KR101281361B1 - 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 및 이를 포함하는 혼합백신 조성물 - Google Patents

북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 및 이를 포함하는 혼합백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명의 백신 조성물은 최근 국내에서 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스로 인한 감염을 효과적으로 예방할 수 있다. 구체적으로 생식기 질병 예방으로 임신 모돈에서 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 의한 유산, 사산, 및 조산을 예방한다. 또한 호흡기 질병 예방으로 7-70일령의 자돈에서는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 의한 호흡기 질병을 예방한다.

Description

북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 및 이를 포함하는 혼합백신 조성물{Vaccine composition for North American Porcine reproductive and respiratory syndrome virus and mixed vaccine comprising thereof}
본 발명은 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물로서, 보다 상세하게는 신규한 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 동정하고, 이를 약독화 또는 사독화시켜 제조된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 및 이를 포함하는 혼합백신 조성물에 관한 것이다.
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus; PRRSV)는 새끼를 낳는 어미 돼지인 모돈에서 임신 중기에 유산 또는 사산을 유발하고, 어린 새끼 돼지인 자돈에서는 폐렴을 유발하는 바이러스성 질병이다. 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 유전형(genotype)은 크게 유렵형(European)과 북미형(North American)으로 나뉘어져 있다.
상기 유럽형과 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 가장 큰 차이점은 면역학적으로 교차반응(cross reaction)을 하지 않는다는 점이다. 다시 설명하면, 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 감염이 되어서 돼지 체내에서 형성된 항체의 경우 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스와 반응을 하지 않는다. 또한 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 감염이 되어서 돼지 체내에서 형성된 항체의 경우 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스와 반응을 하지 않는다. 따라서 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 감염을 예방하기 위해서는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 이용하여 제작한 백신이 필요하고, 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 감염을 예방하기 위해서는 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 이용하여 제작한 백신이 필요한 것이다. 한편 한국공개특허 제2008-4325호에서는 PRRS 백신으로서의 돼지 생식기 호흡기 증후군바이러스 융합 단백질을 개시하고 있으나 이 경우 교차반응에는 한계가 있었다.
한편, 최근 국내에서 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 변종으로 인한 감염이 문제되고 있다. 상기 북미형 변종의 경우 유럽형보다는 북미형에 가까우나, 국내에서 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 사용되는 백신이 상기 북미형 변종 바이러스에 대하여 교차반응이 쉽게 발생하지 않아 국내에는 적합한 백신이 전무한 실정이다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 해결하려는 과제는 국내에서 발생하는 신규한 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 동정하고, 이를 약독화 또는 사독화시켜 제조된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 및 이를 포함하는 혼합백신을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11956BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에서 유래하며, 이를 약독화 또는 사독화시켜 유효성분으로 함유하는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 기탁번호 KCTC 11956BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스는 서열번호 1로 표시되는 ORF5(오픈 리딩 프레임) 및 서열번호 2로 표시되는 ORF7(오픈 리딩 프레임)을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11956BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 계대배양하여 이를 약독화 또는 사독화하는 단계를 포함하는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11957BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 제공한다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 변이주는 서열번호 3으로 표시되는 ORF5(오픈 리딩 프레임) 및 서열번호 4로 표시되는 ORF7(오픈 리딩 프레임)을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 변이주는 생균 또는 사균일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상술한 변이주를 유효성분으로 함유하는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11956BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 서열번호 1로 표시되는 ORF5(오픈 리딩 프레임)과 95% 이상 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가지는 ORF5(오픈 리딩 프레임) 및 서열번호 2로 표시되는 ORF7(오픈 리딩 프레임)과 95% 이상 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가지는 ORF7(오픈 리딩 프레임)을 포함하는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 포함하는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 두번째 과제를 달성하기 위하여, 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11956BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 및 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11954BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에서 유래하며, 이들을 약독화 또는 사독화시켜 유효성분으로 함유하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 혼합백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11957BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주 및 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11955BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 유효성분으로 혼합한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 혼합백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 사용된 용어를 설명한다.
용어,"생독 백신"은 살아있는 바이러스 활성 성분을 포함하는 백신을 의미한다. 용어, "약독화(attenuation)"란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 바이러스의 약독화는 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 바이러스 서열의 특정 결실 또는 바이러스 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다.
용어, "사독 백신"은 불활화 백신 또는 사균 백신이라고도 하며, 죽은 바이러스를 포함한 백신이다. 이의 예로는 전 바이러스 백신(whole-virus vaccine)과 분할 백신(split vaccine)이 있으며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 제조가능하다. 예컨대 전 바이러스 백신은 바이러스 전체에 포르말린을 처리하여 제조할 수 있으며, 분할 백신은 바이러스에 에테르를 처리하여 외피만을 분쇄, 수득하여 제조할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 최근 국내에서 북미형 변종 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스로 인한 감염을 효과적으로 예방할 수 있다. 구체적으로 생식기 질병 예방으로 임신 모돈에서 북미형 변종 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 의한 유산, 사산, 및 조산을 예방한다. 또한 호흡기 질병 예방으로 7-70일령의 자돈에서는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 의한 간질성 폐렴 등 호흡기 질병과 임파절에서 염증을 예방하여 면역억제 효과를 예방한다.
혼합백신의 경우 국내에서 다양한 형태(북미형 및 한국형) 돼지 생시기 호흡기 증후군 바이러스에 감염된 임신 모돈에서 유발되는 유산, 사산, 및 조산을 예방한다. 또한 호흡기 질병 예방으로 7-70일령의 자돈에서 국내에서 다양한 형태(북미형 및 한국형) 돼지 생시기 호흡기 증후군 바이러스에 감염된 자돈에서 간질성 폐렴 등 호흡기 질병 예방과 임파절에서 염증을 예방하여 면역억제 효과를 예방한다. 특히 혼합백신의 경우 국내 농장에서 2가지 유전형(북미형과 한국형)의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스가 동시에 감염되었을 때에는 하나의 유전형의 바이러스에 감염되었을때 보다 모돈에서의 유산, 사산, 및 조산 등의 임상증상이 더욱 심하게 나타나는데 이런 경우 혼합형 백신이 가장 효과적으로 질병을 예방 할수 있다. 또한 호흡기 질병에서도 7-70일령의 자돈에서 2가지 유전형(북미형과 한국형)의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스가 동시에 감염되었을 때에는 하나의 유전형의 바이러스에 감염되었을때 보다 호흡곤란 및 간질성 폐렴 등의 임상증상이 더욱 심하게 나타나는데 이런 셩우 혼합형 백신이 가장 효과적으로 질병을 예방 할 수 있다. 따라서 혼합형 백신의 또다른 장점은 유전형을 고려하여 백신을 선택하지 않아도 되는 편리성이 가지고 있다.
도 1은 본 발명의 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 ORF5 염기서열이다.
도 2는 본 발명의 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 ORF7 염기서열이다.
도 3은 본 발명의 약독화된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 ORF5 염기서열이다.
도 4는 본 발명의 약독화된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 ORF7 염기서열이다.
도 5는 음성대조군 돼지의 정상적인 폐장을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 6은 약독화된 백신접종군 돼지의 정상적인 폐장을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 7은 양성대조군 돼지의 심한 간질성 폐렴 병변을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 8은 음성대조군 돼지의 정상적인 폐장을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 9는 사독백신접종군 돼지의 정상적인 폐장을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 10은 양성대조군 돼지의 심한 간질성 폐렴 병변을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 11은 음성대조군 돼지의 정상적인 폐장을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 12는 양성대조군1 돼지의 심한 간질성 폐렴 병변을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 13은 혼합백신접종군1 돼지의 정상적인 폐장을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 14는 음성대조군 돼지의 정상적인 폐장을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 15는 양성대조군1 돼지의 심한 간질성 폐렴 병변을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 16은 혼합사독백신접종군1 돼지의 정상적인 폐장을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 17은 베링거 북미형 백신접종군1 돼지의 중정도의 간질성 폐렴 병변을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 18은 베링거 북미형 백신접종군2 돼지의 중정도의 간질성 폐렴 병변을 나타내는 광학현미경 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 최근 국내에서 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 변종으로 인한 감염이 문제되고 있다. 상기 북미형 변종의 경우 유럽형보다는 북미형에 가까우나, 국내에서 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 사용되는 백신이 상기 북미형 변종 바이러스에 대하여 교차반응이 쉽게 발생하지 않아 북미형 변종 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 예방이 어려운 문제가 있었다.
이에 본 발명에서는 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11956BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에서 유래하며, 이를 약독화 또는 사독화시켜 유효성분으로 함유하는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물을 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 최근 국내에서 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스로 인한 감염을 효과적으로 예방할 수 있다.
구체적으로 본 발명자들은 신규한 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 동정하고 이를 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11956BP로 기탁하였다. 도 1은 기탁번호 KCTC 11956BP 바이러스의 ORF5(오픈 리딩 프레임)의 염기서열(서열번호 1)이고, 도 2는 ORF7(오픈 리딩 프레임)의 염기서열(서열번호 2)이다.
그 뒤 동정된 바이러스를 계대배양을 통해 약독화하거나 약독화 이후 사독화를 수행하여 백신 조성물에 적합한 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 제작하고 이를 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11957BP로 기탁하였다. 한편, 도 3은 기탁번호 KCTC 11957BP의 ORF5(오픈 리딩 프레임)의 염기서열(서열번호 3)이고, 도 4는 ORF7(오픈 리딩 프레임)의 염기서열(서열번호 4)로서 붉은색 부분은 원 바이러스인 기탁번호 KCTC 11956BP의 ORF5 및 ORF7과 상이한 부분으로서 이 중 -로 표시한 부분은 결실된 부분을 나타낸 것이다.
그 결과 계대배양한 KCTC 11957BP 변이주는 원 바이러스인 기탁번호 KCTC 11956BP의 ORF5과는 99%의 상동성을 가지고 ORF7과는 99%의 상동성을 가지는 것을 확인하였다.
한편, 질병 원인 바이러스인 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 약독화 또는 사독화는 통상적인 방법으로 시행될 수 있다. 즉, 항원(원인 바이러스)을 포름알데히드, 포르말린, 파라포름알데히드, 베타-프로피올락톤, 에틸렌이민 또는 이의 유도체와 같은 화학제에 노출시키거나 열, 방사선 조사 등의 방법으로 사독할 수 있다. 약독화는 질병 원인균의 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 균주의 염기서열의 특정 결실 또는 균주의 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다.
한편, 본 발명의 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 약독화 또는 사독화시켜 제조한 변이주(기탁번호 KCTC 11957BP)를 포함하는 백신조성물은 생식기 질병 예방으로 임신 모돈에서 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 의한 유산, 사산, 및 조산을 예방한다. 또한 호흡기 질병 예방으로 7-70일령의 자돈에서는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 의한 호흡기 질병을 예방한다.
그러므로 바람직하게는 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11956BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 서열번호 1로 표시되는 ORF5(오픈 리딩 프레임)과 95% 이상 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가지는 ORF5(오픈 리딩 프레임) 및 서열번호 2로 표시되는 ORF7(오픈 리딩 프레임)과 95% 이상 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가지는 ORF7(오픈 리딩 프레임)을 포함하는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 포함하는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물은 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 예방하는데 효과적이다.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11956BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 및 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11954BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에서 유래하며, 이들을 약독화 또는 사독화시켜 유효성분으로 함유하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 혼합백신 조성물을 제공한다.
상기 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11954BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스는 본 발명자가 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁한 바이러스로서, 이에 대한 한국특허출원 제10-2011-0071054 호는 본 발명에 삽입된다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일구현예에 따르면, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11957BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주 및 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11955BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 유효성분으로 혼합한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 혼합백신 조성물을 제공한다.
혼합백신의 제조방법은 통상의 약독화 또는 사독화된 바이러스의 혼합백신의 제조방법을 적용할 수 있으며, 바람직하게는 1000 rpm으로 회전하는 혼합기(shaking machine)에 1시간 동안 회전과 진동을 동반한 방법에 의하여 혼합하여 제조할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에는 상술한 약독화 또는 사독화 항원 이외에 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 여기서 약제학적으로 허용 가능한 담체는 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않고, 화학적으로 불활성이며, 투여되는 피험체에게 독성이 아닌 담체 매질을 의미한다. 각종 담체들이 당 기술분야에 공지되어 있으며, 증류수, 염수 또는 미네랄수가 포함될 수 있다.
또한 본 발명의 조성물에는 약제학적 또는 수의학적으로 허용될 수 있는 하나 이상의 보존제를 포함할 수 있다. 예를 들어 EDTA염, 메티올레이트 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에 당업자에게 공지된 기술에 따라 아쥬번트를 첨가할 수 있다. 아쥬번트의 예로는 수산화알루미늄과 같은 광물겔, 리조레시틴과 같은 계면활성제, 사포닌이나 사포닌 유도체와 같은 글리코시드, 란티딘, Avridine, 카보폴(carbopol), 폴리포스파젠, DDA(dimethyldioctadecylammonium bromide), 퀼 에이(quil A), 암피겐, 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 제약기술 분야 및 수의학 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 표준기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 백신의 함량은 의학기술분야 및 수의학 기술분야의 당업자들이 투여 대상 개체의 연령, 성별, 체중, 종족 및 상태와 같은 인자 및 투여 경로를 고려하여 결정할 수 있다. 이 조성물은 단독으로 투여하거나 또는 다른 면역학적 항원 또는 백신 조성물 또는 치료제 조성물과 함께 투여하거나 후속투여를 할 수 있다.
본 발명의 백신이 사용될 수 있는 제형의 예로는 구강, 비강, 항문, 질, 위 내 투여용의 현탁액, 시럽 등과 같은 액상 제제 및 피하, 내피, 근육 내, 또는 정맥 내 투여용의 멸균 현탁 또는 에멀션제제를 포함할 수 있다. 또한 사용 전에 약제학적으로 허용 가능한 희석제에 재현탁되는 가용성 성분 또는 미립자의 고체 제제일 수 있다. 가용성 성분 또는 미립자는 코아세르베이션, 바이아세르베이션, 응고, 분무건조, 기포건조, 침전, 동결건조 등 약제학 분야 및 수의학 분야의 당업자에게 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다.
상기 백신은 수의학적으로 허용되는 다양한 경로를 통해 돼지에 투여될 수 있다. 예를 들어, 근육주사 또는 피내주사 등으로 투여될 수 있다. 투여경로에 따라 수의학 분야의 당업자들이 투여량을 결정할 수 있다. 예컨대 모돈의 경우 2㎖를, 자돈의 경우 1㎖를 접종할 수 있으며 1차 접종 후으로 면역이 완전히 형성되어 2차 접종이 필요 없는 장점이 있다.
이때, 양돈 농장에서 북미형과 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 의한 모돈에서 유산, 사산, 및 조산 등의 생식기 문제를 유발되는 농장의 경우 모돈에게 분만후 2-3주가 경과된 시점에서 백신을 직접 접종한다. 북미형과 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 의한 돼지 생식기 호흡기 증후군이 7일령에서 18일령의 어린 포유자돈 시기에 유발되는 경우, 어린 포유자돈에 백신을 직접 접종할 시간적 여유가 없으므로, 임신한 모돈에게 상기 백신을 접종하여 모돈에서 형성된 항체가 초유를 통하여 포유자돈에게 이행되게 하여, 북미형과 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 의한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스을 예방할 수 있다.
그리고, 3주령 이상의 이유자돈이나 육성돈에서 돼지 생식기 호흡기 증후군이 유발되는 경우에는 포유자돈, 이유자돈, 또는 육성돈에 직접 백신을 접종하여 이를 예방할 수 있다.
이하, 본 발명을 바람직한 실시예 및 실험예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 설명하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 북미형 변종 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 동정
서울대학교 수의과 대학 병리학 교실에 진단을 위하여 의뢰(의뢰번호 : 090690)된 50일령의 이유자돈(생돈)의 폐장에서 분리하여 KNA090690분리주로 명명하였다. 분리주 KNA090690(KCTC 11956BP) 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 open reading frame (ORF) 5 (서열번호 1, 도 1)와 ORF7(서열번호 2, 도 2)을 분석하였다.
분리주 KNA090690의 특성을 구체적으로 확인하기 위하여 국내에서 분리한 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스인 KEU090450(KCTC 11954BP ), 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스인 Lelystad virus(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore; GenBank accession number EF536003), 베링거 잉겔하임에서 사용한 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스인 VR-2332(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore; GenBank accession number M90262)에 대한 ORF5 (open reading frame 5)와 ORF7 (open reading frame 7)에 대한 아미노산 염기 배열 순서의 유사성을 비교하여 그 결과를 표 1 및 표 2에 나타내었다.
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스간의 ORF5의 아미노산 염기 배열 유사성
KEU090450
KNA090690
VR2332
(북미형)
Lelystad
(유럽형)
KEU090450
100 68 68 88
KNA090690
(북미형)
68 100 89 65
VR2332
(북미형)
68 89 100 68
Lelystad
(유렵형)
88 65 68 100
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스간의 ORF7의 아미노산 염기 배열 유사성
KEU090450
KNA090690
VR2332
(북미형)
Lelystad
(유렵형)
KEU090450
100 67 69 92
KNA090690
(북미형)
67 100 96 68
VR2332
(북미형)
69 96 100 67
Lelystad
(유렵형)
92 68 67 100
상기 표 1 및 표 2를 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 KNA090690 분리주는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 중 북미형에 비교적 유사하기는 하지만 북미형과는 또 다른 염기서열의 특징을 보여주는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 KNA090690 분리주를 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11956BP로 기탁하였다.
<실시예 2> 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 약독화 백신(생독백신)의 제조
Marc-145 세포주에 처음 배양 할 때에는 5% FBS (fetal bovine serum)가 함유된 DMEM이라는 배지를 사용한다. 그후 Marc-145 세포주가 단층(monolayer)을 형성하게 되면 2.5% FBS가 함유된 DMEM으로 바꾼 후에 실시예 1의 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종할 때 까지 Marc-145 세포주를 단층(monolayer)으로 유지하였다.
실시예 1에서 분리된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 Marc-145 세포주에 접종한 후에 세포주가 변성이 되면서 형성되는 cytopathic effect (CPE)가 전체 Marc-145 세포주의 75% 정도 유발되면 -70℃에 얼려 보관하였다. 그 후 바이러스가 감염된 Marc-145 세포주를 배양하고 있는 플라스크를 냉동과 녹임 과정인 “freezing and thawing” 한 후 5000g에서 15분간 원심한 후 상층액을 거름종이를 이용하여 일차로 걸러주었다. 걸러준 상층액을 0.8μm syringe filter로 여과한 후, 여과액을 다시 0.45μm syringe filter로 여과한다. 그후 이 여과액을 단층이 형성되어 있는 Marc-145 세포주에 접종을 하고 일주일 간 세포를 관찰한다. 그 후 다시 세포주가 바이러스 감염에 의하여 변성이 되면서 형성되는 cytopathic effect (CPE)가 전체 Marc-145 세포주의 75% 정도 유발되면 상기 과정을 반복하여 다시 새로운 Marc-145 세포주에 접종한다. 이러한 계대방법을 100회 반복하여, 야외 분리된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 약독화하여 생독 백신주로 사용하고 이를 기탁번호 KCTC 11957BP로 기탁하였다.
상기 원 바이러스인 기탁번호 KCTC 11956BP와 이를 계대배양을 통해 약독화한 바이러스인 기탁번호 KCTC 11957BP의 open reading frame 5(도 3, 서열번호 3) 와 ORF7(도 4, 서열번호 4) 를 분석하였다. 원래 분리된 바이러스와 약독화된 바이러스를 비교하면 ORF5의 경우 99%의 동질성(homology)을 가지고 있으며 ORF7의 경우에는 원래 분리된 바이러스와 약독화된 바이러스에서 99%의 동질성(homology)을 가지고 있는 것이 확인되었다 (도 1 ~ 4 및 서열번호 1 ~ 4 참조).
그 뒤 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 생독백신 1ml에는 약독화된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스가 1x105 TCID50(tissue culture infective dose 50%)가 함유하도록 제작하였다.
<실시예 3> 생독백신의 모돈에 대한 생식기 질병예방 평가
그룹 실험동물 생독백신 접종 시기 바이러스 공격접종
음성대조군 임신 80일령 모돈 5두 무접종 무접종
양성대조군 임신 80일령 모돈 5두 무접종 임신 80일령 접종
백신접종군 임신 80일령 모돈 5두 교배 2주전 임신 80일령 접종
백신대조군 임신 80일령 모돈 5두 교배 2주전 무접종
표 3과 같은 방법으로 실시예 2에서 제조된 생독백신의 모돈에 대한 생식기 질병예방 평가를 수행하고 그 결과를 표 4에 나타내었다. 상기 표 3에서 음성대조군은 백신을 접종하지 않고 한국에서 분리한 본 기탁 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(기탁번호 KCTC 11956BP)도 접종하지 않아서 정상적인 분만을 시행하는 모돈를 의미하고, 양성대조군은 백신을 접종하지 않고 한국에서 분리한 본 기탁 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(기탁번호 KCTC 11956BP)만 접종하여 모돈이 면역이 되어 있지 않기 때문에 유산 또는 사산을 유발하는 모돈를 의미하며, 백신접종군은 백신을 접종한 후에 한국에서 분리한 본 기탁 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(기탁번호 KCTC 11956BP)를 접종하여 백신의 효과를 판정하기 위한 모돈을 의미하며, 백신대조군은 백신을 접종한 후에 한국에서 분리한 본 기탁 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(기탁번호 KCTC 11956BP)를 접종하지 않아서 모돈에서 백신의 안전성을 검사하는 모돈를 의미한다.
그룹 검사 모돈 두수 생식기 질환 관찰 여부
정상분만 생식기 질환
유산 사산 조산
음성대조군 5 5 0 0 0
양성대조군 5 0 2 1 2
백신접종군 5 4 0 1 0
백신대조군 5 5 0 0 0
표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 생독백신을 접종 한 후 본 발명의 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 임신 모돈 4두에서 정상 분만을 하였고, 1두에서는 사산을 유발하였다 (백신접종군). 반면에 생독백신을 접종하지 않고 본 발명의 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 임신 모돈 5두 모두에서 유산 2두, 사산 1두, 조산2두가 발병하였다 (양성대조군). 따라서 본 발명의 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 생독백신은 모돈에서 유산, 사산, 조산 등의 생식기 질환을 예방하는 것으로 확인되었다.
<실시예 4> 생독백신의 자돈에 대한 호흡기 질병예방 평가
그룹 실험동물 생독백신
접종 시기
바이러스
공격접종
안락사 시기
음성대조군 1주령 자돈 15두 무접종 무접종 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
양성대조군 1주령 자돈 15두 무접종 4주령 접종 (백신접종후 2주 경과) 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
백신접종군 1주령 자돈 15두 2주령 4주령 접종 (백신접종후 2주 경과) 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
백신대조군 1주령 자돈 15두 2주령 무접종 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
표 5와 같은 방법으로 실시예 2에서 제조된 생독백신의 자돈에 대한 호흡기 질병예방 평가를 수행하고 그 결과를 표 6에 나타내었다.
그룹 검사 자돈 두수 호흡기 질환 관찰 여부
정상 폐장 간질성 폐렴
심함 중간 경미
음성대조군 15 15 0 0 0
양성대조군 15 0 9 5 1
백신접종군 15 14 0 0 1
백신대조군 15 15 0 0 0
실험결과 음성 대조군에서는 정상적인 폐장이 관찰되었다 (도 5). 생독백신을 접종한 후 야외에서 분리된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 15두 자돈의 경우 바이러스 공격접종 후 1주일이 경과된 시점에서 안락사 시킨 후 폐장의 병리조직학적 병변을 관찰하면 모두 정상적인 폐장이 관찰되었다 (백신접종군; 도 6). 반면에 생독백신을 접종하지 않고 야외에서 분리된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 15두 자돈의 경우 바이러스 공격접종 후 1주일이 경과된 시점에서 안락사 시킨 후 폐장의 병리조직학적 병변을 관찰하면 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염된 폐장에서 11두에서는 심한 간질성 폐렴(interstitial pneumonia; 도 7)이, 3두에서는 중간정도의 간질성 폐렴이, 1두에서는 경미한 간질성 폐렴이 관찰되었다 (양성대조군). 따라서 본 발명의 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 생독백신은 자돈에서 간질성 폐렴 등 호흡기 질환을 예방하는 것으로 확인되었다.
<실시예 5> 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 사독백신의 제조
실시예 2의 약독화된 생독 백신주에 대하여 0.7% 용량의 포르말린 원액(40%)을 첨가한 후 12시간 내지 24시간 동안 바이러스를 사독화 시킨다. 그 후 다시 알루미늄겔[All(OH)3 gel]을 사독화 시킨 바이러스 액의 10% 용량으로 첨가하여 사독백신을 제조하였다.
북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 사독백신 1ml에는 사독화된 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스가 1x105 TCID50(tissue culture infective dose)가 함유하도록 제작하였다.
<실시예 6> 사독백신의 모돈에 대한 생식기 질병예방 평가
그룹 실험동물 생독백신 접종 시기 바이러스 공격접종
음성대조군 임신 80일령 모돈 5두 무접종 무접종
양성대조군 임신 80일령 모돈 5두 무접종 임신 80일령 접종
백신접종군 임신 80일령 모돈 5두 교배 2주전 임신 80일령 접종
백신대조군 임신 80일령 모돈 5두 교배 2주전 무접종
표 7과 같은 방법으로 실시예 5에서 제조된 사독백신의 모돈에 대한 생식기 질병예방 평가를 수행하고 그 결과를 표 8에 나타내었다.
그룹 검사 모돈 두수 생식기 질환 관찰 여부
정상분만 생식기 질환
유산 사산 조산
음성대조군 5 5 0 0 0
양성대조군 5 0 2 1 2
백신접종군 5 4 0 1 0
백신대조군 5 0 0 0 0
표 8에서 확인할 수 있듯이, 사독백신을 접종 한 후 본 발명의 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 임신 모돈 4두에서 정상 분만 하였고, 단지 모돈 1두에서만 사산이 관찰되었다 (백신접종군). 반면에 사독백신을 접종하지 않고 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 임신 모돈 5두 모두에서 유산 2두, 사산 1두, 조산 2두가 발병하였다 (양성대조군). 따라서 본 발명의 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 사독백신은 모돈에서 유산, 사산, 조산 등의 생식기 질환을 예방하는 것으로 확인되었다.
<실시예 7> 사독백신의 자돈에 대한 호흡기 질병예방 평가
그룹 실험동물 생독백신
접종 시기
바이러스 공격접종 안락사 시기
음성대조군 1주령 자돈 15두 무접종 무접종 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
양성대조군 1주령 자돈 15두 무접종 4주령 접종 (백신접종후 2주 경과) 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
백신접종군 1주령 자돈 15두 2주령 4주령 접종 (백신접종후 2주 경과) 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
백신대조군 1주령 자돈 15두 2주령 무접종 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
표 9와 같은 방법으로 실시예 5에서 제조된 사독백신의 자돈에 대한 호흡기 질병예방 평가를 수행하고 그 결과를 표 10에 나타내었다.
그룹 검사 자돈 두수 호흡기 질환 관찰 여부
정상 폐장 간질성 폐렴
심함 중간 경미
음성대조군 15 15 0 0 0
양성대조군 15 0 10 4 1
백신접종군 15 11 0 2 2
백신대조군 15 15 0 0 0
실험결과 음성 대조군에서는 정상적인 폐장이 관찰되었다 (도 8). 사독백신을 접종 한 후 본 발명의 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 15두 자돈의 경우 바이러스 공격접종 후 1주일이 경과된 시점에서 안락사 시킨 후 폐장의 병리조직학적 병변을 관찰하면 11두에서는 정상적인 폐장이 관찰 (도 9)되었고, 2두에서는 중간정도의 간질성 폐렴이, 2두에서는 경미한 간질성 폐렴이 관찰되었다 (백신접종군). 반면에 사독백신을 접종하지 않고 본 발명의 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 15두 자돈의 경우 바이러스 공격접종 후 1주일이 경과된 시점에서 안락사 시킨 후 폐장의 병리조직학적 병변을 관찰하면 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염된 폐장에서 10두에서는 심한 간질성 폐렴(interstitial pneumonia; 도 10)이, 4두에서는 중간정도의 간질성 폐렴이, 1두에서는 경미한 간질성 폐렴이 관찰되었다 (양성대조군). 따라서 본 발명의 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 사독백신은 자돈에서 간질성 폐렴 등 호흡기 질환을 예방하는 것으로 확인되었다.
<실시예 8> 약독화 혼합백신(생독백신)의 제조
한국특허출원 제10-2011-0071054 호에 개시된 방법에 따라 약독화된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 제조하였다. 구체적으로 Marc-145 세포주에 처음 배양 할 때에는 5% FBS (fetal bovine serum)가 함유된 DMEM이라는 배지를 사용한다. 그후 Marc-145 세포주가 단층(monolayer)을 형성하게 되면 2.5% FBS가 함유된 DMEM으로 바꾼 후에 실시예 1의 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종할 때 까지 Marc-145 세포주를 단층(monolayer)으로 유지하였다.
기탁번호 KCTC 11954BP의 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 Marc-145 세포주에 접종한 후에 세포주가 변성이 되면서 형성되는 cytopathic effect (CPE)가 전체 Marc-145 세포주의 75% 정도 유발되면 -70℃에 얼려 보관하였다. 그 후 바이러스가 감염된 Marc-145 세포주를 배양하고 있는 플라스크를 냉동과 녹임 과정인 “freezing and thawing” 한 후 5000g에서 15분간 원심한 후 상층액을 거름종이를 이용하여 일차로 걸러주었다. 걸러준 상층액을 0.8μm syringe filter로 여과한 후, 여과액을 다시 0.45μm syringe filter로 여과한다. 그후 이 여과액을 단층이 형성되어 있는 Marc-145 세포주에 접종을 하고 일주일 간 세포를 관찰한다. 그 후 다시 세포주가 바이러스 감염에 의하여 변성이 되면서 형성되는 cytopathic effect (CPE)가 전체 Marc-145 세포주의 75% 정도 유발되면 상기 과정을 반복하여 다시 새로운 Marc-145 세포주에 접종한다. 이러한 계대방법을 50회 반복하여, 야외 분리 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 약독화하여 생독 백신주로 사용하고 이를 기탁번호 KCTC 11955BP로 기탁하였다.
그 뒤 실시예 2 기재의 기탁번호 KCTC 11957BP의 약독화된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스와 상술한 기탁번호 KCTC 11955BP의 약독화된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 혼합하여 혼합백신을 제조하였다. 구체적으로 혼합 생독백신 2ml으로 구성되어 있는데 이중 약독화된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스가 1x105 TCID50(tissue culture infective dose 50%)의 농도가 1ml 함유되어 있고, 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스도 1x105 TCID50(tissue culture infective dose 50%)의 농도가 1ml 함유되어 총 2ml로 구성되어 있다.
<실시예 9> 혼합생독백신의 모돈에 대한 생식기 질병예방 평가
그룹 모돈
두수
생독백신 접종시기 공격접종 시기 바이러스 공격접종
북미형 유럽형
음성대조군 5 X X X X
양성대조군1 5 X 임신 80일령 O X
양성대조군2 5 X 임신 80일령 X O
양성대조군3 5 X 임신 80일령 O O
백신접종군1 5 교배 2주전 임신 80일령 O X
백신접종군2 5 교배 2주전 임신 80일령 X O
백신접종군3 5 교배 2주전 임신 80일령 O O
백신대조군 5 교배 2주전 X X X
표 11과 같은 방법으로 실시예 8에서 제조된 혼합생독백신의 모돈에 대한 생식기 질병예방 평가를 수행하고 그 결과를 표 12에 나타나였다. 상기 표 11에서 음성대조군은 백신을 접종하지 않고 북미형과 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스도 접종하지 않아서 정상적인 분만을 시행하는 모돈를 의미하고, 양성대조군1은 백신을 접종하지 않고 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스만 접종하여 모돈이 면역이 되어 있지 않기 때문에 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 의한 유산 또는 사산을 유발하는 모돈를 의미하며, 양성대조군2은 백신을 접종하지 않고 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스만 접종하여 모돈이 면역이 되어 있지 않기 때문에 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 의한 유산 또는 사산을 유발하는 모돈를 의미하며, 양성대조군3은 백신을 접종하지 않고 북미형과 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스만 접종하여 모돈이 면역이 되어 있지 않기 때문에 북미형과 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 의한 유산 또는 사산을 유발하는 모돈를 의미하며, 백신접종군1은 백신을 접종한 후에 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종하여 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 대한 백신의 효과를 판정하기 위한 모돈을 의미하며, 백신접종군2은 백신을 접종한 후에 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종하여 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 대한 백신의 효과를 판정하기 위한 모돈을 의미하며, 백신접종군3은 백신을 접종한 후에 북미형과 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종하여 북미형과 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 대한 백신의 효과를 판정하기 위한 모돈을 의미하며, 백신대조군은 백신을 접종한 후에 북미형과 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종하지 않아서 모돈에서 백신의 안전성을 검사하는 모돈를 의미한다.
그룹 검사 모돈 두수 생식기 질환 관찰 여부
정상분만 생식기 질환
유산 사산 조산
음성대조군 5 5 0 0 0
양성대조군1 5 0 2 1 2
양성대조군2 5 0 3 1 1
양성대조군3 5 0 2 2 1
백신접종군1 5 4 0 1 0
백신접종군2 5 5 0 0 0
백신접종군3 5 5 0 0 0
백신대조군 5 5 0 0 0
표 12에서 확인할 수 있는 바와 같이 혼합 생독백신을 접종하지 않고 본 발명의 북미형 또는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스만 접종한 양성대조군1, 2, 3에 포함되어 있는 임신 모돈의 경우 모두 유산, 사산, 또는 조산을 관찰할 수 있었다. 반면에 임신을 위한 교배전에 혼합 생독백신을 접종한 후 임신 80일령에 도달한 후 북미형 또는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 백신접종군1, 2, 3의 경우 백신접종군1(혼합백신 접종후 북미형 바이러스 임신 80일령 공격접종)의 모돈 1두를 제외하고 모두 정상 분만하였다. 또한 혼합 생독백신만 접종한 백신대조군의 모돈 5두의 경우에도 모두 정상 분만하여 백신의 안전성도 입증되었다.
<실시예 10> 혼합생독백신의 자돈에 대한 호흡기 질병예방 평가
그룹 검사 자돈 두수 호흡기 질환 관찰 여부
정상 폐장 간질성 폐렴
심함 중간 경미
음성대조군 15 15 0 0 0
양성대조군1 15 0 9 5 1
양성대조군2 15 0 8 4 3
양성대조군3 15 0 10 2 3
백신접종군1 15 15 0 0 0
백신접종군2 15 14 0 0 1
백신접종군3 15 15 0 0 0
백신대조군 15 15 0 0 0
표 13과 같은 방법으로 실시예 8에서 제조된 혼합생독백신의 자돈에 대한 호흡기 질병예방 평가를 수행하고 그 결과를 표 14에 나타내었다.
그룹 검사 자돈 두수 호흡기 질환 관찰 여부
정상 폐장 간질성 폐렴
심함 중간 경미
음성대조군 15 15 0 0 0
양성대조군1 15 0 9 5 1
양성대조군2 15 0 8 4 3
양성대조군3 15 0 10 2 3
백신접종군1 15 15 0 0 0
백신접종군2 15 14 0 0 1
백신접종군3 15 15 0 0 0
백신대조군 15 15 0 0 0
실험결과 음성 대조군에서는 정상적인 폐장이 관찰되었다 (도 11). 혼합 생독백신을 접종하지 않고 본 발명의 북미형 또는 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스만 접종한 양성대조군 1, 2, 3에 포함되어 있는 자돈의 경우 모두 간질성 폐렴(interstitial pneumonia)이 관찰되었다 (도 12). 반면에 1주령 때에 혼합 생독백신을 접종한 후 4주령에 본 발명의 북미형 또는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 백신접종군1, 2, 3의 경우 백신접종군2(혼합백신 접종후 한국형 4주령 공격접종)의 자돈 1두를 제외하고 모두 정상적인 폐장을 관찰할 수가 있었다 (도 13). 또한 혼합 생독백신만 접종한 백신대조군의 자돈 15두의 경우에도 모두 정상적인 폐장을 관찰할 수가 있었다. 따라서 혼합 생독백신의 안전성도 입증되었다.
<실시예 11> 혼합사독백신의 제조
실시예 8의 약독화된 생독 백신주에 대하여 0.7% 용량의 포르말린 원액(40%)을 첨가한 후 12시간 내지 24시간 동안 바이러스를 사독화 시킨다. 그 후 다시 알루미늄겔[All(OH)3 gel]을 사독화 시킨 바이러스 액의 10% 용량으로 첨가하여 사독백신을 제조하였다.
북미형과 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 혼합 사독백신 2ml으로 구성되어 있는데 이중 사독화된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스가 1x105 TCID50(tissue culture infective dose 50%)의 농도가 1ml 함유되어 있고, 사독화된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스도 1x105 TCID50(tissue culture infective dose 50%)의 농도가 1ml 함유되어 총 2ml로 구성되어 있다.
<실시예 12> 혼합사독백신의 모돈에 대한 생식기 질병예방 평가
그룹 모돈
두수
혼합
사독백신 접종시기
공격접종 시기 바이러스 공격접종
북미형 유럽형
음성대조군 5 X X X X
양성대조군1 5 X 임신 80일령 O X
양성대조군2 5 X 임신 80일령 X O
양성대조군3 5 X 임신 80일령 O O
백신접종군1 5 교배 2주전 임신 80일령 O X
백신접종군2 5 교배 2주전 임신 80일령 X O
백신접종군3 5 교배 2주전 임신 80일령 O O
백신대조군 5 교배 2주전 X X X
표 15와 같은 방법으로 실시예 11에서 제조된 혼합사독백신의 모돈에 대한 생식기 질병예방 평가를 수행하고 그 결과를 표 16에 나타내었다.
그룹 검사 모돈 두수 생식기 질환 관찰 여부
정상분만 생식기 질환
유산 사산 조산
음성대조군 5 5 0 0 0
양성대조군1 5 0 2 1 2
양성대조군2 5 0 3 1 1
양성대조군3 5 0 2 2 1
백신접종군1 5 5 0 0 0
백신접종군2 5 4 0 0 1
백신접종군3 5 5 0 0 0
백신대조군 5 5 0 0 0
표 16에서 확인할 수 있듯이, 혼합 사독백신을 접종하지 않고 본 발명의 북미형 또는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스만 접종한 양성대조군1, 2, 3에 포함되어 있는 임신 모돈의 경우 모두 유산, 사산, 또는 조산을 관찰할 수 있었다. 반면에 임신을 위한 교배전에 혼합 사독백신을 접종한 후 임신 80일령에 도달한 후 본 발명의 북미형 또는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 백신접종군1, 2, 3의 경우 백신접종군2(혼합 사독백신 접종후 한국형 바이러스 임신 80일령 공격접종)의 모돈 1두에서만 조산이 관찰되었으며, 나머지 모돈에서는 정상 분만이 관찰되었다. 또한 혼합 사독백신만 접종한 백신대조군의 모돈 5두의 경우에도 모두 정상 분만하여 백신의 안전성도 입증되었다.
<실시예 13> 혼합사독백신의 자돈에 대한 호흡기 질병예방 평가
그룹 실험동물
(1주령)
혼합
사독백신
접종시기
바이러스 공격접종 안락사 시기
접종시기 북미형 유럽형
음성대조군 15두 X X X X 5주령
양성대조군1 15두 X 4주령 O X 5주령
양성대조군2 15두 X 4주령 X O 5주령
양성대조군3 15두 X 4주령 O O 5주령
백신접종군1 15두 2주령 4주령 O X 5주령
백신접종군2 15두 2주령 4주령 X O 5주령
백신접종군3 15두 2주령 4주령 O O 5주령
백신대조군 15두 2주령 X X X 5주령
표 17과 같은 방법으로 실시예 11에서 제조된 혼합사독백신의 자돈에 대한 호흡기 질병예방 평가를 수행하고 그 결과를 표 18에 나타내었다.
그룹 검사 자돈 두수 호흡기 질환 관찰 여부
정상 폐장 간질성 폐렴
심함 중간 경미
음성대조군 15 15 0 0 0
양성대조군1 15 0 9 5 1
양성대조군2 15 0 8 4 3
양성대조군3 15 0 10 2 3
백신접종군1 15 13 0 1 1
백신접종군2 15 13 1 1 0
백신접종군3 15 12 0 1 2
백신대조군 15 15 0 0 0
음성 대조군에서는 정상적인 폐장이 관찰되었다(도 14). 혼합 사독백신을 접종하지 않고 본 발명의 북미형 또는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스만 접종한 양성대조군1, 2, 3에 포함되어 있는 자돈의 경우 모두 간질성 폐렴(interstitial pneumonia)이 관찰되었다 (도 15). 반면에 1주령 때에 혼합 사독백신을 접종한 후 4주령에 본 발명의 북미형 또는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 백신접종군1, 2, 3의 경우 백신접종군1(혼합 사독백신 접종후 북미형 바이러스 4주령 공격접종)의 자돈 2두, 백신접종군2(혼합 사독백신 접종후 한국형 바이러스 4주령 공격접종)의 자돈 2두, 백신접종군3(혼합 사독백신 접종후 북미형과 한국형 바이러스 모두 4주령 공격접종)의 자돈 3두에서만 중간 또는 경미한 간질성 폐렴이 관찰되었고, 나머지 자돈에서는 정상적인 폐장을 관찰할 수가 있었다 (도 16). 또한 혼합 사독백신만 접종한 백신대조군의 자돈 15두의 경우에도 모두 정상적인 폐장을 관찰할 수가 있었다. 따라서 혼합 사독백신의 안전성도 입증되었다.
<실시예 14> 본 발명의 기탁된 균주에 감염된 모돈의 생식기 질환에 대한 북미형 백신(베링거 잉겔하임)의 예방 효과
본 발명의 기탁된 균주(KCTC 11956BP)에 감염된 모돈의 생식기 질환에 대한 북미형 백신(베링거 잉겔하임)의 예방 효과를 알아보기 위하여 표 19와 같은 실험을 실시하였다.
그룹 실험동물 백신
접종 시기
접종
백신 종류
바이러스 공격접종
(본 발명의 기탁 균주)
음성대조군 임신 80일령 모돈 5두 무접종 X 무접종
양성대조군 임신 80일령 모돈 5두 무접종 X 임신 80일령 접종
백신접종군1 임신 80일령 모돈 5두 교배 2주전 북미형 생독백신
(베링거잉겔하임)
임신 80일령 접종
백신접종군2 임신 80일령 모돈 5두 교배 2주전 북미형 생독백신
(본 기탁주로 제작한 백신)
그룹 검사 모돈 두수 생식기 질환 관찰 여부
정상분만 생식기 질환
유산 사산 조산
음성대조군 5 5 0 0 0
양성대조군 5 0 3 2 0
백신접종군1 5 2 2 1 0
백신접종군2 5 5 0 0 0
표 20에서 알 수 있듯이, 양성대조군 경우 북미형 생독백신(베링거잉겔하임)을 접종하지 않고 본 발명의 기탁 균주인 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(KCTC 11956BP)만 접종한 5두 모돈중에서 3두는 유산이 2두에서는 사산이 유발되었다. 백신을 접종한 두 개의 그룹인 백신접종군1과 백신접종군2를 하면, 백신접종군1에서 북미형 생독백신(베링거잉겔하임)을 접종 한 후 본 발명의 기탁 균주인 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 임신 모돈 5두중에서 2두만이 정상 분만 하였고, 모돈 2두에서는 유산이, 모돈 1두에서는 사산이 관찰되었다. 반면 백신접종군2에서 본 기탁 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(기탁번호 KCTC 11957BP)로 제작한 북미형 생독백신을 접종하고 본 기탁 균주인 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (기탁번호 KCTC 11956BP)로 접종한 모돈에서는 바이러스 감염이 에방되어 모두 정상분만 하였다. 따라서 북미형 생독백신(베링거잉겔하임)이 국내에서 분리하여 본 발명의 기탁 균주인 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염 (기탁번호 KCTC 11956BP)을 효과적으로 예방하지 못하는 것으로 확인되었다.
음성대조군은 백신을 접종하지 않고 한국에서 분리한 본 기탁 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(기탁번호 KCTC 11956BP)도 접종하지 않아서 정상적인 분만을 시행하는 모돈를 의미하고, 양성대조군은 어떠한 백신을 접종하지 않고 한국에서 분리한 본 기탁 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(기탁번호 KCTC 11956BP)만 접종하여 모돈이 면역이 되어 있지 않기 때문에 유산 또는 사산을 유발하는 모돈를 의미하며, 백신접종군1은 임신 모돈에게 북미형 생독백신(베링거잉겔하임) 백신을 접종한 후에 한국에서 분리한 본 기탁 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(기탁번호 KCTC 11956BP)를 접종하여 북미형 생독백신(베링거잉겔하임)의 백신 효과를 판정하기 위한 모돈을 의미하며, 백신접종군2은 임신 모돈에게 본 기탁 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군으로 제작한 북미형 생독백신을 접종한 후에 한국에서 분리한 본 기탁 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(기탁번호 KCTC 11956BP)를 접종하여 본 기탁 북미형 생독백신의 백신 효과를 판정하기 위한 모돈을 의미한다. 따라서 백신접종군1과 백신접종군2를 비교하면 본 기탁 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(기탁번호 KCTC 11956BP)에 대한 북미형 생독백신(베링거잉겔하임; 백신접종군1)와 분 기탁 북미형 생독백신의 예방 효과를 비교할 수 있다.
<실시예 15> 본 발명의 기탁된 균주에 감염된 자돈의 생식기 질환에 대한 북미형 백신(베링거 잉겔하임)의 예방 효과
본 발명의 기탁된 균주(KCTC 11956BP)에 감염된 자돈의 생식기 질환에 대한 북미형 백신(베링거 잉겔하임)의 예방 효과를 알아보기 위하여 표 21과 같은 실험을 실시하였다.
그룹 실험동물 백신 접종 시기 접종 백신 종류 바이러스 공격접종 (본 발명의 기탁 균주) 안락사 시기
음성대조군 1주령
자돈 15두
무접종 무접종 5주령
(바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
양성대조군 1주령
자돈 15두
무접종 4주령 접종 (백신접종후 2주 경과) 5주령
(바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
백신접종군1 1주령
자돈 15두
2주령 북미형
생독백신
(베링거잉겔하임)
4주령 접종 (백신접종후 2주 경과) 5주령
(바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
백신접종군1 1주령
자돈 15두
2주령 북미형
생독백신
(본 기탁주로 제작한 백신)
4주령 접종 (백신접종후 2주 경과) 5주령
(바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
그룹 검사 자돈 두수 호흡기 질환 관찰 여부
정상 폐장 간질성 폐렴
심함 중간 경미
음성대조군 15 15 0 0 0
양성대조군 15 0 9 4 2
백신접종군1 15 7 1 5 2
백신접종군2 15 13 0 1 1
표 22에서 알 수 있듯이, 음성 대조군에서는 정상적인 폐장이 관찰되었다. 백신을 접종하지 않고 본 발명의 기탁 균주인 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(기탁번호 KCTC 11956BP)를 접종한 15두 자돈의 양성대조군의 경우 바이러스 공격접종 후 1주일이 경과된 시점에서 안락사 시킨 후 폐장의 병리조직학적 병변을 관찰하면 정상적인 폐장은 관찰되지 않고, 9두에서는 심한 정도의 간질성 폐렴, 4두에서는 중간정도의 간질성 폐렴이, 2두에서는 경미한 간질성 폐렴이 관찰되었다 (양성대조군). 백신접종군1과 백신접종군2는 국내에서 분리한 본 발명의 기탁 균주인 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(기탁번호 KCTC 11956BP)에 다한 북미형 생독백신(베링거잉겔하임; 백신접종군1)와 본 기탁 북미형 생독백신의 효과를 비교하기 위한 그룹이다. 백신접종군1에서 북미형 생독백신(베링거잉겔하임)을 접종 한 후 본 발명의 기탁 균주인 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 15두 자돈의 경우 바이러스 공격접종 후 1주일이 경과된 시점에서 안락사 시킨 후 폐장의 병리조직학적 병변을 관찰하면 7두에서는 정상적인 폐장이 관찰되었고, 1두에서는 심한 정도의 간질성 폐렴, 5두에서는 중간정도의 간질성 폐렴 (도 17)이, 1두에서는 경미한 간질성 폐렴이 관찰되었다. 백신접종군2에서 본 기탁 북미형 생독백신을 접종 한 후 본 발명의 기탁 균주인 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 15두 자돈의 경우 바이러스 공격접종 후 1주일이 경과된 시점에서 안락사 시킨 후 폐장의 병리조직학적 병변을 관찰하면, 13두에서는 정상적인 폐장이 관찰되었고, 1두에서는 중간정도의 간징성 폐렴이, 1두에서는 경미한 간질성 폐렴 (도 18)이 관찰되었다. 따라서 북미형 생독백신(베링거잉겔하임)은 본 발명의 기탁 균주인 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염을 효과적으로 예방하지 못함을 확인하였다.
본 발명은 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방에 대단히 유용하다.
한국생명공학연구원 KCTC11954BP 20110704 한국생명공학연구원 KCTC11955BP 20110704 한국생명공학연구원 KCTC11956BP 20110704 한국생명공학연구원 KCTC11957BP 20110704
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Claims (11)

  1. 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11956BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 약독화 또는 사독화시킨 것을 유효성분으로 함유하는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기탁번호 KCTC 11956BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스는 서열번호 1로 표시되는 ORF5(오픈 리딩 프레임) 및 서열번호 2로 표시되는 ORF7(오픈 리딩 프레임)을 포함하는 것을 특징으로 하는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물.
  3. 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11956BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 계대배양하여 이를 약독화 또는 사독화하는 단계를 포함하는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물의 제조방법.
  4. 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11957BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 변이주는 서열번호 3으로 표시되는 ORF5(오픈 리딩 프레임) 및 서열번호 4로 표시되는 ORF7(오픈 리딩 프레임)을 포함하는 것을 특징으로 하는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 변이주는 생균 또는 사균임을 특징으로 하는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주.
  7. 제4항 또는 제5항의 변이주를 유효성분으로 함유하는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11956BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 및 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11954BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 약독화 또는 사독화시킨 것들을 유효성분으로 함유하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 혼합백신 조성물.
  11. 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11957BP로 기탁된 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주 및 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11955BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 유효성분으로 혼합한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 혼합백신 조성물.
KR1020110071095A 2011-07-18 2011-07-18 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 및 이를 포함하는 혼합백신 조성물 KR101281361B1 (ko)

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