RU2403062C1 - Вакцина против болезни ауески и рожи свиней - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. Вакцина содержит активное вещество и целевые добавки. В качестве активного вещества вакцина содержит инактивированную вирусную суспензию штамма вируса болезни Ауески «К-1» (ГКВ №2450), семейства Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesvirinae, Ауески с активностью не менее 10^7,5 ТЦД₅₀ 1 см³ вакцины и инактивированную суспензию клеток бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae производственных штаммов М-2, 1933, 1893, взятых в смеси в равном соотношении с концентрацией не менее 2 млрд. микробных клеток в 1 см³ вакцины. Вакцина превосходит известные вакцины по спектру специфической защиты и эффективности действия для восприимчивой группы животных, длительности напряженного иммунитета, безвредности для супоросных свиноматок и новорожденных поросят, по стабильности сохранения биологических свойств, в т.ч. антигенной и иммуногенной активности на протяжении 18 месяцев (срок наблюдения). 2 з.п. ф-лы, 6 табл.

Description

Изобретение относится к области вирусологии, биотехнологии и ветеринарии и касается создания новых вакцин, которые могут быть использованы для предупреждения наиболее распространенных инфекционных болезней свиней - болезни Ауески и рожи свиней.

У свиней болезнь Ауески (БА) протекает остро и характеризуется признаками поражения головного и спинного мозга, без признаков зуда, особенно тяжело болеют поросята-сосуны и отъемыши, летальность достигает 70-100%. У новорожденных поросят БА протекает в септической форме, такие поросята, как правило, погибают. У взрослых свиней и подсвинков старше 5 месяцев БА протекает с признаками пневмонии, признаки поражения ЦНС наблюдаются редко, у супоросных свиноматок могут быть аборты. Болезнь Ауески вызывает герпесвирус свиней 1 типа.

Рожа свиней - инфекционная болезнь, характеризующаяся при остром течении септицемией, гиперемией паренхиматозных органов и воспалительной эритемой кожи, при подостром - «крапивницей», при хроническом - эндокардитом и артритами. Наиболее восприимчивы поросята 3-12 месяцев. Возбудитель - Erysipelothrix rhusiopathiae.

Данные возбудители широко распространены на территории России и других стран мира, могут поражать другие виды сельскохозяйственных животных и птицу, к возбудителю рожи свиней восприимчив человек. Оба заболевания протекают в виде энзоотии и причиняют значительный экономический ущерб промышленному свиноводству.

Известна маркированная вирусвакцина против болезни, содержащая вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gE штамма "ВК" вируса болезни Ауески и защитную среду (Патент RU 2242247, А61К 39/245, опубл. 20.12.2004).

Недостатками известной маркированной вакцины является ограниченность спектра действия, т.к. она направлена против одного вида возбудителей, а также наличие в вакцине живого антигена и загрязнение окружающей среды.

Известна вирусвакцина против болезни Ауески, содержащая вирусную суспензию вакцинного штамма МК-25 вируса болезни Ауески, выращенного в перевиваемых культурах клеток почки поросенка или почки сибирского горного козерога, и стабилизирующую среду на основе пептона и лактозы. Активность вакцины 10^6,75-10^7,75 ТЦД₅₀/см³. (Патент RU 2138289, А61К 39/245, опубл. 27.09.1999).

Недостатком вирус-вакцины является ограниченность спектра действия в отношении иммунологической защиты, наличие в вакцине живого антигена, возможность реверсии вакцинного штамма в вирулентное состояние, загрязнение окружающей среды.

Известна ассоциированная вакцина против болезни Ауески и чумы свиней, включающая вируссодержащую суспензию из штамма вируса болезни Ауески "ГНКИ" и вируссодержащую суспензию из штамма вируса чумы свиней "К". В качестве стабилизатора вакцина содержит смесь желатины, сахарозы и фосфатного буфера (Патент RU 1545615, А61К 39/295, опубл. 10.07.1996).

Недостатком вакцины является наличие в вакцине живых антигенов, возможность реверсии вакцинных штаммов в вирулентное состояние, загрязнение окружающей среды, ограничение вакцины по спектру использования. В связи с указанными недостатками вакцина не нашла широкого практического применения.

Кроме того, применение живых вакцин, содержащих не инактивированные антигены герпесвируса свиней 1 типа, может привести к гомологичной рекомбинации вакцинного и полевого штаммов вируса, ведущей к обострению инфекций, абортам и даже гибели животных.

Известна вакцина против рожи свиней из штамма ВР-2 живая сухая, которая содержит живую культуру Erysipelothrix rhusiopathiae вакцинного штамма ВР-2 и сахарозо-пептон-желатиновую среду (Патент RU 2085211, А61К 39/02, опубл. 27.07.1997).

Однако известная вакцина против рожи свиней малоэффективна, поскольку продолжительность иммунитета после применения не превышает 3-4 месяцев. Кроме того, вакцина предназначена для иммунизации только против одной инфекции, ее невозможно использовать в сложной эпизоотической ситуации, когда необходимо в минимально короткие сроки создать иммунитет одновременно к нескольким возбудителям инфекций.

Известна также живая вакцина против рожи свиней, содержащая культуры аттенуированного штамма Erysipelothrix insidiosa BP-2 и аттенуированного штамма ВГНКИ-6/24, стабилизатор на основе сахарозы, желатина и агара (Патент RU 2018322, А61К 39/02, опубл. 30.08.1994).

Известна концентрированная гидроокисьалюминиевая формол-вакцина против рожи свиней, содержащая адсорбированную гидратом окиси алюминия и обработанную формалином концентрированную смесь нескольких штаммов культуры рожи свиней (Ветеринарные препараты. Справочник под ред. Д.Ф.Осидзе, М., 1981, с.271-273).

Недостатком вакцины является небольшой срок годности, а также создание иммунитета только к одной инфекции, невозможность использовать вакцину в сложной эпизоотической ситуации, когда необходимо в минимально короткие сроки создать иммунитет одновременно к нескольким возбудителям инфекций. Кроме того, вакцина вызывает осложнения, особенно у свиней хорошей упитанности, при однообразном типе кормления и содержании в плохо вентилируемых помещениях, без прогулок, что ограничивает ее применение.

Наиболее близким аналогом является вакцина против болезни Ауески и рожи свиней, содержащая инактивированные антигены вируса болезни Ауески, бактерий Erysipelothrix insidiosa серовара 2А и масляный адъювант или гидрат окиси алюминия (Наставление по применению вакцины против болезни Ауески и рожи свиней, утвержденное Департаментом ветеринарии 30.03.2007 г.).

Недостатком известной комбинированной вакцины является недостаточная специфическая активность и иммуногенность.

Задачей изобретения является разработка безопасной вакцины, содержащей сбалансированные в антигенном и иммуногенном отношении вирусные и бактериальные антигены, которая позволит создать напряженный иммунитет против наиболее значимых возбудителей инфекционных болезней свиней и обеспечить таким образом сохранность молодняка и продуктивность взрослых животных.

Еще одной задачей является получение нового производственного штамма вируса БА, обладающего широким антигенным спектром, высокой антигенной и иммуногенной активностью не только в нативном виде, но и после инактивации, стабильно сохраняющего свои свойства и пригодного для создания инактивированных вакцин различной валентности.

Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала поливалентных вакцин против инфекционных болезней свиней, а также в повышении стабильности, антигенной и иммуногенной активности вакцины и создании напряженного и длительного иммунитета у привитых животных и новорожденных поросят против болезни Ауески и рожи свиней.

Технический результат изобретения достигается за счет использования в составе вакцины нового производственного штамма вируса болезни Ауески с широким антигенным спектром, а также за счет создания синергетической композиции вакцины при объединении нового производственного штамма вируса с известными вакцинными штаммами рожи свиней.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Предлагаемая инактивированная вакцина против болезни Ауески и рожи свиней, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличается тем, что в качестве активного вещества она содержит инактивированную суспензию штамма вируса болезни Ауески «К-1» (ГКВ №2450), семейства Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesvirinae, инактивированную суспензию клеток бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae производственных штаммов М-2, 1933, 1893, в эффективном количестве.

Термин «эффективное количество» означает количество активного вещества, которое при введении свиньям и/или поросятам обеспечивает индукцию специфического иммунного ответа достаточного уровня в организме животных с последующим предупреждением от заболевания и симптомов заболевания, подлежащих профилактике.

Входящий в состав вакцины штамм вируса болезни Ауески «К-1», семейства Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesvirinae является новым производственным штаммом и впервые используется в составе вакцинных препаратов.

Термин «производственный штамм» означает вакцинный штамм, изученный по своим биологическим свойствам, стабильный при хранении и пересевах, безвредный после инактивирования или аттенуирования для животного, хорошо адаптированный к системе культивирования, обладающий высокой антигенной и иммуногенной активностью как для чувствительной лабораторной модели, так и для естественно восприимчивых животных, а также характеризующийся широким антигенным спектром, доминирующим над эпизоотическими штаммами возбудителя.

Производственный штамм вируса болезни Ауески «К-1» депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2450 и характеризуется следующими признаками и свойствами.

Источник происхождения:

Штамм «К-1» происходит из штамма «К» (АрмНИИжив, 1979 г.) и получен путем его адаптации к клеткам почки сирийского хомячка (линия ВНК-21) в 2007 г. Штамм прошел 55 пассажей в культуре клеток ВНК-21.

Морфологические свойства

Штамм «К-1» относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae. При электронном микроскопическом исследовании методом негативного контрастирования вируссодержащего культурального материала обнаружены вирионы, характерные для вируса болезни Ауески, размером 120-150 нм и состоящие из капсида кубической симметрии и покрывающей его внешней оболочки. Капсид имеет 162 призматических полых капсомера. Нуклеокапсид формируется внутри ядра, где образуются включения типа А.

Антигенные свойства

Штамм «К-1» проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.

Введение морским свинкам штамма «К-1» вируса БА ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам вируса БА (табл.1).

Табл.1
Перекрестная антигенная активность штамма «К-1» вируса БА
Штамм/изолят вируса БА для РН	Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом «К-1»вируса БА*, М±m
«К-1»	194,0±26,4
К	59,7±0,8
Изолят №568	48,5±9,8
Изолят №245	52,0±12,1
- здесь и далее в таблицах приведены обратные значения титра антител

Биотехнологические характеристики

Штамм «К-1» хорошо размножается в первичных и перевиваемых культурах клеток (почки, тестикулы), полученных из тканей и органов свиней (плодов). В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 10^8,0-10^9,0 ТЦД₅₀/см³.

Рекомендуемый способ хранения: в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С.

Периодичность освежения: один раз в три года в перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ (далее - культура клеток СПЭВ).

Дополнительные сведения о штамме

Штамм «К-1» не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью референс-сыворотки.

Реактогенность - штамм «К-1» реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток СПЭВ в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

В составе вакцины против болезни Ауески и рожи свиней инактивированная вирусная суспензия штамма «К-1» содержится с титром инфекционной активности не менее 10^7,5 ТЦД₅₀ в 1 см³ вакцины.

Инактивацию вирусной суспензии осуществляют любым известным способом, например путем добавления формалина или димера этиленимина (ДЭИ).

Используемые для изготовления рожистого компонента вакцины штаммы Е. rhusiopathiae известны и используются в различных сочетаниях при изготовлении вакцин и сывороток против рожи свиней (см. например, RU 2169582, Yolande M. Bishop. The veterinary formulary. British Veterinary Association - 2005, p.466). Однако было установлено, что при объединении известных штаммов Е. rhusiopathiae с новым производственным штаммом вируса БА в предлагаемой по изобретению комбинации наблюдается образование синергетической композиции, проявляемой в увеличении напряженности и длительности иммунитета к вирусному и рожистому компонентам вакцины.

В составе предлагаемой вакцины инактивированные суспензии клеток бактерий Е. rhusiopathiae производственных штаммов М-2, 1933 и 1893 содержатся в равных соотношениях с конечной концентрацией не менее 2 млрд микробных клеток в 1 см³ вакцины.

Инактивацию суспензий клеток Е. rhusiopathiae осуществляют любым известным способом, например путем добавления формалина, содержащего не менее 37% формальдегида.

Согласно изобретения вакцина также содержит одну или более приемлемую в ветеринарии целевую добавку.

Термин "целевая добавка" означает любые приемлемые в ветеринарии фармацевтические компоненты, которые традиционно используются для обеспечения сохранности антигенов в процессе технологической переработки, приготовления конечной рецептурной формы или последующего хранения и тому подобное.

В качестве целевой добавки вакцина может содержать растворитель, адъювант, солюбилизирующий агент, разбавитель, консервант, стабилизатор, антибактериальное и противогрибковое средства, изотонический агент, агент, задерживающий всасывание и тому подобное. Разбавители могут включать дистиллированную воду, физиологический раствор, солевой раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Изотонические агенты могут включать, наряду с другими, хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают альбумин, сахарозу, желатозу, обезжиренное молоко и т.д.

Адъюванты включают вещества, неспецифически усиливающие иммунный ответ к антигенам, и могут быть минерального происхождения - гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия, алюминиево-калиевые квасцы; растительного происхождения - сапонин (Квил-А); адъюванты на основе минеральных и неминеральных масел; синтетический адъювант - мурамилдипептид и др.

В качестве целевой добавки предлагаемая вакцина преимущественно содержит адъювант, например гидрат окиси алюминия, смесь гидрата окиси алюминия с сапонином или адъювант на основе минерального масла.

При необходимости в качестве целевой добавки предлагаемая вакцина может содержать консервант мертиолят натрия в количестве 1:10000.

Хотя специалист в данной области может легко определить количество и концентрацию адъювантов и добавок, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к композициям, включающим предпочтительно от 20 до 60 об.% адьюванта в зависимости от его вида.

Эмульгированная вакцина в предпочтительном варианте содержит минеральное масло в количестве 60 об.%.

Сорбированная (гидроокисьалюминиевая) вакцина в предпочтительном варианте содержит 6%-ный гель гидрата окиси алюминия в количестве 20 об.% и сапонин в количестве 0,05 об.%, что соответствует 12 г гидрата окиси алюминия и 500 мг сапонина в 1 л вакцины.

Нижеследующие примеры рецептур являются чисто иллюстративными и не ограничивают рамки настоящего изобретения.

Вакцина против болезни Ауески и рожи свиней эмульгированная представляет собой сметанообразную эмульсию белого цвета, иногда с желтоватым оттенком; при длительном хранении возможно незначительное расслоение, которое при встряхивании переходит в гомогенную эмульсию.

Вакцина против болезни Ауески и рожи свиней сорбированная (гидроокисьалюминиевая) представляет собой жидкость розового цвета, при хранении образуется рыхлый осадок, легко разбивающийся в гомогенную взвесь при встряхивании.

Вакцина стабильна и сохраняет исходную активность при температуре 2-10°С не менее 18 месяцев (срок наблюдения).

С целью профилактики болезни Ауески и рожи свиней полученную вакцину вводят однократно внутримышечно животным старше 4 месяцев в дозе 2 см³, поросятам в возрасте от 45 дней до 4-х месяцев - в дозе 1 см. Животных, вакцинированных до 4 месяцев, ревакцинируют через 6 месяцев в дозе 2 см³. Свиноматок вакцинируют за 1,5-2 месяца до опороса.

Вакцина апробирована на свинопоголовье в неблагополучных хозяйствах. Эта апробация подтверждает безвредность препарата и его противоэпизоотическую эффективность, проявляемую в усилении иммунизирующей активности компонентов вакцины. Вакцинация повышает иммунитет у матерей и защищает потомство в период эмбрионального развития и в постнатальный период. При этом индуцируемый иммунный ответ характеризовался высокой специфичностью по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах.

Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Получение вакцины против болезни Ауески и рожи свиней.

Вакцину готовят из нового производственного штамма вируса БА «К-1» (ГКВ №2450) (вирусный компонент) и известных вакцинных штаммов Е. rhusiopathiae (штамм М-2, штамм 1933, штамм 1893) (рожистый компонент).

Технологический процесс состоит из следующих основных стадий: стадии получения вирусного компонента, стадии получения рожистого компонента, инактивации компонентов, добавления адъюванта к каждому из компонентов и объединения вирусного и рожистого компонентов (для сорбированной вакцины) или объединения вирусного и рожистого компонентов с последующим добавлением масляного адъюванта к полученной смеси (для эмульгированной вакцины), с последующей расфасовкой готового продукта.

А. Стадия получения вирусного компонента вакцины.

Изготовление вирусного компонента вакцины включает этап получения вирусной суспензии из посевного материала штамма вируса болезни Ауески «К-1»; определения инфекционной активности вирусной суспензии, инактивацию вируссодержащей культуральной жидкости штамма.

Стадия получения вирусной суспензии согласно изобретению основывается на системе посевных материалов (seed lot system), при которой последовательные серии продукции получают из главного посевного материала (master seed lot) при определенном количестве пересевов (пассажей). В текущем производстве рабочий посевной материал (working seed lot) готовится из главного посевного материала. Готовый продукт производят из рабочего посевного материала, при этом число пересевов из главного посевного материала не должно превышать значения, установленного при клинических испытаниях вакцин, исходя из требований безопасности и эффективности.

Процесс получения системы посевных материалов производственного штамма вируса включает несколько этапов:

- приготовление культуры клеток;

- проведение пассажей вируса;

- получение вирусной суспензии;

- промежуточный контроль штамма вируса;

- лиофилизация, замораживание или инактивация штамма вируса;

- контроль штамма вируса.

Штамм вируса болезни Ауески «К-1» выращивают в перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ.

Накопление вирусов в культуре клеток оценивают по цитопатическому эффекту. Титр вирусов вычисляют по методу Рида и Менча и выражают в lg ТЦД₅₀/см³.

При достижении титра вируса до значений 10^8,0-10^9,0 ТЦД₅₀/см³ полученный вируссодержащий материал производственного штамма вируса очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.

Далее вирусную суспензию инактивируют раствором формалина, содержащим не менее 37% формальдегида. Полноту инактивации оценивают по отсутствию размножения вирусов в чувствительной культуре клеток в течение четырех пассажей.

Б. Стадия получения рожистого компонента вакцины.

Производственные штаммы М-2, 1933, 1893 культуры Е. rhusiopathiae выращивают раздельно на бульоне Хоттингера при 35-36°С в течение 18- 24 ч до накопления каждого штамма не менее 10 млрд микробных клеток в 1 см³.

Далее полученные культуры объединят в равных соотношениях добавляют формалин до концентрации 0,3%. Полученную смесь инактивированных суспензий клеток концентрируют ультрафильтрацией до получения бакмассы с содержанием 40 млрд микробных клеток в 1 см³ и более.

В. Стадия приготовления готового препарата вакцины.

Вакцину по изобретению получают путем объединения вирусного и рожистого компонентов вакцины и последующего добавления целевых добавок.

Изготавливают 5 опытных серий (вариантов) вакцины.

Вариант 1.

К инактивированной вирусной суспензии, приготовленной на стадии А, добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 20% от общего объема, затем добавляют сапонин в концентрации 500 мг/л и консервант мертиолят натрия в концентрации 1:10000, тщательно перемешивают.

К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов Е. rhusiopathiae, приготовленной на стадии Б, добавляют физиологический раствор, мертиолят натрия в концентрации 1:10000 в качестве консерванта, затем смешивают с 6%-ным ГОА (20% от общего объема), тщательно перемешивают.

Смешивают вирусный и рожистый компоненты препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусного антигена в готовой вакцине составила не менее 7,5 lg ТЦД₅₀, клеток возбудителя рожи свиней - не менее 2 млрд микробных клеток в 1 см³.

Вариант 2.

К инактивированной вирусной суспензии, приготовленной на стадии А, добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 20% от общего объема, тщательно перемешивают.

К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов Е. rhusiopathiae, приготовленной на стадии Б, добавляют физиологический раствор, добавляют 6%-ный гель ГОА (20% от общего объема), тщательно перемешивают.

Смешивают вирусный и рожистый компоненты препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусного антигена в готовой вакцине составила не менее 7,5 lg ТЦД₅₀, клеток возбудителя рожи свиней - не менее 2 млрд микробных клеток в 1 см³.

Вариант 3.

К инактивированной вирусной суспензии, приготовленной на стадии А, добавляют 6%-ный гель ГОА в количестве 30% от общего объема, добавляют сапонин в концентрации 500 мг/л и консервант мертиолят натрия в концентрации 1:10000, тщательно перемешивают.

К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов Е. rhusiopathiae, приготовленной на стадии Б, добавляют физиологический раствор, мертиолят натрия в концентрации 1:10000 в качестве консерванта, затем смешивают с 6%-ным ГОА (30% от общего объема), тщательно перемешивают.

Смешивают вирусный и рожистый компоненты препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусного антигена в готовой вакцине составила не менее 7,5 lg ТЦД₅₀, клеток возбудителя рожи свиней - не менее 2 млрд микробных клеток в 1 см³.

Вариант 4.

Инактивированную вирусную суспензию, приготовленную на стадии А, с инфекционной активностью 8,0-8,5 lg ТЦД₅₀/см³, смешивают с инактивированной бактериальной суспензией клеток смеси штаммов Е. rhusiopathiae, приготовленной на стадии Б и имеющей концентрацию 50 млрд микробных клеток/см³, предварительно разбавленной физиологическим раствором в соотношении 1:1, тщательно перемешивают.

Смешивают вирусный и рожистый компоненты препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусного антигена в готовой вакцине составила не менее 7,5 lg ТЦД₅₀, клеток возбудителя рожи свиней - не менее 2 млрд микробных клеток в 1 см³.

К приготовленной смеси добавляют 60 об.% масляного адъюванта и тщательно перемешивают при помощи диспергирующей машины, например PROCESS-PILOT 2000/4 (10000 rpm), до получения гомогенной эмульсии.

Вариант 5.

Инактивированную вирусную суспензию, приготовленную на стадии А с инфекционной активностью 8,5-9,0 lg ТЦД₅₀/см³, смешивают с инактивированной бактериальной суспензией клеток смеси штаммов Е. rhusiopathiae, приготовленной на стадии Б и имеющей концентрацию 200 млрд микробных клеток/см³, предварительно разбавленной физиологическим раствором в соотношении 1:4, добавляют мертиолят натрия в концентрации 1:10000 в качестве консерванта, тщательно перемешивают.

Смешивают вирусный и рожистый компоненты препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусного антигена в готовой вакцине составила не менее 7,5 lg ТЦД₅₀, клеток возбудителя рожи свиней - не менее 2 млрд микробных клеток в 1 см³.

К приготовленной смеси добавляют 60 об.% масляного адъюванта и тщательно перемешивают при помощи диспергирующей машины, например PROCESS-PILOT 2000/4 (10000 rpm), до получения гомогенной эмульсии.

Полученные варианты инактивированной вакцины против болезни Ауески и рожи свиней имеют компонентный состав, приведенный в табл.2.

Табл.2
Композиционный состав вакцины против болезни Ауески и рожи свиней
Ингредиент	Активность или концентрация	Содержание ингредиентов, об.%
		Вариант 1	Вариант 2	Вариант 3	Вариант 4	Вариант 5
Вирус БА	8,0-8,5 lg ТЦД50/см3	-	-	50,0	-	-
	8,5-9,0 lg ТЦД50/см3	40,0	40,0	-	30,0	35,0
Суспензия клеток штаммов Erysipelothrix rhusiopathiae	200 млрд м.кл./см3	1,0	-	1,0	-	1,0
	40 млрд м.кл./см3	-	5,0	-	5,0	-
Физиологический раствор	-	38,94	35,0	18,94	5,0	3.99
ГОА (6%-й гель)	-	20,0	20,0	30,0	-	-
Сапонин	-	0,05	-	0,05	-	-
Масляный адъювант	-	-	-		60,0	60,0
Мертиолят натрия	-	0,01	-	0,01	-	0,01

Пример 2. Оценка антигенной и иммуногенной активности вакцины на экспериментальных моделях.

Для определения антигенной активности вакцины по изобретению в качестве экспериментальной модели используют лабораторных животных, при этом для оценки антигенной активности вирусного компонента вакцины используют морских свинок массой 350-400 г, а иммуногенной активности рожистого компонента - белых мышей массой 16-18 г.

Формируют группы по 10 животных в каждой: 5 опытных групп и 1 контрольную (морские свинки), 5 опытных групп и 1 контрольную (белые мыши).

Морских свинок опытных групп иммунизируют пятью вариантами исследуемой вакцины, приготовленными по примеру 1, в дозе 1,0 см, белых мышей - в дозе 0,2 см³. При этом вакцину вводят морским свинкам внутримышечно, белым мышам - подкожно. Животных контрольных групп не иммунизируют.

На 21 сутки после инъекции вакцины у морских свинок всех групп берут кровь и отделяют сыворотку, которую затем исследуют на наличие специфических антител.

Антигенную активность вирусного компонента вакцины оценивают по уровню специфических антител к вирусу БА. Титр антител определяют в реакции нейтрализации (РН), которую проводят в 96-луночных планшетах по стандартной методике методом двукратных разведении испытуемой сыворотки против рабочей дозы каждого вируса 100 ТЦД₅₀/ лунка.

Вируснейтрализующий титр исследуемой сыворотки выражают как предельное ее разведение, ингибирующее развитие ЦПД вируса в 50% зараженных культур клеток.

Иммуногенную активность рожистого компонента вакцины оценивают путем заражения вакцинированных и контрольных (невакцинированных) белых мышей возбудителем рожи свиней контрольного штамма 149 в дозе 10 LD₅₀.

Результаты исследования, представленные в табл.3, свидетельствуют о том, что по антигенной активности вакцина против болезни Ауески и рожи свиней превосходит существующие аналоги. Так, предлагаемая вакцина (все варианты) уже через 21 сутки после иммунизации обеспечивает выработку специфических антител к вирусу БА в высоком титре - 1:79,8 и выше.

Морские свинки контрольной группы на протяжении всего опыта были серонегативны к вирусу БА. Иммуногенная активность препарата в отношении рожистого компонента составляла не менее 90%, при этом белые мыши в контрольной группе все погибли.

Табл.3
Антигенная и иммуногенная активность вакцины против болезни Ауески и рожи свиней на экспериментальных моделях
Вариант вакцины, приготовленный по примеру 1	Титр антител к вирусу БА в сыворотке крови морских свинок, M±m	Иммуногенная активность вакцины к рожистому компоненту, % выживших б/м
I	79,8±9,3	100
II	157,6±18,2	90
III	119,4±15,2	90
IV	137,2±14,3	100
V	168,9±16,4	100
Контроль	0	0

Пример 3. Оценка стабильности вакцины в процессе хранения.

Испытание стабильности вакцины, полученной по примеру 1, проводят на экспериментальных животных - морских свинках и белых мышах. При этом для оценки стабильности антигенной активности вирусного компонента вакцины используют морских свинок, иммуногенной активности рожистого компонента - белых мышей.

Для этого вакцину вводят через 6, 12 и 18 мес хранения при температуре 4°С однократно: морским свинкам в дозе 1,0 см³, белым мышам - в дозе 0,2 см³. При этом вакцину вводят морским свинкам внутримышечно, белым мышам - подкожно. Животных контрольных групп не иммунизируют.

На 21 сутки после инъекции вакцины у морских свинок всех групп берут кровь и отделяют сыворотку, которую затем исследуют на наличие специфических антител.

Стабильность вирусного компонента вакцины оценивают в РН по отсутствию снижения титра антител ниже установленного уровня (1:16) при хранении вакцины при +4°С в течение 18 месяцев.

Иммуногенную активность рожистого компонента вакцины оценивают путем заражения вакцинированных и контрольных (невакцинированных) белых мышей возбудителем рожи свиней контрольного штамма 149 в дозе 10 LD₅₀.

Результаты испытания представлены в табл.4 и 5.

Табл.4
Изменение активности вакцины против болезни Ауески и рожи свиней, эмульгированной в процессе хранения
Активность препарата	Время хранения
	При изгот.	6 мес	12 мес	18 мес
Антигенная активность в отношении ВБА, титр ВНА	168,9±22,5	157,6±18,2	104,0±16,8	90,5±11,9
Иммуногенная активность в отношении рожи, % выживших мышей	100	100	90	90

Табл.5
Изменение активности вакцины против болезни Ауески и рожи свиней сорбированной (гидроокисьалюминиевой) в процессе хранения
Активность препарата	Время хранения
	При изгот.	6 мес	12 мес	18 мес
Антигенная активность в отношении ВБА, титр ВНА	157,6±18,2	111,4±17,4	97,0±12,3	78,8±10,5
Иммуногенная активность в отношении рожи, % выживших мышей	100	100	80	90

Пример 4. Производственное испытание экспериментальных серий вакцины против болезни Ауески рожи свиней в опытах на свиньях.

Испытание проводят на поросятах 3-месячного возраста в хозяйствах, неблагополучных по болезни Ауески и роже свиней.

При этом животных делят на 2 группы: опытную и контрольную с равным количеством животных в каждой группе.

Животным опытной группы вакцину, полученную по примеру 1, вводят однократно внутримышечно в дозе 1,0 см³.

В контрольной группе животных не вакцинируют.

Для определения напряженности и продолжительности иммунитета у всех животных берут кровь до вакцинации и через 2, 4, 6 и 8 месяцев после вакцинации.

Эффективность вакцинации оценивают в отношении вируса болезни Ауески по уровню вируснейтрализующих антител в сыворотке крови вакцинированных свиней, а к рожистому компоненту в остром опыте - по количеству выживших свиней, зараженных 10 LD₅₀ вирулентного штамма E. rhusiopathiae.

Результаты испытаний представлены в табл.6.

Табл.6
Оценка активности вакцины против болезни Ауески и рожи свиней в опыте на свиньях
Сроки исследований	Антигенная активность вакцины к вирусу БА, титр антител в сыворотке крови	Иммуногенная активность вакцины к рожистому компоненту в остром опыте
		Заражено, голов	Пало, голов	Клинические признаки рожи, голов
Опытная группа
До вакцинации	42,2±10,1	5	0	0
2 мес п/вакц.	207,9±25,4	5	0	0
4 мес п/вакц.	103,9±21,6	5	0	0
6 мес п/вакц.	45,3±12,3	5	0	1
8 мес п/вакц.	24,5±10,7	5	1	1
Контрольная группа
-	55,7±10,8	5	4	5

Результаты исследования показывают, что иммунизация свиней вакциной по изобретению вызывает формирование выраженного иммунного ответа ко всем антигенам, входящим в состав вакцины, продолжительностью не менее 6 месяцев.

Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют, что вакцина против болезни Ауески и рожи свиней в соответствии с изобретением имеет определяющее преимущество перед другими известными вакцинами по спектру специфической защиты и эффективности действия для восприимчивой группы животных, длительности напряженного иммунитета, безвредности, стабильности сохранения биологических свойств, в т.ч. антигенной и иммуногенной активности на протяжении 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Вакцина экологически безопасна, не вызывает диссеминации патогенных агентов во внешнюю среду.

Claims (3)

1. Вакцина против болезни Ауески и рожи свиней, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит инактивированную вирусную суспензию штамма вируса болезни Ауески «К-1» (ГКВ №2450), семейства Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesvirinae, Ауески с активностью не менее 10^7,5 ТЦД₅₀ 1 см³ вакцины, и инактивированную суспензию клеток бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae производственных штаммов М-2, 1933, 1893, взятых в смеси в равном соотношении с концентрацией не менее 2 млрд. микробных клеток в 1 см³ вакцины.

2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве целевой добавки она содержит адъювант.

3. Вакцина по п.2, отличающаяся тем, что в качестве адьюванта она содержит гидроокись алюминия, сапонин и гидроокись алюминия или масляный адъювант.