KR19980703268A - 돼지의 생식 및 호흡 장애 증후군(prrs)을 유발하는 바이러스의 신종 약독화 균주와, 그 균주로써 얻을 수 있는 백신 및 진단수단과, 제조공정 - Google Patents

돼지의 생식 및 호흡 장애 증후군(prrs)을 유발하는 바이러스의 신종 약독화 균주와, 그 균주로써 얻을 수 있는 백신 및 진단수단과, 제조공정 Download PDF

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Abstract

돼지 생식 및 호흡 장애 증후군(PRRS)으로 알려진 돼지 질병을 유발하는 바이러스의 신종 약독화 균주(CNCM Institut Pasteur I-1642)가 개시되고, 이와 함께 원숭이 콩팥 셀 MA-104로부터 획득한 신종 클론(CNCM Institut Pasteur I-1643)을 사용한 상기 균주의 약독화 및 복제 공정이 개시된다. 돼지에 대한 무해성과 높은 면역원성 활성을 가지고 있으므로써, 상기 신종 약독화 균주는 PRRS의 조기 진단과 그러한 질병의 효율적인 예방조치를 가능케 하는 백신 및 진단 키트를 얻을 수 있게 한다.

Description

돼지의 생식 및 호흡 장애 증후군(PRRS)을 유발하는 바이러스의 신종 약독화 균주와, 그 균주로써 얻을 수 있는 백신 및 진단수단과, 제조공정
1987년 북아메리카에서 그 당시 수수께끼 돼지 질병 또는 MSD로 정의된 돼지질병이 처음 발견되었고, 그 질병은 뒤에 돼지 불임 및 호흡 장애 증후군 또는 SIRS로 알려졌다. 매우 유사한 증후군이 1990년 중부유럽에서 처음 발견되었고, 그 후 스페인을 포함한 유럽의 다른 나라로 퍼졌다. 유럽에서 상기 질병은 처음에는 돼지의 유행성 유산 및 호흡 장애 증후군 (PEARS)으로 명명되었고, 최종적으로는 돼지 생식 및 호흡 장애 증후군(PRRS)으로 명명되었다. 이 이름은 상기 질명에 관하여 전 세계적으로 받아들여 지게 되었다.
상기 PRRS의 병인학적 병원체는 네델란드에서 처음 분리되고 랠리스테드(Lelystad) 바이러스로 명명된 RNA 캡슐에 싸인 작은 바이러스라는 것은 이미 공지되어 있다. 상기 바이러스는 아테르비리대(Arterviridae)군에 속하는 것으로 제안되었다. 상기 바이러스는 PCT 특허출원 공보번호 WO-92/21375 및 동 발명으로부터 파생된 유럽특허 EP-B-0587780(Stichting Centraal Diegeneeskundig Instituut)에 설명되어 있다. 이러한 특허출원을 목적으로, 상기한 바이러스의 분리체가 Institut Pasteur of Paris에 번호 I-1102로 기탁되었다.
상기 유럽형 바이러스의 분리와 거의 같은 시기에 북아메리카 타입이 분리되었는데, 이에 관하여 PCT 특허출원 공보번호 WO-93/03760(Collins 외) 및 유럽특허출원 EP-A-0529584(Boehringer Ing.)에 설명되어 있다. 상기 특허출원을 목적으로, 상기한 바이러스의 분리체가 American Type Culture Collection(ATCC)에 번호 VR-2332로 기탁되었다.
유럽형 바이러스와 북아메리카형 바이러스는 혈청학적 반응성에 있어서 뿐 아니라 주요 RNA 단편의 뉴클레오타이드 서열의 상동성에 관하여도 분명히 다르다. 유럽특허출원 EP-A-0676467(Akzo)의 처음 두 페이지에 그러한 차이점에 관하여 광범위한 문헌의 인용과 함께 궤적으로 설명되어 있다. 상기한 특허출원에서 상기 유럽형 바이러스와 북아메리카형 바이러스는 오래 전에 명확히 분기하였다고 결론을 내리고 있다. 결과적으로 상기중 어느 한 타입에 대항하여 궁극적으로 효과를 나타내는 백신은 다른 타입에 대하여는 거의 또는 전혀 효과가 없으리라는 예상이 가능하다.
상기 유럽형과 아메리카형 바이러스 양측으로부터 서로 다른 균주가 분리되었다. 각각의 균주는 고유의 특징을 가지며, 여러개의 균주가 특허출원의 대상물이 되어 왔다. 예를 들면 PCT 특허출원 공보번호 WO-93/07898(Akzo)는 유럽 균주와 그로부터 파생된 백신으로서 CNCM(Institut Pasteur)에 번호 I-1140로 기탁된 백신을 개시하고 있다. 양자가 공히 동일 우선권출원으로부터 파생된, PCT 특허출원 공보번호 WO-93/14196 및 유럽 특허출원 EP-A-541418(Rhone-Merieux)는 프랑스에서 분리되어 CNCM(Institut Pasteur)에 번호 I-1153으로 기탁된 신종 균주를 개시하고 있다. 유럽특허출원 EP-A-0595436(Solvay)은 초기에 설명된 것보다 더 독성이 강한 신종 아메리카형 균주 및 그 균주의 백신을 개시하고 있다. 이 균주는 ATCC에 기탁되었으나 기탁번호는 특허출원 상에 열거되지 않았다. 마지막으로, 스페인 특허 출원번호 ES-A-2074850(Cyanamid Iberica)는 유럽 및 아메리카 균주와 다른 소위 스페인 균주를 개시한다. 이 스페인 균주는 European Animal Cell Culture Collection(EACCC)에 번호 V93070108로 기탁되었다.
결론적으로, PRRS의 병인학적 병원체는 많은 변종을 나타내며, 상기 질병에 효율적으로 대적하기 위해서 돼지를 감염시키는 바이러스 균주에 따라 여러 가지의 백신이 필요하다는 것은 명백한 것 같다.
암퇘지에 있어서, 상기 질병은 식욕부진(anorexia), 생식 장애(유산, 조기분만, 사산 또는 약체새끼 분만, 미이라화 또는 비(非)미이라화 상태의 태아 사망)를 특징으로 한다. 때때로 감염된 암퇘지가 죽기도 한다. 빈도가 덜한 증세로서 귀, 복부 또는 음문에 일시적으로 푸른색이 나타나며, 이 때문에 상기 질병이 처음에는 네델란드어로 Abortus blauw 즉, 영어로 푸른 귀로 알려졌다. 새끼돼지에 있어서, 이러한 증세는 나이에 좌우된다. 신생 새끼돼지에서 호흡곤란과 근육경련이 관찰될 수 있으나 좀더 나이든 돼지에 있어서는 후천성 마비와 운동실조증이 더 빈발한다. 질병 돌발의 정점에 있어서, 출생 첫날에 사망하는 것은 제한적이지만 10일 경과 새끼돼지의 사망률은 80%에 이를 수 있다. 일시적으로 감염된 비육돈은 적게 먹고 호흡기 상의 문제를 더 많이 나타낸다.
질병 잠복기는 5일 내지 37일의 범위에서 매우 변동이 심하다(I.B.Robertson Eurp. Comm. Seminar on PRRS, 11:4-5, Brussels, 1991). 때로는 상기 질병이 매우 느리게 퍼지지만 농장이 감염될 경우는 질병이 여러달동안 지속될 수 있다(B. Thacker, Int. Symp. on SIRS, St. Paul/Minnesota, 1992).
상기 바이러스에 대항하는 항체는 그동안 Wensvoort G. 외에 의해 기술된 바와 같이(The Vet. Quart. 13:121-130, 1990) 6일차 후감염(post-infection)에 의한 이뮤노퍼옥시다제 기법(immunoperoxidase monolayer assay, 이후 IPMA로 칭함)에 의하여 검출되어 왔다. 항체의 적정(滴定)값은 5일 경과후 1/20,000에 도달할 수 있고 일반적으로 12개월 이상 존속한다. 그러나 어떤 돼지들은 4-5개월 후에 혈청 반응음성을 나타나게 되며 이에 관한 참고보고서는 V.Ohlinger 외에 의한 Meredith, M. De, Pig Dis. Info. Center Cambridge, Dec. 1992가 있다. 상기 보고서의 저자들은 적정농도 104TCID50(조직배양균 감염량 50%)인 바이러스를 사용하여 허파, 혈청(serum), 혈장(plasma) 및 혈액세포 호모게네이트(homogenates)에서 6주일 후감염 방식으로 서로 다른 기관으로부터 감염시킨 후 바이러스를 분리할 수 있었다. 이것은 바이러스와 항체가 함께 수 주일 존속할 수 있음을 나타낸다. 그 뿐아니라 병발(outbreak)에서 살아남는 동물은 감염 가능 돼지에 대한 감염원으로 작용할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 바이러스감염은 1일차 후감염으로부터 검출될 수 있고, 통상적으로는 그보다 짧지만 최장 56일까지 지속될 수 있다.
혈액의 바이러스는 만연에 있어서 바이러스는 수태중인 암퇘지의 태반에까지 도달할 수 있다. 바이러스가 태반을 관통하여 태아의 사망을 야기할 수 있음이 입증되었다. 태아의 감염가능성은 마지막 제 3기 임신중에 가장 많이 일어난다. 추가로, 상기 바이러스는 태아를 죽이지 않으면서 태아 내에서 복제될 수 있다. 그러나 상기 바이러스는 미이라화 되거나 자기분해된 태아로부터는 분리될 수 없었다.
새끼돼지에 있어서 질병은 초유(初乳)(colostral) 획득 모계항체의 레벨이 감소되었을 때 일어난다. 마지막 제 3기 임신에서 감염된 암태지에서 분만된 새끼들중 몇마리는 초유가 분비되기 전에 상기 바이러스에 대한 항체를 갖추고 있음이 관찰되었다. 통상적으로 이러한 동물은 출생시에 바이러스감염을 나타낸다(C. Terpstra 외, Vet. Q 13:131-136, 1991).
많은 수의 식균세포가 파괴되었음에도 불구하고 PRRS 유발 바이러스의 면역억제 활성은 명확히 밝혀지지 않았다. 그러나 관련된 2차 감염이 빈발하고 돼지 농장에서의 심각한 경제적 손실을 가져오고 있다.
오늘날 PRRS 바이러스는 돼지수효가 많은 대다수의 국가에서 발견된다.
현재 PRRS는 직간접적인 경제적 손실로 인하여 돼지사육 분야에 영향을 주는 가장 중요한 질병중의 하나로서, PRRS 바이러스 감염으로 도움받는 2차 병원체에 의해 유발된다.
돼지 알베오라 식균세포(porcine alveolar macrophage, 이후 PAM으로 칭함) 조직에서 만들어진 비활성 백신을 사용하여 실험실 수준에서는 만족할 만한 결과가 얻어지나, 현장조건에서의 효과는 부분적으로 환경여건과 백신접종된 동물의 관리에 좌우된다.
PRRS 바이러스에 대항하는 면역학적 제품의 획득에 장애가 되어온 문제 가운데 하나는 바이러스 복제를 위하여 이용가능한 안정적인 기질(substrate)이 제한되어 있다는 것이다.
최근까지 PRRS 바이러스는 PAM 조직에서만 증식될 수 있었다(Wensvoort G. 외, in The Vet. Quart. 13:121-130, 1991). 이러한 식균세포를 얻기 위한 적정연령의 건강한 돼지를 사용할 필요성은 여러 가지 단점을 내포하였다. 그 뿐 아니라 회수된 PAM에 있어서, 다른 동물에서 파생된 세포 기질은 항상 가변적이므로 바이러스 감염에 대한 감수성이 보장되지 못하였다. 이점이 일정하고 균일한 품직의 항체를 생산하는데 있어서 주요 단점으로 제기되었으며, 상기 감수성을 판정하기 위해서는 각 배치(batch)마다 평가되어야 했다.
상기한 모든 이유로 해서, 안정적이고 연속적인 숙주세포의 이용가능성이 감소하였다는 사실이 세포기질 내의 PRRS 바이러스 복제 및 약독화 변형에 기초한 변종을 획득하기 위한 전략을 연구하는데 있어서, 심각한 장애가 되어왔다.
해결해야 할 주요 문제중의 하나는, 바이러스 복제가 PAM을 파괴하기 때문에 PAM 내의 복제를 피하면서 감염성이 큰 바이러스를 중화시킬 필요성이 있다는 점이다.
결과적으로 형질전환된 셀 라인(cell line)으로부터 유도된 안정적인 기질에 바이러스를 적응시킴으로써 약독화 변종의 획득 및 비활성 백신의 제조를 위한 적절한 도구가 제공되는 것이며, 따라서 PAM에 대한 의존성과 변이성을 배제하는 것이다.
PCT 특허출원 공보번호 WO-94/18311(Miles)에는, MA-104로 알려진 상업적 셀라인으로부터 유도하여 상기 특허출원자가 라인 MA-104(M)라고 명명한, 아프리카 녹색 원숭이 콩팥 셀라인으로부터 유도된 클론 900B로 명명된 특수한 클론 내의 PRRS 바이러스균주의 증식이 제안되어 있다. 상기 특허출원에 있어서 상기 특수한 클론의 기탁이 언급되어 있지 않으므로 상기 특허의 실행과 재현이 곤란하다.
본 발명은 돼지의 생식 및 호흡 장애 증후군(PRRS)으로 알려진 돼지의 질병을 유발하는 바이러스의 신종 약독화 균주에 관한 것이다. 원숭이 콩팥에서 얻어지는 새로운 셀 클론(ecll clone)을 사용하여 상기 바이러스 균주를 약독화하고 복제하는 공정은, PRRS의 조기 진단과 상기한 질병의 효과적인 예방조치를 할 수 있게 하는 백신 및 진단 키트의 제조를 가능하게 한다.
본 명세서에는 네개의 도면이 두 페이지에 실려있다. 도면에서 다음의 사항이 예시되어 있으며 그로 인하여 본 발명이 제한되지는 않는다.
도 1은 본 발명에 의한 약독화 균주체를 비강 내 경로로 접종받는 임신한 암퇘지에 있어서, 직장(直腸) 온도변화를 2차원으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 의한 약독화 균주체를 접종받은 암퇘지가 낳은 새끼돼지의 체중변화를 2차원으로 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 의한 약독화 균주체로 백신접종된 암퇘지의 자손에 있어서, IPMA에 의해 판정된 초유의 항체 역학을 2차원으로 나타낸 도면이다. 암퇘지 1호 및 10호의 자손이 출생시에 낮은 적정값을 보이는 것은 몇몇 새끼되지들이 혈액을 빼내는 순간에 이미 초유를 빨아먹지 않았기 때문이다.
도 4는 본 발명에 의한 약독화 균주체를 200 TCID50, 2,000 TCID50및 20,000 TCID50을 근육내 경로로 접종받은 새끼돼지에 있어서 체액의 감응 변화를 3차원으로 나타낸 도면이다.
본 발명은 목적은 PRRS 예방에 있어서 높은 효력을 갖는 돼지용 무독성 백신을 안정적이고 재현성있는 방식으로 획득할 수 있게 하는 PRRS 바이러스의 신종 약독화 균주이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 안정한 원숭이 콩팥 세포로부터 유도된 신종 셀 클론으로서, PRRS 바이러스가 높은 적정농도로 성장하도록 지지하고 선택된 약독화 균주의 안정적인 바이러스를 수확할 수 있게 하는 것이며, 상기 셀 크론의 획득공 정이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신종 약독화 균주 및 그 변종으로부터 획득가능한, PRRS 질명에 대항하는 효율적인 백신과 그 신종균주의 획득공정이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신종 약독화 균주 및 그 변종으로부터 획득 가능한, PRRS 질병에 대한 진단 키트와 그 신종 균주의 획득공정이다.
본 발명에 의한 PRRS 바이러스의 약독화 균주는 스페인 농장의 감염된 돼지로부터 분리된 전염성이 강한 균주를 약독화하여 유도된다. 설명의 적절성을 충족시키기 위해서 상기 약독화 균주는 Institut Pasteur로부터의 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) 에 기탁번호 I-1642로 기탁되었다. 기탁일자는 1995년 11월 23일이다.
전염성이 강한 균주의 약독화 및 약독화 균주의 복제는, 본 발명의 목적이기도 하고 저자에 의해 클론-8로 명명된 셀 클론 내에서 연속적인 통과에 의해 진행 되었다. 이 클론은 MA-104로 알려진 상업적인 원숭이 콩팥 셀 라인으로부터 유도된다. 또한 설명의 적절성을 충족시키기 위해서 상기 클론-8, 앞에서 언급한 기탁일과 같은 날째에 기탁번호 I-1643으로 Institut Pasteur로부터 CNCM에 기탁되었다.
이전에 상업적 셀 라인 MA-104는 클론-8의 선택 및 분리를 위한 목적으로 클론화 되었다. 이러한 클로닝은 태아소혈청(fetal bovine serum, 이후 FBS)과 함께 적합한 성장매체(예를 들면 Earle의 최소 필수매체(Earle's MEM) 속에서 셀을 현탁시키고, 서스펜젼(suspension)을 여러 가지 농도에서 플래이팅(plating)하고, 상기 클론을 선택 및 트립신화(tripsinzing)하고, 그 결과물을 컬쳐플라스크에 전개시킴으로써 성취하였다. 이와 같은 방식으로 얻어진 클론은 잘 변이된 클론이 획득될 때까지 상기 설명된 기술을 이용하여 연속적으로 클론화되었다.
불규칙한 형태를 나타내거나 증식시키기 어려운 클론을 제거한 후, 선택된 클론은 PRRS 바이러스의 초기 독성균주에 대한 감염감수성에 관하여 테스트되었다. 클론-8은 바이러스 균주 복제에 대한 높은 감수성(높은 TCID50)과 획득되는 바이러스 수확물의 재현성 및 일관성 때문에 선택되었다.
상기 독성균주는 클론-8 컬쳐 내에서, 바람직하게는 34℃에서 순차적 복제에 의해 약독화되었다. 복제물의 생존능력을 평가하기 위해 감염성 바이러스 입자의 내용물을 분석하고, 적응도를 예측하기 위해서 세포병리학적효과(cytopathic effect:CPE)를 시험하였다. 얻어진 결과에 의하면 상기 바이러스는 생존능력을 상실하지 않고 클론-8 내에서 적어도 20패시지(passage) 동안 복제할 수 있으며, 달성한 약독화로써 항원의 활성을 갖는 실제로 무해한 바이러스를 얻을 수 있게 된다.
결과적으로, 본 발명에 의한 PRRS 바이러스 약독화 균주체는 안정적이며 산업적으로 재현성이 있는 방식으로 얻어지며, 따라서 PRRS 백신 및 PRRS 진단키트 양자를 제조하기 위한 동 균주체의 용도를 촉진시킨다.
독성균주 또는 상기 약독화 균주중 어느 하나에 감염된 돼지 집단 사이의 비교시험 결과 약독화 균주는 그것에 감염된 동물에 대해 무해하다는 것이 명백히 나타났다. 한편, 본 발명에 의한 상기 약독화 균주체는 혈청반응음성의 돼지에서 높은 복제효율을 나타내며, 근육내 경로를 통해 200 TCID50의 적은 양으로 접종된 동물에 있어서 혈청전환을 유도해 낼 수 있다. 이와 같은 방식으로 유도된 항체는 적어도 80일간 존속한다.
결과적으로, 본 발명에 의한 상기 약독화 균주체는 PRRS에 대비하여 돼지의 예방적 조치를 위한 백신을 제조하는 탁월한 기초인 것이다. 상기한 바와 같은 백신은 당업자에 의해 잘 알려진 어떠한 방법에 의해서도 제조될 수 있으며, 또한 수용성 서스펜젼형태나 오일 에멀전형태, 리포좀 혼합물, 냉동건조된 형태 등과 같은 상이한 공지의 형태로 제조가 가능하다. 백신의 조성은 면역자극제, 에멀전화제, 안정화제 등과 같은 상이한 애쥬번트(adjuvant)로 완성될 수 있다. 백신은 근육내 또는 피하, 비강(鼻腔) 내, 기도(氣道) 내, 부피, 경피(硬皮) 또는 피부 내 경로로 투여될 수 있다.
유효 백신 투여량은 본 발명에 의한 약독화 균주체의 102및 106TCID50사이의 바람직한 형태 내에서 매우 가변적이다.
본 발명의 목적 중 하나인 획득된 백신은, 다른 하나의 생(生) 또는 비활성화된 돼지 바이러스와 함께, 또는 생 또는 비활성화된 박테리아와 함께 다가(polyvalent) 백신으로서 포뮬레이트(formulate) 될 수도 있다.
당업자에게 자명한 바와 같이, 백신은 또한 본 발명에 의한 바이러스성 균주체로부터 유도된 바이러스성 항원을 함유하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 열 또는 화학적 방법과 같은 공지의 방법을 사용하여 철저히 비활성화된 형태의 상기 균주를 함유하는 백신, 상기 균주의 캡슐 또는 RNA 단편 등이 그것이다.
본 발명에 의한 약독화 균주체는 또한, 종래의 기술을 적용하여 혈청반응 음성 동물 내의 항체를 검출할 수 있는 항원성 요소를 함유하는 적절한 진단 키트를 제조하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, PRRS 항체의 검출을 위한 IPMA 공정은 다음 단계를 포함할 수 있다.
a) 본 발명에 의한 약독화 바이러스 개체(object)가 안정한 셀 컬쳐, 바람직하게는 클론-8에 대하여 컬쳐 마이크로플레이트 내에서 각 웰(well)이 약 20-40개의 감염성 입자로 감염되는 방식으로 적응하는 단계.
b) 공지의 고정화제로 감염된 셀을 고체상(固體相)으로 고정시키는 단계.
c) 마이크로플레이트 내에서 배양한 후 IPMA 기술로 마이크로플레이트 내에 있는 상기 항체의 스테이닝(staining)에 의해 돼지 혈청 항체를 검출하는 단계.
본 발명의 보다 정확한 설명을 예시하기 위해서 몇가지 공정예가 개시된다. 그러한 예들은 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1. 안정한 원숭이 콩팥 셀라인 MA-104로부터 셀 클론의 획득
선택된 PRRS 바이러스성 균주의 6패시지(passage)는, 37℃에서 CO2의 보충없이 10% 소 태아혈청(FBS)과 함께 보충된 Earle's MEM 배지 내에 플라스틱 컬쳐 플라스크에서 성장시킨 스테틱 컬쳐셀 모노레이어로서 기탁번호 85102918인, 유럽 동물 셀 컬쳐 컬렉션(EACCC)이 공급한, 안정한 원숭이 콩팥 셀라인 MA-104을 이용하여 행해졌다. 바이럴 하베스트(viral harvest)는 각 패시지에서 접종 후 6-7일에 수집되었다.
상기 바이럴 하베스트의 수율을 연구하기 위하여 상기 셀라인은 상이한 MOI(이후 MOI로 칭함) 바이러스성 균주로 접종되었다. 획득된 바이럴 하베스트의 수율은 낮았고(103및 104TCID50/ml 사이), 4개의 적응 패시지 후에도 백신제조에 사용되기에 불충분하였다.
이러한 실험을 통해, 감염된 셀의 단지 일부분만 독성 바이러스에 감염가능 하였고 나머지 셀은 감염에 대하여 내성을 유지하였음이 관찰되었다. 이 때문에 상기 셀라인은 바이러스성 균주에 완전히 감염될 수 있는 셀 개체군(population)을 선택할 목적으로 클론되었다.
클론의 선택은 다음과 같이 행해졌다.
셀라인의 서스펜젼이 20% FBS와 함께 Earle's MEM에서 희석되었고, 여러 가지 희석액이 96 웰 마이크로플레이트(NUNC)에서 플레이팅 되었다. 플레이트들은 37℃, 5% CO2하에서 8일간 배양되었다. 3일차에 한개의 셀만을 포함한 웰은 현미경 관찰로 선택되고 8일차에 트립신화(tripsinize) 되었다. 이러한 방식으로 44 클론이 얻어졌다. 이후로 상기 획득된 클론은 컬쳐 플라스크 속에서 5×107셀/ml의 서스펜젼이 얻어질 때까지 증대되었다. 이러한 셀들은 이어서 동일한 공정으로 두번째 및 세번째 클로닝 되었다.
세번째 클로닝 후, 44개의 획득된 클론은 각각 6×106셀/ml을 함유하는 클론의 셀 서스펜젼 25ml가 얻어질 때까지 전개되었다. 전 공정을 통해 사용된 배지는 25% FBS를 함유하였다.
이러한 클론은 후속하여, 성장 및 생존력 특성에 따라 선택되었다.
실시예 2. 셀 클론 Clon-8의 선택
앞의 실시예에서 획득된 클론은 그것들의 성장효율에 따라 평가되었고, 증식 문제 또는 불규칙한 몰폴지로(morphology)를 나타내는 것과, 37℃에서 유지하기 어려운 것들은 제외되었다. 이러한 예비 선택 후 35 클론이 제외되었고 나머지 9개의 클론이 선택되었다.
상기 선택된 셀 클론은 PRRS 바이러스 독성 균주의 서스펜젼으로써 PAM 컬쳐내에서 8회의 바이러스성 패시지(P-8)로 감염시켰다 (Bloemberg, M. et at., Vet. Microb. 42, 361-371, 1994에 설명 참조). 상기 셀 클론에 대한 적응 공정이 다음과 같이 미리 행하여졌다: 바이러스는 80-90%의 합류 모노레이어를 6일 동안 바이러스성 서스펜젼과 접촉한 상태로 유지하고나서 -80℃에서 냉동시키고 24시간 후에 녹이는 과정에 의해, 3패시지 동안 37℃에서 복제되었다.
10% FBS와 겐타마이신(0.4㎎/ml)로 보충된 Earle's MEM이 감염 배지로 사용되었다. 항진균 화합물 또는 항이스트 화합물은 사용되지 않았다. 이러한 방식으로 획득된 각각의 바이럴 하베스트는 대응 셀 클론에서 적정되었다. 적정 결과를 분석한 후, 9개의 클론이 104.2TCID50/ml의 적정값을 나타냄으로써 바이러스성 감염에 대하여 감수성을 가진 것으로 결론지어졌다.
상기 결과를 표 I에 나타내었다.
[표 I]
선택된 바이러스성 균주에 대한 획득된 셀 클론의 민감도
표 I에서 알 수 있는 바와 같이, 클론되지 않은 셀라인은 매우 낮은 바이러스-민감도를 나타내며, 따라서 효과적인 백신을 획득하기 위한 항원으로서의 그것의 용도는 적합하지 않은 것으로 보인다.
표 I은 또한 어떤 클론들, 특히 Clon-8은 클로닝 되지 않은 셀라인보다 바이러스에 대하여 민감하다. Clon-8은 특히 현저하다. Clon-8로부터의 바이럴 하베스트에서 106TCID50/ml까지의 적정값이 얻어졌다.
위에서 설명된 결과에 따라 Clon-8이 선택되었다. 이 클론의 신뢰성을 검토하기 위해 여러번의 분석이 실행되었다. 여러 가지 분석에서 상기 바이럴 하베스트의 적정값은 재현성이 높았으며 그 값은 105와 107TCID50/ml의 범위내로 나타났다.
실시예 3. 약독화 바이러스성 균주
본 발명에 의한 약독화 바이러스성 균주체는 상기 선택된 바이러스성 균주를 Clon-8 셀 컬쳐내에 34℃에서 복제함으로써 획득되었다.
바이러스감염 Clon-8 셀 모노레이어는 CPE가 확장될 때까지 34℃하에 유지되었다. 상기 CPE는 37℃로 유지된 컬쳐내에 있을 때에 비하여 항상 24 내지 48시간 늦게 검출되었다. 그러나 상기 두가지 상이한 온도에서 확장된 CPE 특성에 있어서 아무런 큰 차이를 발견할 수 없었다.
획득된 바이럴 하베스트는 Clon-8 셀 모노레이어를 사용하여 적정되었다. 추가적으로 IPMA에 의해 상기 바이러스의 정체도 조사되었다.
상기 바이러스는 Clon-8 70㎠ 셀 모노레이어의 컨플루언스(confluence) 근처에 접종되고, 34℃에서 2시간 동안 흡수하도록 방치되었다. 다음에, 상기 감염 배지는 모노레이어에 첨가되었다. 감염 배지는 10% FBS가 보충된 변형 Earle's 최소 필수배지(Minimal Essential Medium)로서 미리 34℃로 맞추어 놓았다.
75㎠ 플라스크를 34℃ 인큐베이터에 넣고 명확한 CPE가 관찰될 때까지 매일 확인하였다. 통상적으로 감염 후 제 5일과 제 7일 사이에 셀 모노레이어의 80-95%가 CPE를 나타낼 때, 상기 바이럴 하베스트는 수집되었다. 다음에, 상기 바이럴 하베스트는 2,000rpm으로 원심분리되고 상등액은 바이러스 적정값(TCID50/ml)을 측정하기 위해 적정되었다.
위에서 설명한 방법을 사용하여 20 패시지가 실행되었다. 패시지 P.1, P.5, P.10 및 P.20에서 바이러스 내용물이 평가되었다. 그 결과는 바이러스가 34℃의 Clon-8 셀 모노레이어에서 생존력을 조금도 상실함이 없이 적어도 패시지 P.20까지 복제될 수 있음을 입증하였다(표 II 참조).
[표 II]
패시지 P.1에서 패시지 P.20까지 34℃하에 Clon-8에서 증식된 바이러스의 평가
추가적인 결과로부터 Clon-8 셀 모노레이어가 0.001 MOI에서 감열될 수 있음이 확인되었다.
본 명세서의 실시예에서 설명된 바와 같이 실행된 실험들은 P.20 유도 바이러스성 균주는 돼지에 대하여 무해하다는 것을 나타냈다.
실시예 4. 약독화 바이러스성 균주의 생물학적 특성 및 그것을 사용한 백신 접종의 효과
본 발명의 약독화 균주체를 획득하기 위해 사용된 개시 바이러스성 균주는 독성 균주이다. 임신 암퇘지에 미치는 주된 영향은 조기분만과, 약체아분만, 사산 및/또는 미이라화 신생 새끼돼지 등이다. 감염된 암퇘지는 또한 우울증 및 감연 후 4-5일에 가벼운 식욕부진을 3-5일간 나타내었다.
네 마리의 임신 암퇘지(참고번호 01, 02, 03 및 06)는 106.6TCID50의 개시 독성 균주를 비강 내 경로로 감염되었다. 두마리의 감염되지 않은 암퇘지(참고번호 73 및 74)는 컨트롤용으로 사용되었다. 그 결과가 표 III에 나타나 있다.
[표 III]
독성 바이러스로 접종된 임신 암퇘지 자손에 대한 효과
감염된 암퇘지 중 단지 한 마리만 예상일자에 분만하였다. 감염된 암퇘지는 각각 2, 0, 5 및 6마리의 사산 새끼돼지를 분만하였고, 2, 4, 2 및 1마리의 약체 새끼돼지를 분만하였다. 상기 약체 새끼돼지들은 출생 후 수일내에 사망하였다. 이유시(離乳時)에 각 컨트롤 암퇘지 중 평균 11마리의 새끼돼지가 생존하였다. 각 감염 암퇘지 중 단지 평균 6.5마리의 새끼돼지가 이유시에 생존하였다. 이유시에 새끼돼지의 평균체중은 4.621g(감염된 암퇘지의 새끼) 및 5.365g(컨트롤 암퇘지의 새끼)이었다. 독성 PRRS 바이러스가 약제로 분만된 새끼돼지의 균질화 폐로부터 분리되었다. 챌린지(challenge) 감염후 감염된 암퇘지 및 그 자손 양측 모두는 혈청전환되었다.
본 발명에 의한 약독화 바이러스성 균주체의 생물학적 특성화(characterization)가 특정 테스트에 따라 암수 돼지 모두를 사용하여 수행되었다. PRRS 발생이 전혀 검출된 사실이 없는 한 작은 농장으로부터 3마리의 PRRS 혈청반응음성인 임신 암퇘지에 대하여 무해성 테스트가 실행되었다. 상기 암퇘지는 마지막 세번째 임신기, 즉 바이러스에 대한 민감도가 최저인 때에 접종되었다. 암퇘지 1마리당 106TCID50의 양이 임신후 78일째 및 93일째 사이에 비강 내 경로를 통해 투여되었다. 상기 바이러스의 접종 후, 암퇘지 3마리의 생리적 상수는 불변상태로 유지되었고 직장(直腸)온도는 정상 계수 범위내에 있었다(도 1 참조). 3마리의 암퇘지는 또한 예상일자에 분만하였다. 얻어진 결과는 표 IV에 요약되어 있다.
[표 IV]
약독화 바이러스로 접종된 임신 암퇘지의 자손에 대한 영향
상기 3마리의 암퇘지는 각각 13, 14 및 16마리의 새끼돼지를 낳았다. 신생새끼돼지들의 생존력은 정상적인 것으로 판단되었다. 그러나 암퇘지 두마리의 자손에서는 여러마리의 미이라화 새끼돼지가 발견되었다. 이것은 암퇘지들로부터의 많은 한배 새끼수를 고려한다면 정상적인 것으로 간주될 수 있다. 새끼돼지의 채중변화는 모든 경우에 있어서 정상적인 것으로 관찰되었고(도 2 참조), 관찰기간(45일)의 마지막까지 정상적인 범위내에 있었다. PRRS 바이러스 감염과 관계된 것으로 볼 수 있는 허약체질 및 질병의 증상은 어느 새끼돼지에서도 발견되지 않았다. 그 밖에도 PRRS 바이러스는 신생 새끼되지로부터 채취한 혈액과 혈청에서 전혀 검출되지 않았다.
상기 바이러스 접종 후 21-36일에 임신 암퇘지로부터 채취한 혈액 및 혈청에서도 PRRS 바이러스는 발견되지 않았다. 이러한 모든 사실은 엄밀히 말해서, 야생형 바이러스에 의한 감염에 가장 감수성이 높은 카테고리인 임신 암퇘지에 있어서, 상기 약독화 PRRS 균주의 무해성을 입증한다. 접종된 임신 암퇘지가 분만한 신생돼지로부터 채취한 모든 혈청샘플은 공지의 기법을 사용하여 PAM 컬쳐 내의 PRRS 바이러스의 존재에 대하여 스크린하였을 때 음성인 것으로 밝혀졌다. 약독화 바이러스로 접종된 3마리의 암퇘지는 분만 후 45일에 IPMA 적정값이 1/480으로서 그후에 거의 변동없이 안정한 값을 나타낸 체액 항체를 가지고 있었다. 암퇘지들은 접종 후 21일이 경과하자마자 혈청반응 양성임이 밝혀졌다. 도 3에서 알 수있는 바와 같이 접종된 암퇘지가 분만한 새끼돼지들은 초유(初乳)를 빨아먹은 후 혈청반응 양성으로 나타났으며 분만 후 최소한 75일 경과시까지 양성인 상태가 유지되었다.
최종 세번째 임신중인 12마리의 암퇘지 집단에 대한 또 다른 접종테스트가 실시되었다. 8마리의 암퇘지가 39 백신투여량(105TCID50)을 근육내에 백신 접종되었고, 나머지 4마리는 생식 파라미터에 대한 약독화 균주의 영향을 평가하기 위해 컨트롤로서 사용되었다. 예상분만일에 분만한 백신접종 암퇘지들의 생리적 파라미터에 있어서, 아무 변화가 관찰되지 않았다. 그 결과는 표 V에 나타나 있다. 표 V에서알 수 있듯이 접종된 8마리의 암퇘지와 4마리의 컨트롤 암퇘지 양측 모두 정상적인 수의 새끼돼지를분만하였다. 또한 새끼돼지들은 정상적인 생존력을 가졌다.
[표 V]
임신 암퇘지의 마지막 세번째 임신에 있어서의 생신 파라미터에 대한 약독화 바이러스의 접종이 미치는 영향
본 발명에 의한 약독화 바이러스체는 PRRS-혈청반응음성 돼지 체내에서 효율적으로 복제한다. 이것은 근육내에 투여된 200 TCID50에 불과한 적은 양이 돼지 체내에서 복재되고 혈청전환을 유발할 수 있다는 사실로써 입증된다. 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이 유발된 항체는 접종된 동물 체내에서 초소한 52일간 존속하였다.
본 발명에 의한 약독화 바이러스체는, 근육내 접종된 8마리의 새끼돼지 집단과 함께 수용된 4마리의 파수꾼 역할의 비접종 돼지로는 전파되지 않는다. 바이러스가 백신접종되지 않은 동물로 전파되지 않는다는 사실은 상기 약독화 균주가 백신으로서 적합함을 예시하는 것이다. 그 뿐아니라 백신접종된 돼지에 있어서 백혈병 또는 다른 어떠한 임상적인 증상도 발견되지 않음으로써, 상기 약독화 바이러스는 근육내 투여된 경우에 무해하다는 것을 나타낸다. 접종된 새끼돼지의 평균 86%가 접종 후 11일이 경과하자마자 혈청반응 양성이 되었다.
본 발명에 의한 약독화 바이러스체는 접종된 돼지에 있어서 바이러스성 PRRS 균주로 챌린지 감염의 임상적 영향을 예방하는 면역성 보호반응을 유발한다. 따라서, 생후 4주일인 백신접종 새끼돼지가 독성 바이러스에 감염되었을 때 아무 임상적 증상이 관찰되지 않았다. 반면에, 표 VI에 나타난 바와 같이 실험적 감염 후에 백신접종이 안된 컨트롤 새끼되지들의 80%가 현저한 직장(直腸)의 온도 상승을 나타냈다. 그 뿐아니라, 실험적 감염 후 19일 경과시에 실행된 부검(剖檢)에서, 백신접종된 새끼돼지들은 비접종 컨트롤 새끼돼지보다 현저히 적은 폐손상을 나타냈다. 같은 방법으로, 실험적 감염 후 백신접종된 동물 중 단지 25%에서만 독성 바이러스가 발견되었고, 이에 반해 백신접종이 안된 컨트롤 동물 중 80%에서 감염 후 최소한 12일에서까지 독성 바이러스가 검출될 수 있었다.
[표 VI]
챌린지 감염 후 백신접종 및 컨트롤 새끼돼지 양측에 있어서의 고열증세(hyp erthermia)
기탁된 미생물에 관한 자료
부다페스트 협약에 따라, 본발명에 의한 바이러스성 균주와 셀 Clon-8 object는 국제기관인 프랑스 파리 소재 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) of the Institut Pasteur에 기탁되었다.
상기 기탁물은 부다페스트 협약에서 규정한 조건하에 공공의 처분에 맡겨진다. 이것은 본 발명의 목적을 실시함으로써 본 발명의 출원인에 귀속하는 권리의 침해에 대한 면허로 해석되어서는 안된다.

Claims (20)

  1. CNCM of Institut Pasteur의 억세스 번호 I-1642인 1995년 11월 23일자 기탁물에 본질적으로 상응하는, 돼지 생식 및 호흡 장애 증후군(PRRS)으로 알려진 돼지 질명을 유발하는 바이러스의 약독화 균주.
  2. 돼지 생식 및 호흡 장애 증후군(PRRS)으로 알려진 질병에 대항하여 돼지를 보호하기 위한 백신에 있어서,
    제 1항에 의한 바이러스성 균주 및/또는 그 균주로부터 획득할 수 있는 적어도 하나의 바이러스성 항원을 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 바이러스성 항원은 비활성화된 바이러스인 백신.
  4. 제 2항에 있어서,
    102및 106TCID50사이의 약독화 바이러스성 균주를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
  5. 제 2항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 백신 투여량에는 102및 106TCID50사이의 약독화 바이러스성 균주에 의해 생성되는 양과 동등한 바이러스성 항원 양이 함유되어 있는 백신.
  6. 제 2-5항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가의 면역자극성 애쥬번트 및/또는 에멀젼화제 및/또는 안정화제를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
  7. 제 2-6항 중 어느 한 항에 있어서,
    단일형태 또는 결합형태 중 한 형태를 하고, 생 또는 비활성화된 돼지 바이러스를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
  8. 제 2-6항 중 어느 한 항에 있어서,
    생 또는 비활성화된 박테리아를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
  9. CNCM of Institut Pasteur의 억세스 번호 I-1642인 1995년 11월 23일자 기탁물에 본질적으로 상응하는, 안정한 원숭이 콩팥 셀라인 MA-104로부터 유도된 셀 클론.
  10. PRRS 바이러스의 약독화 균주를 획득하는 공정에 있어서,
    제 9항에 의한 셀 클론 내에서의 연속되는 패시지에 의한 독성균주의 변형을 본질적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
  11. 제 10항에 있어서,
    연속되는 패시지에서 34℃의 온도를 유지하는 것을 특징으로 하는 공정.
  12. PRRS에 대항하는 활성 백신을 제조하기 위한 공정에 있어서,
    제 9항에 의한 셀 클론 내에서 제 1항에 의한 바이러스성 균주의 증식을 본질적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 고정.
  13. 제 12항에 있어서,
    바이러스성 균주를 34℃에서 증식하는 것을 특징으로 하는 공정.
  14. 제 12항 또는 13항 중 한 항에 있어서,
    획득된 약독화 균주의 조성은 제 6항에 의한 애쥬번트가 존재하거나 또는 존재하지 않는, 수용성 현탁액 또는 오일 에멀젼, 리포좀 조성물, 또는 냉동건조형태인 것을 특징으로 하는 공정.
  15. 제 12-14항 중 어느 한 항에 있어서,
    획득된 약독화 균주가 완전히 비활성화될 때까지 열 또는 화학적 방법으로 상기 약독화 균주를 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 공정.
  16. 제 1항에 의한 약독화 균주 및/또는 그 균주로부터 획득하는 적어도 하나의 바이러스성 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 PRRS 진단공정.
  17. PRRS 항체를 검출하기 위한 공정으로써,
    a) 각각의 웰(well)이 약 20-40개의 감염성 입자로 감염되는 방식으로 컬쳐마이크로플레이트 내의 안정한 셀 컬쳐에서 성장하도록 약독화 바이러스성 균주를 적응시키는 단계와,
    b) 감염된 셀을 공지의 정착제(fixative)를 사용하여 고체상에 정착시키는 단계와,
    c) 돼지 혈청으로부터의 항체를 마이크로플레이트에서 배양하고 IPMA 기법을 이용하여 염색함으로써 검출하는 단계를 포함하는 공정.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 안정한 셀 컬쳐는 제 9항에 의한 셀 클론인 공정.
  19. PRRS로 알려진 돼지의 질병을 예방하는 백신을 제조하기 위한, 제 1항에 의한 약독화 바이러스성 균주의 사용방법.
  20. PRRS로 알려진 돼지의 질명을 검출하기 위한 진단 키트를 제조하기 위한, 제 1항에 의한 약독화 바이러스성 균주의 사용방법.
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