)，该联合疫苗可用于通过皮内施用来安全的预防性治疗动物以对抗PCV2感染和Myho感染。

本发明还体现为佐剂组合物本身，特别是用于配制非活体疫苗的佐剂组合物，其中所述组合物是包含角鲨烷、维生素E-醋酸酯和二氧化硅的水包油乳剂。

定义

“联合疫苗”是包含来自多于一种微生物物种的免疫原的疫苗。根据本发明的联合疫苗至少包含来自猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体的免疫原。因此，根据本发明的联合疫苗可以通俗地称为“对抗”PCV2和Mhyo的疫苗。

“疫苗”通常称为药物组合物，其可安全施用于受试动物，例如猪，并且能够在该动物中诱导针对病原微生物的保护性免疫。疫苗通常包含免疫活性组分和药学上可接受的载体。“免疫活性组分”是一种或多种免疫原性分子，例如来自PCV2和Mhyo的非复制性免疫原。这些被靶标动物的免疫系统识别并诱导保护性免疫应答。

疫苗通常可例如通过减少病原体的数量、或缩短病原体在宿主动物中复制的持续时间有效降低感染的严重程度。此外，或可能作为其结果，疫苗通常有效地减轻或改善可能由这种感染或复制、或由动物对这种感染或复制的应答引起的疾病的(临床)症状。

病原体的“非复制性免疫原”是对应于病原体的任何物质或化合物，而不是作为整体的活的复制性病原体(野生型或减毒形式)，针对该病原体将引发免疫应答，使得相应的毒性病原体或其一种或多种毒力因子由于该免疫应答而被宿主的免疫系统识别并最终至少部分中和。非复制性免疫原的典型示例是被灭活的完整病原体(该术语包括裂解形式的这些病原体)和这些病原体的亚单位如衣壳蛋白、表面表达分子(例如重组表达蛋白或脂多糖)和分泌的分子，例如毒素。

针对病原体感染的“预防性治疗”通常有助于预防、改善或治愈由病原性病原体的治疗后攻击引起的病原体感染或由感染引起的病症，特别是在这种攻击后降低其在宿主中的负荷，并任选地有助于预防或改善由病原体的治疗后感染引起的一种或多种临床表现。

具体实施方式

在第一个实施方案中，本发明涉及包含PCV2的非复制性免疫原和Mhyo的非复制性免疫原的联合疫苗，其特征在于该联合疫苗是包含角鲨烷、维生素E-醋酸酯和二氧化硅的水包油乳剂。

根据本发明所述的联合疫苗中的每种“非复制性免疫原”可以是单一类型，或可以是多种类型，例如来自相应病原体的一种或多种毒株。对于本发明，PCV2的非复制性免疫原优选是灭活的完整PCV2病毒。甚至更优选地使用ORF2蛋白作为亚单位，其通常从重组表达系统获得，或通过复制子颗粒递送和表达。PCV2 ORF2可通过重组杆状病毒在昆虫细胞培养物中表达并收获。复制子颗粒是缺陷型病毒颗粒，例如由AlphaVax开发的α病毒颗粒。所表达的ORF2序列的亲代PCV2可以是任何PCV2血清型a、b、c或d，或者可以来自这些血清型的一种或多种的嵌合体。

猪肺炎支原体的非复制性免疫原典型地包括灭活的完整猪肺炎支原体，即灭活的Mhyo菌苗。Mhyo菌苗优选来自毒株11或毒株J。

“水包油乳剂”是一种乳剂，其中连续相是具有分散在其中的疏水液体的水相，不连续相，其中后者的相本身可具有分散在其中的第二相或另外的相。通过选择合适种类和浓度的乳化剂，可以形成这样的乳剂。用于制备用作疫苗的水包油乳剂的程序和设备是本领域众所周知的并且例如描述于课本中，例如：“雷明顿：药学的科学与实践(Remington:the science and practice of pharmacy)”(2000,Lippincot,USA,ISBN:683306472)，以及：“兽医疫苗学(Veterinary vaccinology)”(P.Pastoret等，ed.,1997,Elsevier,Amsterdam,ISBN 0444819681)。

在本发明中，外部水相可包含来自PCV2和Myho的非复制性免疫原和二氧化硅；并且油相可以包含角鲨烷和维生素E-醋酸酯。

当制备成水包油乳剂时，发现根据本发明的联合疫苗非常有效、安全且稳定。下面将描述用于制备用于根据本发明的联合疫苗的水包油乳剂的实施方案和优选方案。

“角鲨烷”是非矿物油，也称为氢化鲨肝油、六甲基二十烷或全氢鲨烯。这不能与角鲨烯(CAS nr.111-02-4)混淆，角鲨烯是多不饱和C30油并且作为胆固醇途径的化合物是可代谢的。然而，角鲨烷是角鲨烯的完全氢化形式，因此不易于氧化。因此，虽然角鲨烷可以从注射部位转运(因此它从注射部位“消失”)并因此有时被表示为“可代谢的”，但它实际上是惰性的、不可代谢的油(它仅被物理转运离开注射部位而不代谢)。

角鲨烷的前体最初是从鲨鱼肝脏获得的，但是出于环境考虑，已经转移到其它天然来源(例如橄榄油)或化学合成。因此，角鲨烷的定义中包括天然、合成或半合成形式或其混合物。多种纯度的角鲨烷可以商购获得，例如：蔬菜来源，来自Worlee(角鲨烷、蔬菜)，或Croda(Pripure角鲨烷)；或合成的，例如来自Kuraray(角鲨烷-PE)。对于本发明，高纯度的角鲨烷是优选的：优选超过75％的纯度，更优选超过80、90或甚至超过95％的纯度，以优选的顺序。

根据本发明的联合疫苗中角鲨烷通常以疫苗的1-15％w/v的量存在。更优选地，角鲨烷以疫苗的3-12％w/v、或甚至5-9％w/v的量存在，以优选的顺序，例如5％、6％、7％、8％或9％w/v。最优选的：角鲨烷以疫苗的约6.8％w/v的量存在。

因此，在根据本发明的联合疫苗的一个实施方案中，疫苗包含1-15％w/v的量的角鲨烷。

“维生素E-醋酸酯”是维生素E(生育酚)的醋酸酯，可衍生自植物原料，例如种子、坚果、果实或叶、或衍生自脂肪肉，但也可合成生产。一些替代名称是：醋酸生育酚、或醋酸α-生育酚。维生素E-醋酸酯的定义中包括天然、合成或半合成形式或其混合。具有不同纯度的维生素E-醋酸酯是可商购的。用于根据本发明的联合疫苗的维生素E-醋酸酯可以是DL-α-生育酚-醋酸酯，它是CAS号为7695-91-2的化学品的外消旋体。

根据本发明的联合疫苗中维生素E-醋酸酯通常以疫苗的2-20％w/v的量存在。更优选地，维生素E-醋酸酯以疫苗的4-16％w/v，或甚至6-10％w/v的量存在，以优选的顺序，例如6％、7％、8％、9％或10％w/v。最优选的：维生素E-醋酸酯以疫苗的约8％w/v的量存在。

因此，在根据本发明的联合疫苗的一个实施方案中，疫苗包含2-20％w/v的量的维生素E-醋酸酯。

“二氧化硅”是二氧化硅。二氧化硅被广泛地描述为用于佐剂组合物中，并且通常表示为医药级二氧化硅。所有医药级二氧化硅的共同点在于，它们是胶体二氧化硅并且已经在制药工业中使用了近50年。在这种类型的二氧化硅中，可获得不同的表面积、亲水性和疏水性(例如甲基化的)、结晶的或无定形的(例如气相二氧化硅)以及不同的造粒比，所有这些通常用于佐剂组合物中。优选的用于佐剂组合物中的二氧化硅类型的示例是无定形二氧化硅(当用于本发明时，其可以是亲水性的或疏水性的，但优选是亲水性的)。一种无定形二氧化硅的常见类型是气相二氧化硅，它也被称为热解二氧化硅，因为它是在火焰中产生的，它由熔合成支链的、链状的、三维次级粒子的无定形二氧化硅的微观液滴组成，然后聚集成三级颗粒。

用于本发明联合疫苗的二氧化硅可以具有100至700m²/克，更优选300至500m²/克，进一步更优选350至410m²/克，最优选约395±25m²/克的粒径。表面积可以通过本领域已知的方法测定，例如通过使用Brunauer的氮气吸附法计算(Brunauer,S.等，J.Am.Chem.Soc.,60,309(1938))。

这样的产品是可商购的，例如商品名为

或

(以该商品名可获得许多变体，例如不同表面积的、疏水和亲水的、晶体蛋白或无定形的)。一个示例是Evonik Resource Efficiency GmbH,Germany的

380，或Sigma-Aldrich的S5130，其粒径为约0.007μm，pH(4％分散体)为3.7至4.5，振实密度为约50g/l。

根据本发明的联合疫苗中二氧化硅通常以疫苗的0.02-2％w/v的量存在。更优选地，二氧化硅以疫苗的0.05-1.0％w/v，或甚至0.1-0.4％w/v的量存在，以优选的顺序，例如0.1％、0.2％、0.3％或0.4％w/v。最优选的：二氧化硅以疫苗的约0.2％w/v的量存在。

因此，在根据本发明的联合疫苗的一个实施方案中，疫苗包含0.02-2％w/v的量的二氧化硅。

本发明的联合疫苗通常含有药学上可接受的载体，优选为水。优选地，水具有高纯度，例如双蒸水、微滤水或反渗透水。更优选的：水是注射用水，是无菌的，基本上不含致热原。

基于水包油乳剂的疫苗的方便特征是免疫原通常在水相中。这意味着油相可以单独地在水中制备和乳化，使用的方法和技术与维持疫苗免疫原的质量或生存力不相容；例如在高温下使用高能乳化。这产生了用于本发明的油性乳液，其为角鲨烷、维生素E-醋酸酯和二氧化硅在水中的水包油乳剂。为了制备根据本发明的联合疫苗，通过在室温下温和混合，将含有免疫原和二氧化硅的水相和含有其它佐剂的油性乳剂组合。

两种组合物的组合导致它们各自的稀释。因此，每种组合物需要制备成中间组合物，其中各种组分的浓度比最终疫苗中的浓度高，其倍数等于应用的稀释度。通常，水相和油性乳剂可以以10：90和90：10中的任一体积比混合。

根据本发明的联合疫苗优选地包含水相和油性乳剂二者，如所描述的，其体积比在20：80和80：20之间。因此，在一个实施方案中，根据本发明的联合疫苗由体积比在20：80和80：20之间的水相和油性乳剂的混合物制备。优选地，体积比在30：70和70：30之间；在40：60和60：40之间；或者甚至体积比为约50：50，以优选的顺序。

显然，当水相和油性乳剂的组合比例为约50：50时，两种组合物中的每一种都应包含各种组分，其量或浓度比由两种中间组合物的组合制备的最终疫苗制剂中所需的量或浓度高两倍。

在一个优选的实施方案中，使用HLB值(亲水亲油平衡值)为8至20的乳化剂制备本发明的油性乳剂；优选的乳化剂是聚山梨醇酯80。

聚山梨酸酯80是指CAS号为9005-65-6的化学品，也称为：聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。它具有约15的HLB值，并且可广泛商购获得，例如作为Tween80。

优选地，聚山梨醇酯80以疫苗的0.5-10％w/v的量存在于根据本发明的联合疫苗中。更优选地，聚山梨醇酯80以疫苗的0.7-7％w/v、1.0-5％、或甚至2-4％w/v的量存在，按照优选的顺序。

最优选的：聚山梨酯80以疫苗的约3.2％w/v的量存在。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的联合疫苗包含0.5-10％w/v的量的聚山梨醇酯80。

本发明的油性乳液可以任何规模并使用任何合适的均化设备制备，例如由：Microfluidizer^TM、Silverson^TM、Ultra Turrax^TM、或Dispax反应器(IKA)。本领域技术人员可以进行和优化这样的乳化过程以控制分散相(在此：油佐剂)的颗粒的尺寸。与乳化剂的类型和浓度的选择一起，这控制了乳剂的药学性质及其稳定性。乳化过程本身的主要参数是：能量输入(功率和rpm)、温度、持续时间和重复循环次数。乳化过程的实施方案的细节如下所示。

分散相颗粒的尺寸优选非常小。当分散相的颗粒直径低于约1微米时，这种乳剂通常称为“亚微米乳剂”。在根据本发明的联合疫苗的水包油乳剂的一个实施方案中，乳剂是亚微米乳剂。

测量1微米或更小粒径的设备通常是可用的，例如通过激光衍射测量。通常，粒径以纳米(nm)表示，并且表示为平均粒径，也称为中值直径，表示为累积粒径分布的D50。

对于本发明，粒径以D50的nm表示，如使用

(Malvern Instruments)测定。可以在(浓缩的)油性乳剂或联合疫苗中进行粒径测量；本发明油相的颗粒折射率为1.48。Malvern Mastersizer尺寸分析报告将D50表示为D(0.50)。因此，在根据本发明的联合疫苗的亚微米水包油乳剂的实施方案中，油珠具有500nm或更小的D50；优选D50为250nm或更小。更优选：D50为150nm或更小。

有许多方法可用于生产这样的亚微米乳剂，通常通过使用高能乳化方法，例如使用：高压匀浆器、转子-定子装置、搅拌机、超声波、微孔膜或微通道装置。

用于本发明的高能乳化的优选方法是使用高压匀浆器，优选Microfluidizer^TM(Microfluidics)。典型地，在500至1500bar(即7000至22000psi)的压力下的3个通道将是足够的。以此方式制备的乳剂通常具有500nm或更小的D50的分散相颗粒，并且具有窄的粒径分布；对于本发明，分散相是油性佐剂的液滴。

通常，具有这种非常精细尺寸的分散相颗粒的乳剂是通过多个步骤制备的。以这种方式，通过低能混合制备初始的相对粗糙的油性乳剂，然后进行一次或多次随后的高能处理以实现粒径的进一步减小。接下来，然后将在水中包含佐剂和任选的乳化剂的“微流化”油乳剂与包含免疫原的水相组合，以制备根据本发明的联合疫苗。

出于产品一致性和质量的原因，不仅可以有利地监测和控制中值颗粒直径，而且可以有利地监测和控制粒径中的分布(也称为尺寸分布)。根据本发明的联合疫苗的亚微米水包油乳剂中油珠的尺寸分布优选地相对较窄。粒径分布的一个指标是累积粒径分布的D90。

因此，在根据本发明的联合疫苗的亚微米水包油乳剂的实施方案中，油珠具有低于900nm的D90，更优选D90低于500nm、400nm或甚至低于300nm，以优选的顺序。最优选的：D90为约150至250nm。

具有这种小粒径和分布的乳剂的优点之一在于，由于典型的消毒过滤器具有约0.2微米的孔径，因此可以通过过滤进行消毒，而没有材料的明显损失。这种过滤器灭菌克服了其他灭菌方法中可能损害油乳剂的组分的质量的需要，例如通过：加热、化学品或辐照。

因此，根据本发明的联合疫苗典型地包含来自PCV2和Mhyo的非复制性免疫原，其量能够在动物靶标中诱导针对它们相关疾病的保护性免疫应答，如上所述。

本发明的领域内技术人员将更能够确定根据本发明的联合疫苗的有效性，例如通过监测疫苗接种后或攻击感染后的免疫应答，例如通过监测靶标的疾病症状、临床评分或通过病原体的再分离，并将这些结果与在模拟接种的动物中观察到的疫苗接种-攻击应答进行比较。

作为指标，根据本发明的联合疫苗中使用的免疫原的量可以基于具有这些免疫原的单价或联合疫苗中分别使用的那些。例如，根据本发明的联合疫苗可以包含每毫升：1至150μg的PCV2的ORF2；和Mhyo：2-50％w/v灭活的浓缩的Mhyo培养物。定量这些免疫原的方法是本领域众所周知的，并且还可以依赖于针对特定标准的基于ELISA的定量。

根据本发明的联合疫苗可有利地与一种或多种复制或非复制、完整或破坏的其它抗原或免疫原组合。因此，在一个实施方案中，根据本发明的联合疫苗可以包含至少一种其他抗原或免疫原。

其他抗原或免疫原或者是对猪具有致病性的微生物的减毒形式，或者是来源于对猪具有致病性的微生物的非复制性抗原或免疫原。微生物可以是对猪具有致病性的任何病毒、细菌、寄生虫、真菌、立克次氏体、原生动物和/或寄生虫。对猪具有致病性的此类微生物的示例是：伪狂犬病病毒、猪细小病毒、典型的猪瘟病毒、猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道冠状病毒、水泡性口炎病毒、细胞内劳森菌、胸膜肺炎放线杆菌、短螺旋体、大肠杆菌、嗜血杆菌、链球菌、沙门氏菌、梭菌、巴斯德菌、丹毒丝菌、钩端螺旋体、博德特氏菌、弓形虫、等孢子球虫和旋毛虫。优选的其它抗原或免疫原是来自以下的一种或多种：细胞内劳森菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪痢疾短螺旋体和猪流感病毒。

观察到的根据本发明的联合疫苗的效果是：

对于Mhyo：预防或减少由Mhyo引起的肺损害，例如巩固性肺炎和慢性呼吸道疾病。对于Mhyo，疫苗效力的最可靠的测量是Mhyo攻击感染后肺损伤评分的降低。这种病变通常在尸检期间基于Goodwin量表(Goodwin等，1969,J.Hyg.Camb.,vol.67,p.465-476)通过肺实变的宏观评估进行评分；对于全部受影响的肺，该标度从零直至最高55点/动物。

对于PCV2：预防或减少消瘦或健康不良的临床症状，疾病特征性的肉眼和显微镜可见的病变的存在，以及显微镜可见的淋巴样病变中病毒抗原或DNA的存在。对于PCV2，疫苗效力的最可靠的测量是通过qPCR检测血清、粪便拭子材料、鼻拭子材料、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、扁桃体和肺中病毒核酸的存在。疫苗接种后针对PCV2的抗体的诱导与保护作用相关。

在一个优选的实施方案中，联合疫苗用于猪。术语“猪”是指家猪科的动物，优选指的是猪属(Sus)的动物，其也被称为猪(porcines)。示例是：野生的或家养的猪、猪、野猪、鹿豚或疣猪。这也包括以任意名称表示的猪，例如指它们的性别或年龄，例如：雌猪(sow)、母猪(queen)、未阉的公猪(boar)、阉公猪(barrow)、猪、小母猪、断奶仔猪或仔猪。此外，术语猪是指任何类型的猪类动物，例如育种型或育肥型，以及任何这些类型的亲本系。

如本文所述，根据本发明的联合疫苗可以不同的方式构成。

在一个实施方案中，根据本发明的联合疫苗作为即用型制剂提供，即作为疫苗中所有组分易于混合的制剂，使得联合疫苗可直接用于疫苗接种而无需任何进一步混合或重构步骤。

在一个可替代的实施方案中，根据本发明的联合疫苗可以由包含至少两个容器的部分的试剂盒生产：一个包含除Myho免疫原外的根据本发明的联合疫苗的所有组分的容器；和一个包含Myho免疫原的容器。PCV或Myho免疫原可以例如以冻干形式，或作为无菌悬浮液(例如水性悬浮液)提供。冻干形式可以是在容器(例如瓶)中的冻干饼，但也可以是在Sphereon^TM技术中应用的冻干球体(lyosphere)。

部分的试剂盒的元件一起体现了根据本发明的联合疫苗。至少两个容器的内容物可以在使用前(即在疫苗接种前)直接原位重构。在重构来自Mhyo的非复制性免疫原后，形成根据本发明的完整联合疫苗。这也称为“现场”混合疫苗，或“场侧”混合。

因此，在另一个方面，本发明涉及包含至少两个容器的部分的试剂盒：一个包含在含有角鲨烷、维生素E-醋酸酯和二氧化硅的水包油乳剂中的来自PCV2的非复制性免疫原的容器；以及一个包含来自Mhyo的非复制性免疫原的容器。

在一个可替代的实施方案中，PCV2和Mhyo的免疫原都可以提供于一个容器中，例如作为水溶液或分散体或冻干形式，可选地还包含二氧化硅，并且在使用前用含有o/w乳剂形式的(其它)佐剂的第二个容器的组分重构。

根据本发明的部分试剂盒及其元件可包含如本文所述的用于根据本发明的联合疫苗的任何实施方案(优选的或不优选的)，或根据本发明的联合疫苗的那些实施方案中的两种或多种的任何组合。

因此，在另一个方面，本发明涉及用于制备根据本发明的联合疫苗的方法，其包括以下步骤：

-制备包含来自PCV2和Mhyo的非复制性免疫原的水相，和

-将所述水相与包含角鲨烷、维生素E-醋酸酯和二氧化硅的油性乳剂混合以形成水包油乳剂。

在一个可替代的方面，本发明涉及用于制备根据本发明的联合疫苗的方法，其包括以下步骤：

-制备包含来自PCV2的非复制性免疫原的水相，

-将所述水相与包含角鲨烷、维生素E-醋酸酯和二氧化硅的油性乳剂混合以形成水包油乳剂，和

-将所述水包油乳剂与来自Mhyo的非复制性免疫原混合。

在另一个方面，本发明涉及用于制备根据本发明的联合疫苗的方法，其包括以下步骤：

-制备冻干形式的来自Mhyo的非复制性免疫原，

-制备包含来自PCV2的非复制性免疫原的水相，

-将所述水相与包含角鲨烯、维生素E-醋酸酯和二氧化硅的油性乳剂混合，和

-用所述水相和油性乳剂的混合物重构来自Mhyo的所述冷冻干燥的非复制性免疫原。

在另一个方面，本发明涉及用于制备根据本发明的联合疫苗的方法，其包括以下步骤：

-制备冻干形式的来自PCV的非复制性免疫原，

-制备包含来自Mhyo的非复制性免疫原和二氧化硅的水相，

-将所述水相与包含角鲨烷和维生素E-醋酸酯的油性乳剂混合，和

-用所述水相和油性乳剂的混合物重构来自PCV的所述冷冻干燥的非复制性免疫原。

在这些方法中的不同点处，可增加另外的步骤，例如用于另外的处理，例如用于纯化或储存。用于制备的方法也可包括与另外的抗原或免疫原，或药学上可接受的赋形剂(例如稳定剂或防腐剂)混合。

如上所述，可以通过根据本发明的方法制备的本发明的联合疫苗可有利地用于向猪皮内施用，以对抗PCV2和Mhyo感染和/或与PCV2和Mhyo感染相关的疾病。

因此，在另一个方面，本发明涉及包含角鲨烷、维生素E-醋酸酯、二氧化硅、来自PCV2和Mhyo的非复制性免疫原的水包油乳剂，其用于动物(例如猪)的皮肤中的疫苗接种以对抗PCV2和Mhyo。

在另一个方面，本发明涉及来自PCV2和Mhyo的非复制性免疫原在制备用于动物(例如猪)的联合疫苗中的用途，其特征在于所述疫苗是包含角鲨烷、维生素E-醋酸酯和二氧化硅的水包油乳剂。

根据本发明的联合疫苗可用于对抗PCV2和Mhyo的猪的疫苗接种。

因此，在另一个方面，本发明涉及用于通过向所述动物皮内施用包含角鲨烷、维生素E-醋酸酯、二氧化硅和来自PCV2和Mhyo的非复制性免疫原的水包油乳剂进行疫苗接种动物(例如猪)以对抗PCV2和Mhyo的方法。

或者，在一个类似的实施方案中：本发明涉及用于通过向所述动物皮内施用根据本发明的联合疫苗进行疫苗接种所述动物(例如猪)以对抗PCV2和Mhyo方法。

因此，根据本发明的联合疫苗通常施用至动物的皮肤中，即通过皮内施用来应用。这可以不同的方式实现，例如使用典型的注射器和皮下注射针。或者，肠胃外给药可以通过一些无针注射的方法进行，通过皮内涂药器(例如来自MSD Animal Health的

涂药器)递送疫苗。

为了适于皮内施用，根据本发明的联合疫苗的动物剂量的体积通常为每只动物0.05至1.0ml；优选0.1至0.5ml，更优选约0.2、0.3或0.4ml，最优选每只动物约0.2ml的剂量，以优选的顺序。

用于根据本发明的疫苗接种方法对目标猪的施用方案可以是单剂量或多剂量，或以与猪饲养业实践方面相容的方式。

当需要时，在之后的生活中，动物靶标可以被施用第二次或进一步施用根据本发明的联合疫苗，即所谓的加强疫苗接种。然而，根据本发明的联合疫苗以单次疫苗接种剂量通常将足以在动物的相关生命周期内(例如高达6月龄的猪的育肥期)提供免疫保护的方式优化。

因此，在一个优选的实施方案中，根据本发明的联合疫苗仅对每只动物靶标施用一次，即它是单剂量疫苗。

优选地，为了进一步降低动物的应激并降低劳动成本，用于疫苗接种的方法的方案被整合至靶标猪可能需要的其他疫苗的现有疫苗接种计划中。这些其他疫苗可以与其注册用途相容的方式同时、并行或按顺序施用。因此，在根据本发明的猪的疫苗接种的方法的一个实施方案中，根据本发明的联合疫苗与另一种猪疫苗联合施用。

在靶标动物是猪的情况下，用于本发明疫苗接种的靶标猪可以是它们对疫苗接种敏感和/或对疫苗所保护的疾病或感染敏感的任何年龄。因此，在根据本发明的猪的疫苗接种方法的一个实施方案中，根据本发明的联合疫苗被施用向幼猪，即约2月龄的猪。或者，根据本发明的联合疫苗被施用向成年猪，即约6月龄的猪。

由于Mhyo和PCV2的高患病率以及针对这些病原体中的一种或多种的疫苗的广泛使用，许多猪母猪对针对一种或多种Mhyo和PCV2的抗体将呈现血清阳性。因此，食用这种母猪初乳的幼猪可以是MDA+(母源抗体阳性)。这不妨碍根据本发明的联合疫苗的效力，因为它在MDA+猪中也是有效的。因此，在根据本发明的疫苗接种方法的一个实施方案中，根据本发明的联合疫苗被施用向MDA+猪。

根据本发明的联合疫苗的施用可以作为预防性治疗或治疗性处理、或两者进行应用，因为其干扰Mhyo和PCV2感染的建立和进展。根据本发明的联合疫苗的使用将有助于减少猪群、农场或地理区域的猪中Mhyo和PCV2之一或两者的感染。因此，在另一个方面，本发明涉及一种减少猪的Mhyo和PCV2感染或疾病相关症状的方法，其特征在于该方法包括向所述猪皮内施用根据本发明的联合疫苗。

现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

实施例1：联合疫苗的制备

根据本发明的联合疫苗按如下步骤制备：

根据以下后续工艺步骤制备2x浓度的该油性乳剂：

-称量所需量的维生素E-醋酸酯和角鲨烷，并在烧杯中混合。

-在室温下通过低能混合(磁力搅拌器)均化维生素E-醋酸酯/角鲨烷混合物，

-称量所需量的聚山梨酯80，并添加至均质化的维生素E-醋酸酯/角鲨烷混合物中，

-在室温下通过低能混合再次均化混合的混合物，

-通过0.2微米过滤器(Pall,Ultipor^TM N66)过滤灭菌均化的混合物，

-称量所需量的(热灭菌的)二氧化硅并添加至均化的混合物中，之后在室温下通过低能混合再次均化混合的混合物，

-将混合物加热至65-75℃，

-将注射用水(灭菌的)加热至65-75℃，

-通过装有N18棒的Ultra Turrax使用高能混合预混合加热的油相与水5-15分钟；温度从65℃降低至55℃，

-使预混合物在800bar下通过Microfluidizer^TM三次；用冷却螺旋将温度保持在低于50℃。

在最终的油性乳剂中，通过光学显微镜检查均化的完整性和水平。还检查了进一步的pH(7.34)和渗透压(221mOsm/kg)。粒径测量显示：D100＝300nm；D99＝250nm；D90＝200nm和D50＝130nm。

通过取所需量的每种非复制性免疫原制备水相(2x浓度)：Mhyo：6％v/v的10x浓缩灭活培养物和PCV：50μg ORF2。

接下来，在室温下通过低能量混合将两种浓缩组合物(具有佐剂的油性乳剂和具有免疫原的水相)以大约50:50体积比混合。

以下疫苗佐剂组合物使用上述程序制备为水包油(o/w)乳剂(所有百分比均为％w/v)。在制备油性乳剂时，向一些组合物中加入特定量的氢氧化铝(作为双重浓缩物)以及聚山梨酯80和角鲨烷：

表1

*磷酸盐缓冲盐水

实施例2：PCV2/Mhyo ID制剂在猪中对抗Mhyo攻击感染的功效

在无特定病原体(SPF)的小猪(ToJaPigs)中测试用Mhyo皮内(ID)制剂(0.2ml，用

在颈右侧接种)疫苗接种对抗Mhyo攻击的效力。制剂已通过Mhyo免疫原的各种处理制备，并被配制成5PCVU/ml(约25％w/v灭活Mhyo培养物)。根据以下方案(表2)在3周龄时接种动物。疫苗接种后四周，用Mhyo感染所有动物。在7周龄(即疫苗接种后4周)连续两天用10ml气管内Mhyo毒株98分别以10⁹和10⁹CCU/ml攻击所有动物。攻击后3周，处死动物，根据Goodwin(最大评分：55)对Mhyo诱导的巩固性肺炎的程度进行评分。

表2

*

PCV ID的专有佐剂(MSD Animal health)

结果：

通过肺损伤评分(LLS，平均)测定疫苗接种的效力，记录每只猪的肺损伤评分并与未接种的对照组比较。

表3

组	肺损伤评分(LLS)
		1	13.2
2	11.5
		3	15.4

与对照组相比，组1和2中测试获得的任何疫苗的肺损伤评分均未显著降低。相反，肺损伤评分与未接种的对照组相似。

因此，佐剂异体水凝胶、角鲨烷、维生素E-醋酸酯和二氧化硅的组合与PCV2和Mhyo的免疫原的组合以及作为佐剂的市售PCV菌苗

PCV ID和二氧化硅的组合均不适于安全有效的皮内施用。

实施例3：在PCV2/Mhyo ID制剂中重构的PRRS疫苗在猪体内的效力

本研究的目的是比较在5周龄小猪颈部皮内(ID)施用时用

PRRS重构的包含Aerosil200或Aerosil380的不同PCV2和/或Mhyo疫苗的安全性和血清学功效。将小猪分配到如下所示的处理组(表4)。在大约5周龄时皮内接种小猪。用Porcillis PRRS和如下所述的不同PCV2-Mhyo疫苗制剂中重构的10^4.5TCID₅₀病毒接种来自组4和5的小猪。

表4

-组4的小猪被皮内接种单剂量(0.2ml)用PCV2(10000AU/ml；约80μg/ml；)+M.Hyo(10PCVU/ml)和佐剂Aerosil200配制的疫苗。

-组5的小猪被皮内接种单剂量(0.2ml)用PCV2(10000AU/ml)+M.Hyo(10PCVU/ml)和佐剂Aerosil380配制的疫苗。

-组6的小猪被皮内接种单剂量(每只0.2ml)未混合的

PCV

PRRS疫苗。

-组7的小猪未接种疫苗(阴性对照组)。检查所有动物的注射部位反应。

疫苗接种后每天观察所有小猪的临床体征。量取温度并从所有动物收集血清样品。测试样品中针对PCV2、猪肺炎支原体和PRRSV的抗体。

结果：

疫苗接种后，所有组的体温相当。在疫苗接种当天，所有动物具有相当的PCV2抗体滴度。所有组中的PCV2抗体滴度保持在恒定水平直到研究结束。对照组7的抗体滴度随时间降低。在疫苗接种当天，所有动物的PRRS抗体均为阴性。以下所有组显示0-20％PRRS应答者。对照组7保持阴性。在研究开始时，所有动物的猪肺炎支原体均为血清阴性。所有组在SD21显示0-20％应答者。在SD28，大多数组显示阳性动物。对照组7显示无M猪肺炎支原体阳性反应。针对PCV2和Mhyo的IgM抗体应答结果(疫苗接种预测)如表5和6所示。

表5：疫苗接种后PCV2特异性IgM阳性动物的百分比

组	SD0	SD14	SD21
				4	0	80	40
5	20	50	80
				6	0	100	100
7	20	20	20

表6：疫苗接种后Mhyo血清抗体反应阳性动物的百分比

组	SD0	SD14	SD21	SD28
					4	0	0	20	20
5	0	0	0	10
					6	0	0	0	10
7	0	0	0	0

从本研究可以得出结论，接种组未显示可接受的针对PCV2或Mhyo的抗体应答。因此，当与

PRRS和PCV2以及Mhyo免疫原重构时，佐剂Aerosil A380和AerosilA200均不适于猪的安全有效的皮内施用。

实施例4：在MhyoID制剂中重构的PRRS疫苗在猪体内对抗Mhyo攻击感染的效力

在SPF小猪中测试用与PRRS(A212D，10^5.1TCID50/剂量)混合的Mhyo皮内(ID)制剂的疫苗接种对抗Mhyo攻击感染的效力。已经用各种佐剂制备了制剂。根据以下方案(表7)在3周龄时在颈部右侧接种ID(0.2ml)。疫苗接种后3周，用Mhyo感染所有动物。

表7：

所有动物在6周龄连续两天用10ml气管内Mhyo毒株98分别以9和8CCU感染。

结果：

通过肺损伤评分(LLS)测定疫苗接种的效力，记录每只猪的肺损伤评分并与未接种的对照组进行比较。

表8

可以看出，Mhyo和PRRS免疫原与作为佐剂组合物的氢氧化铝、角鲨烷和维生素E-醋酸酯的组合(如在对照组合物3中)的皮内施用显示出非常低的并且因此不可接受的肺损伤评分，即22％的降低相比于使用商业Mhyo疫苗的阳性对照组中的74％。因此，免疫原与佐剂氢氧化铝、角鲨烷和维生素E-醋酸酯的组合不适于安全有效的皮内施用。

实施例5：PCV2-Mhyo ID制剂在SPF猪中对抗Mhyo攻击感染的效力

根据以下方案(表9)在三周龄(+/-三天)对12只猪的组进行皮内接种，组17不进行接种并用作Mhyo攻击对照。疫苗接种后4周，用强毒Mhyo株感染所有动物。攻击后3周，对所有动物进行肺损伤尸检。在疫苗接种前、攻击前和尸检时采集血样。

表9

*Seppic的

ISA 28添加微流化维生素E醋酸酯

**Mhyo的阳性对照组

***未接种的对照组

实验步骤

血清学

在疫苗接种前(T＝0，3周龄)、攻击前(T＝4，7周龄)和尸检时(T＝7，10周龄)采集血样(颈静脉)。在环境温度下运输样品。从血样中得到血清，一式两份。在根据标准程序进行用于M.hyo和PCV的Elisa检测中测定所有血清样品中相关抗体的存在。

临床观察结果和直肠温度

在疫苗接种前、疫苗接种后4小时和1天和2天进行临床观察并测量直肠温度。记录观察结果和温度。

尸检

在本实验结束时，攻击后4周，通过电击昏使猪镇静，随后通过出血过多致死的方式处死。根据Goodwin对肺损伤进行评分。

结果：

未观察到不可接受的注射部位反应。未观察到不可接受的温度。

通过肺损伤评分(LLS)确定疫苗接种的效力，记录每只猪的肺损伤评分并与未接种的对照组进行比较。结果示于表10中：

表10

肺损伤评分的上述数据显示，组11、12(本发明组合物)和13(参比组合物2)给出了可接受的评分，因为与未接种的对照组(组17)相比降低超过45％(其用作显著效力的临界值)。相反，组14和15给出了不可接受的评分，因为组15的LLS甚至高于未接种的对照组，并且组14的LLS与阴性对照组相比仅略微降低20％。

因此，可以证明本发明的包含角鲨烷、维生素E-醋酸酯和二氧化硅的佐剂组合的疫苗组合物给出了表明有效的疫苗接种的可接受的肺损害评分。

实施例6：PCV2-Mhyo ID制剂在SPF猪中对抗PCV攻击感染的效力

将小猪分成5个处理组，每组10只小猪，当它们约3周龄时进行皮内接种。组1至3的小猪用下述疫苗接种。组4作为阳性对照组用

PCV ID和

Mhyo ID ONCE接种。组5未接种疫苗(阴性对照)。在疫苗接种后3周(6周龄)，所有动物采用鼻内施用(3ml/鼻孔)5.0log10 TCID50/mL野生型PCV2b攻击病毒株I12/11进行攻击。处理流程如下表11所示。攻击后3周，对所有动物进行尸检，并对腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、扁桃体和肺取样以检测PCV2。

疫苗接种后每天观察所有小猪的临床体征。在疫苗接种当天和在SD14、SD20、SD35和SD42(在尸检期间)收集血清样品。通过qPCR测试样品中针对PCV2病毒核酸的抗体。在SD20、35和SD41时从所有动物收集粪便拭子，并通过qPCR检测PCV2病毒核酸。

表11

*Seppic的

ISA 28添加未微流化矿物油

**Mhyo的阳性对照组

***未接种的对照组

处理

剂量和施用

在颈部右侧通过皮内途径(0.2ml)进行疫苗接种。组21在右侧接种两次。使用MAD涂药器通过鼻内途径进行攻击，6ml、3ml/鼻孔。

测试系统

仅使用健康动物。为了排除不健康的动物，在疫苗接种前检查它们(一般身体状况和没有临床异常或疾病)。在疫苗接种前，所有动物将用耳标单独编号。每天观察所有猪的疾病临床症状。观察结果将由全身反应组成，例如食欲不振、不愿移动、倾向躺下、精神萎靡或嗜睡、颤抖、发怒、水肿(尤其是眼睛周围)、呕吐和腹泻以及呼吸困难。

实验步骤

血液取样

在疫苗接种当天、攻击前一天、两周后和尸检当天从所有动物收集血样。每只动物最少取血4ml，最多取血8ml。根据标准程序所有猪单独进行。在不添加抗凝剂的情况下收集血样。

粪便拭子

攻击感染前一天、2wpc和尸检前一天取粪便拭子。将拭子放入含有抗生素的培养基中。

尸检

攻击后3周，将动物运送至尸检室。使用电刑装置麻醉它们并根据标准程序放血。根据标准程序解剖动物的尸体。尸检期间打开动物并原位检查内脏，特别注意以下器官：肺、腹股沟和肠系膜淋巴结、扁桃体、胸腺、脾脏、肝脏和肾脏。随后，取出来自扁桃体、肺、肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结的样品并分成两部分，一部分用于冷冻并通过PCV2 qPCR分析，一部分用于固定，随后进行(免疫)组织化学分析。

样品处理

从凝结的血液样品制备血清并填充等分试样(例如2×0.8ml)。样品未经热灭活。从拭子制备粪便样品并填充等分试样(例如2×0.8ml)。将样品储存于≤-15℃直至使用。取样和储存之间的时间不超过36(血清)或48(拭子)小时。

PCV2抗体ELISA

根据标准程序测试血清的针对PCV2抗体。简言之，在涂有杆状病毒表达的PCV2ORF2抗原的微量滴定板上孵育连续稀释的血清样品。除去血清后，用固定量的生物素标记的PCV2特异性单克隆抗体(MoAb)孵育所有孔。然后用过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白孵育结合的MoAb，随后进行发色检测。滴度被定义为内插血清稀释度的倒数，其具有等于测试的50％最大消光的消光值。结果表示为log₂滴度。低于2.0log₂的滴度被认为是阴性的。对于阴性样本，出于计算目的使用1.0log₂值。

定量PCR

根据标准程序对所有血清、粪便拭子以及对扁桃体、肺、肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结的10％组织匀浆进行PCV2核酸的定量PCR(qPCR)。简言之，使用市售试剂盒从样品中提取DNA。使用对PCV2-ORF2特异的引物和探针，通过聚合酶链式反应(PCR)定量每个样品中的PCV2基因组DNA。特异性荧光超过阈值的循环数与包含已知量的含PCV2-ORF2的质粒的一组样品的循环数相关。结果表示为提取的DNA的log₁₀拷贝/μl(log₁₀c/μl)。低于1.00log₁₀c/μl的值被认为是阴性的，出于计算目的将其视为0.00log₁₀c/μl。

免疫组织学(IHC)

制备扁桃体和淋巴结样品用于组织学检查。将样品固定在10％福尔马林中，石蜡包埋，并进行免疫组织化学以检测载玻片上的PCV2抗原。根据制造商的说明书，抗PCV2兔血清用作一抗，Envision+(DAKO,Denmark)用作检测系统。用苏木精复染载玻片。进行显微镜检查。对于扁桃体和淋巴结，特征性棕色染色按如下顺序评分：

0未观察到特异性阳性染色细胞

1分散的(单个)阳性染色细胞存在于(少于)10％的淋巴结中

2 10-50％的淋巴结中观察到阳性染色(单个)细胞，或在<10％的淋巴结中>15的阳性染色细胞的病灶聚集。

3>50％的淋巴结中的特异性染色

将结果记录为总分，即各组织的评分总合。

结果：

PCV2血清学：

在SD1开始测量时，所有组的log2滴度在4和5之间。阳性对照(组21)在SD34和SD41之间给出10的log2滴度。在同一周，组18、19和20的log2滴度在8和10之间。未接种的阴性对照组22导致log2滴度低于4。

血清(qPCR血清)中的PCV2病毒载量

在SD0(开始测量)和SD19之间，在所有组中未检测到病毒载量(log10c/μl＝0)。

在SD34时，阳性对照(组21)中的病毒载量增加至约1.0log10c/μl，并在SD41时进一步增加至约1.6。

在SD34时，未接种的阴性对照(组22)中的病毒载量增加至约4.1log10c/μl，并在SD41时略微降低至约3.6。

组18、19和20中的病毒载量在SD34时在1.3和1.8log10c/μl之间，在SD41时在1.6和2.1之间。

粪便拭子(qPCR粪便拭子)中的PCV2病毒载量

SD19(开始测量)时，所有组均未检测到病毒载量(log10c/μl＝0)。

在SD34时，阳性对照(组21)中的病毒载量增加至约1.5log10c/μl，并在SD41时进一步增加至约2.2。

未接种的阴性对照(组22)中的病毒载量在SD34时增加至约3.6log10c/μl，并基本保持恒定直至SD41。

组18、19和20中的病毒载量在阳性对照组的范围内(SD34时在约1.5和1.8之间，SD41时在约1.8和2.2之间)。

安全性

未观察到不可接受的注射部位反应。在T＝0+4h时，最大平均温度增加为0.4℃。因此，可以证明本发明包含角鲨烷、维生素E-醋酸酯和二氧化硅的佐剂组合的疫苗组合物，在疫苗接种效力方面给出了可接受的结果，且不引起不可接受的部位反应。

实施例7：不同医药级二氧化硅在制备联合疫苗中的应用

在本实施例中，各种不同类型的二氧化硅，所有医药级(胶体)无定形二氧化硅显示可用于制备根据本发明的联合疫苗。用于制备疫苗的方法大部分与实施例1一致，尽管对于一些疫苗，二氧化硅仅在通过Microfluidizer^TM后加入。这对最终组合物没有实质性影响，所有二氧化硅粗略地分布在平均粒径为约120nm的最终组合物中。然而，当在通过Microfluidizer^TM之后添加二氧化硅时，极小百分比的二氧化硅总体积以大于10μM(高达200μM)的大团聚体(固体颗粒)形式存在。但是，这对疫苗的性能没有负面影响。各种组合物的数据在表12中给出。

表12

适用于本发明的其它二氧化硅是

和

结论

实施例1-7表明，在所测试的组合物中，只有角鲨烷、维生素E-醋酸酯和二氧化硅的新型佐剂组合在对抗PCV2和Mhyo感染的疫苗接种效力方面给出了可接受的结果，且不引起不可接受的部位反应。因此，使用该佐剂组合物，可以使用猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体的非复制性免疫原提供用于安全且有效的皮内施用的对抗PCV2和Mhyo的联合疫苗。

Claims (14)

1.一种包含猪圆环病毒2型的非复制性免疫原和猪肺炎支原体的非复制性免疫原的联合疫苗，其特征在于所述联合疫苗是包含角鲨烷、维生素E-醋酸酯和二氧化硅的水包油乳剂。

2.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于它包含1-15％w/v的角鲨烷。

3.根据权利要求1或2所述的联合疫苗，其特征在于它包含2-20％w/v的维生素E-醋酸酯。

4.根据前述权利要求中任一项所述的联合疫苗，其特征在于它包含HLB值为8-20的乳化剂。

5.根据权利要求4所述的联合疫苗，其特征在于所述乳化剂是聚山梨醇酯80。

6.根据权利要求4或5所述的联合疫苗，其特征在于所述乳化剂以0.5-10％w/v的量存在。

7.根据前述权利要求中任一项所述的联合疫苗，其特征在于它包含0.02-2％w/v的二氧化硅。

8.根据前述权利要求中任一项所述的联合疫苗，其特征在于猪圆环病毒2型的非复制性免疫原是由猪圆环病毒2型的ORF2基因编码的重组表达蛋白。

9.根据前述权利要求中任一项所述的联合疫苗，其特征在于猪肺炎支原体的非复制性免疫原包含灭活的完整猪肺炎支原体。

10.根据前述权利要求中任一项所述的联合疫苗用于预防性治疗动物以对抗猪圆环病毒2型感染和猪肺炎支原体感染的用法，其特征在于将所述联合疫苗施用至所述动物的皮内。

11.根据权利要求10所述使用的联合疫苗，其中施用至动物的皮内的联合疫苗的体积为0.1-0.5ml。

12.猪圆环病毒2型的非复制性免疫原和猪肺炎支原体的非复制性免疫原用于制备用于预防性治疗动物以对抗猪圆环病毒2型感染和猪肺炎支原体感染的根据权利要求1至9中任一项所述的联合疫苗的用途，其特征在于将所述联合疫苗施用至动物的皮内。

13.一种通过向动物的皮内施用根据权利要求1至9中任一项所述的联合疫苗来预防性治疗动物以对抗猪圆环病毒2型感染和猪肺炎支原体感染的方法。

14.一种用于配制无活性疫苗的佐剂组合物，其特征在于所述组合物是包含角鲨烷、维生素E-醋酸酯和二氧化硅的水包油乳剂。