PL185841B1

PL185841B1 - Nowy atenuowany szczep wirusa powodującego zespółNowy atenuowany szczep wirusa powodującego zespółrozrodczy i oddechowy świń (PRRS), szczepionki i zrozrodczy i oddechowy świń (PRRS), szczepionki i zestawy diagnostyczne otrzymane z tego wirusa orazestawy diagnostyczne otrzymane z tego wirusa orazsposoby ich otrzymywaniasposoby ich otrzymywania

Info

Publication number: PL185841B1
Application number: PL96322455A
Authority: PL
Inventors: Burch ReinaAlemany Burch Reina Alemany; Maso EnricEspuna Maso Enric Espuna; Pujadas PereRiera Pujadas Pere Riera; Roca NarcisSaubi Roca Narcis Saubi
Original assignee: Hipra Sa Lab
Priority date: 1996-01-25
Filing date: 1996-12-04
Publication date: 2003-08-29
Also published as: UA68326C2; PL322455A1; MX9707302A; HUP9801124A2; JPH10507372A; EP0835929A1; BR9604888A; ES2102971B1; CA2216436A1; CZ337797A3; KR19980703268A; HUP9801124A3; CN1185806A; US6001370A; WO1997027288A1; ES2102971A1; CZ286766B6; JP3068204B2

Abstract

1. Atenuowany szczep wirusa powodujacego chorobe swin znana jako zespól roz- rodczy i oddechowy swin (PRRS), odpowiadajacy zasadniczo depozytowi o numerze dostepu 1-1642 w CNCM w Instytucie Pasteura, zlozonemu w dacie 23 listopada 1995. 2. Szczepionka zabezpieczajaca dla swin przeciwko chorobie znanej jako zespól rozrodczy i oddechowy swin (PRRS), znamienna tym, ze zawiera szczep wirusowy za- strzezony w zastrz. 1 i/lub co najmniej jeden antygen wirusowy, który moze byc otrzy- many z tego szczepu. 16. Zestaw do diagnostyki PRRS, znamienny tym, ze zawiera atenuowany szczep zastrzegany w zastrz. 1 i/lub co najmniej jeden antygen wirusowy z tego wirusa. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy atenuowany szczep wirusa powodującego chorobę świń znaną jako zespół rozrodczo-oddechowy świń (PRRS). Procedura atenuacji i replikacji zjadliwego szczepu z zastosowaniem nowego klonu komórkowego otrzymanego z nerki małpiej umożliwia wytwarzanie szczepionek i zestawów diagnostycznych, które pozwalają na wczesne zdiagnozowanie PRRS i skuteczną profilaktykę tej choroby.

W roku 1987 w Ameryce Północnej wykryto po raz pierwszy chorobę świń, którą w tym momencie zdefiniowano jako „tajemniczą chorobę świń” lub MSD, a później znana była jako „zespół bezpłodności i oddechowy świń” lub SIRS. Bardzo podobny zespół odkryto po raz pierwszy w Europie Środkowej w roku 1990; rozprzestrzenił się on później na inne kraje europejskie, w tym Hiszpanię. Na początku choroba została w Europie nazwana „epidemiczny zespół aborcyjny i oddechowy świń” lub PEARS, w końcu „zespół rozrodczy i oddechowy świń” lub PRRS. Ta ostatnia nazwa została przyjęta na całym świecie jako nazwa choroby.

Jest już wiadomo, że czynnikiem etiologicznym PRRS jest mały wirus RNA z otoczką wyizolowany po raz pierwszy w Holandii i nazwany wirusem Lelystad. Przypuszcza się, że wirus ten należy do grupy Arteriviridae. Wirus ten został opisany w publikacji międzynarodowego zgłoszenia PCT WO92/21375 oraz w otrzymanym z tego zgłoszenia patencie europejskim EP-B-0587780 (Stichting Centraal Diegeneeskundig Instituut). Dla celów postępowania patentowego izolat tego wirusa został zdeponowany w Instytucie Pasteura w Paryżu, numer dostępu 1-1102.

Typ północno-amerykański został wyizolowany prawie jednocześnie z wyizolowaniem wirusa typu europejskiego i opisany w publikacji międzynarodowego zgłoszenia PCT WO93/03760 (Collins i in.) oraz publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego EP-A0529584 (Boehringer Ing.). Dla celów postępowania patentowego izolat tego wirusa został zdeponowany w American Type Culture Collection (ATCC), numer VR-2332.

Wirusy typu europejskiego i północno-amerykańskiego wyraźnie różnią się między sobą nie tylko pod względem reaktywności serologicznej, ale także pod względem stopnia homo-logii sekwencji nukleotydowych znaczących fragmentów RNA. Na pierwszych dwóch stronach publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego EP-A-0676467 (Akzo) opisano dokładnie te różnice, z obszernymi cytowaniami literaturowymi. W powyższej publikacji stwierdzono, że wirusy typu europejskiego i północnoamerykańskiego wyraźnie rozdzieliły się dawno temu. W konskwencji można oczekiwać, że ewentualne szczepionki skuteczne przeciwko jednemu z tych typów nie będą skuteczne lub skuteczne w małym stopniu przeciwko typowi drugiemu.

Z typów europejskiego i północno-amerykańskiego wyizolowano różne szczepy wirusów. Każdy ze szczepów ma swoją własną specyficzną charakterystykę, a kilka szczepów było przedmiotem zgłoszeń patentowych. Na przykład w publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO93/07898 (Akzo) opisano szczep europejski, złożony do depozytu w CNCM (Instytut Pasteura), numer 1-1140 oraz otrzymane z niego szczepionki. W publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO93/14196 i publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego EP-A-541418 (Rhóne-Merieux), pochodzących z tego samego zgłoszenia priorytetowego, opisano nowy szczep wyizolowany we Francji, zdeponowany w CNCM (In

185 841 stytut Pasteura), numer 1-1153. W publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego EP-A0595436 (Solvay) opisano nowy szczep typu amerykańskiego, bardziej zjadliwy niż szczep opisany jako pierwszy, oraz otrzymane z niego szczepionki. Szczep ten został zdeponowany w ATCC, ale w zgłoszeniu patentowym nie podano numeru depozytu. Wreszcie w hiszpańskim zgłoszeniu patentowym nr ES-A-2074950 (Cyanamid Iberica) opisano tak zwany „szczep hiszpański”, który różni się od innych szczepów europejskich i amerykańskich. „Szczep hiszpański” zdeponowano wEuropean Animal Celi Culture Collection (EACCC), numer V93070108.

Konkludując, wydaje się dowiedzione, że czynnik etiologiczny PRRS posiada wiele odmian i do skutecznego zwalczania choroby potrzebne są szczepionki różnego typu, zależnie od typu infekującego świnie szczepu wirusowego.

Choroba u macior charakteryzuje się brakiem apetytu, anoreksją zaburzeniami rozrodu (poronienie, przedwczesny poród, narodziny martwych lub słabych prosiąt oraz śmierć płodów, z ich mumifikacją lub bez). Niekiedy zainfekowane świnie mogą umrzeć. Rzadszym objawem jest błękitne zabarwienie uszu, brzucha lub sromu; z tego powodu choroba była początkowo znana w Holandii pod nazwą „Abortus blauw” a w Wielkiej Brytanii pod nazwą „Blue Ear”. Objawy u prosiąt są zależne od wieku. U prosiąt noworodków obserwuje się duszności i drżenie mięśniowe, natomiast u prosiąt starszych częstsze są niedowład tylny i ataksja. W szczytowym okresie wybuchu choroby śmiertelność w pierwszych dniach życia jest ograniczona, ale u prosiąt dziesięciodniowych może sięgać 80%. Przejściowo zainfekowane tuczniki jedzą mniej i mają więcej problemów oddechowych.

Okres inkubacji choroby jest bardzo zmienny, w zakresie od 5 do 37 dni (I. B. Robertson Eurp. Comm. Seminar on PRRS, 11:4-5, Bruksela, 1991). Niekiedy rozprzestrzenianie się choroby jest bardzo wolne, ale w przypadku dotknięcia nią farmy choroba może utrzymywać się kilka miesięcy (B. Thacker, Int. Symp. on SIRS, St. Paul/Minnesota, 1992).

Przeciwciała przeciwko wirusowi wykrywano za pomocą techniki immunoperoksydazowej (monowarstwowy test immunoperoksydazowy, dalej IPMA) do 6 dnia po zakażeniu, jak opisali G. Wensvoort i współpr. (The Vet. Quart. 13:121-130, 1991). Miana przeciwciał pięć dni później mogą dochodzić do 1/20000 i generalnie utrzymują się przez 12 miesięcy. Jednakże jak podali V. Ohlinger i współpr., Meredith, M. De. Pig Dis. Info. Center Cambridge, Dec. 1992, niektóre świnie stają się seropozytywne 4-5 miesięcy później. Autorom tym udało się wyizolować wirusa po zakażeniu z różnych narządów, a miano wirusa 6 tygodni po zakażeniu w płucach, osoczu i homogenizacje komórek krwi dochodziło do 10⁴ TCID⁵⁰(dawki zakaźne dla hodowli tkankowych w 50%). Wskazuje to, że wirus i przeciwciała mogą utrzymywać się razem przez kilka tygodni. Ponadto jest dobrze znane, że zwierzęta, które przeżywają wybuch choroby mogą stanowić źródło zakażenia dla podatnych świń. Wiremia może być wykrywana od 1 dnia po zakażeniu i może trwać do 56 dni, przy czym zwykle trwa krócej.

W przypadku rozprzestrzeniania się wirusa poprzez krew, wirus może dostać się do łożyska ciężarnych macior. Zostało wykazane, że wirus może przechodzić przez łożysko i powodować śmierć płodów. Maksymalna podatność płodu występuje podczas ostatniej trzeciej części ciąży. Ponadto wirus jest zdolny do replikacji w płodach bez powodowania ich śmierci. Jednakże wirusa nigdy nie wyizolowano z płodów zmumifikowanych lub rozłożonych autolitycznie.

Choroba u prosiąt rozpoczyna się gdy poziom matczynych przeciwciał pobieranych z siarą obniży się. Wśród żywo urodzonych prosiąt z macior zakażonych w trzeciej części ciąży obserwowano przypadki prosiąt mających przeciwciała jeszcze przed rozpoczęciem laktacji siary. Zwykle zwierzęta te w chwili narodzin mają także wiremię (C. Terpstrą i współpr., Vet. Q. 13:131-136, 1991).

Mimo powodowania rozpadu dużej liczby makrofagów, czynność immunosupresorowa wirusa powodującego PRRS nie została wyraźnie wykazana. Jednakże częste są towarzyszące infekcje wtórne, powodujące znacznie straty ekonomiczne na farmach.

Obecnie wirusy PRRS występują w większości krajów mających znaczące pogłowie świń.

185 841

PRRS jest obecnie jedną z najważniejszych chorób, dotykających sektor świński z powodu strat ekonomicznych, zarówno bezpośrednich jak i pośrednich, powodowanych przez czynniki wtórne, którym sprzyjają infekcje wirusa PRRS.

Stosowanie szczepionek inaktywowanych, wytwarzanych w kulturach świńskich makrofagów pęcherzykowych (PAM) daje zadowalające wyniki na poziomie laboratoryjnym, ale skuteczność w warunkach polowych zależy częściowo od warunków środowiskowych i od postępowania z zakażonymi zwierzętami.

Jednym z problemów utrudniających uzyskanie produktów immunologicznych przeciwko wirusowi PRRS jest ograniczona dostępność stabilnych podłoży dla replikacji wirusa.

Do niedawna wirus PRRS mógł być amplifikowany tylko w hodowlach świńskich makrofagów pęcherzykowych (PAM) (Wensvoort G. i współpr., The Vet Quart. 13:121-130, 1991). Konieczność stosowania do uzyskania tych makrofagów wolnych od choroby świń w określonym wieku stanowi dużą niedogodność. Ponadto nie ma gwarancji, że uzyskane PAM będą podatne na zakażenie wirusowe, ponieważ podłoża komórkowe pochodzące od różnych zwierząt są zawsze zmienne. Stanowi to poważną przeszkodę dla produkcji partii antygenu o ciągłej i jednorodnej jakości, a każda partią musi być poddawana ocenie w celu ustalenia jej podatności.

Z tych wszystkich powodów zmniejszona dostępność stabilnego i ciągłego gospodarza komórkowego stwarza poważne przeszkody w badaniach strategii otrzymywania mutantów w oparciu o replikację wirusa PRRS w podłożach komórkowych i selekcję atenuowanych odmian.

Jednym z głównych problemów do rozwiązania pozostaje konieczność zobojętnienia zjadliwego wirusa z uniknięciem jego replikacji w PPM, ponieważ replikacja wirusa powoduje ich destrukcję.

W konsekwencji adaptacja wirusa do stabilnego podłoża, otrzymanego z transformowanej linii komórkowej dostarczyłaby odpowiedniego narzędzia zarówno do otrzymania atenuowanych mutantów jak i do wytworzenia inaktywowanych szczepionek, eliminując w ten sposób zależność do zmienności PAM.

W publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO94/18311 (Miles) zaproponowano propagację pewnego szczepu wirusa PRRS w nietypowym klonie, oznaczonym jako klon 9009B, otrzymanym z linii komórkowej nerki afrykańskiej małpy zielonej, oznaczonym przez zgłaszającego MA-104(M), który z kolei otrzymany jest z handlowej linii znanej jako MA-104. W tym zgłoszeniu patentowym nie podano informacji o złożeniu do depozytu tego nietypowego klonu, w związku z czym wykonanie i odtworzenie wynalazku jest trudne.

Celem wynalazku jest uzyskanie nowego atenuowanego szczepu wirusa PRRS, który umożliwia uzyskanie, w stabilny i odtwarzalny sposób, nieszkodliwych szczepionek dla świń o wysokiej skuteczności w zapobieganiu PRRS.

Następnym celem wynalazku jest uzyskanie nowego klonu komórkowego ze stabilnej linii nerki małpiej MA-104, nadającego się na podłoże dla namnażania wirusa PRRS z wysokimi mianami oraz umożliwiającego uzyskanie stabilnych skosów wirusowych wyselekcjonowanego atenuowanego szczepu, a także sposób wytwarzania takiego klonu komórkowego.

Następnym celem wynalazku jest uzyskanie skutecznych szczepionek przeciwko chorobie PRRS, które można otrzymać z nowego atenuowanego szczepu i z jego mutantów, oraz sposobów ich otrzymywania.

Jeszcze innym celem wynalazku jest uzyskanie zestawów diagnostycznych do choroby PRRS, które możną otrzymać z nowego atenuowanego szczepu lub jego mutantów, oraz sposobu ich otrzymywania.

Przedmiotem wynalazku jest atenuowany szczep wirusa PRRS, otrzymany przez atenuowanie zjadliwego szczepu wyizolowanego od zakażonych świń z farmy hiszpańskiej. W celu wypełnienia obowiązku odpowiedniego ujawnienia, ten atenuowany szczep został złożony do depozytu w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) z Instytutu Pasteura za numerem dostępu 1-1642. Data złożenia do depozytu to 23 listopada 1995.

Atenuowanie zjadliwego szczepu i replikację przeprowadzono przez kolejne pasażowanie w klonie komórkowym, który jest także przedmiotem wynalazku i został przez twórców oznaczony jako Klon 8. Klon ten otrzymano z handlowej linii komórkowej nerki małpiej znanej

185 841 jako MA-104. Także w celu spełnienia wymogu odpowiedniego ujawnienia Klon-8 złożono do depozytu w CNCM w Instytucie Pasteura w tej samej dacie jak powyższa, za numerem 1-1643.

Poprzednio handlową linię komórkową MA-104 klonowano w celu selekcji i wyizolowania Klonu 8. Klonowanie to przeprowadzano poprzez zawieszenie komórek w odpowiednim podłożu wzrostowym (na przykład minimalnym podłożu podstawowym Earl'a (MEM Earle'a) z bydlęcą surowicą płodową (FBS)), posiewanie zawiesiny w różnych stężeniach, selekcja i trypsynowanie klonów oraz ekspandowanie ich w kolbach hodowlanych. Klony otrzymane w ten sposób klonowano sukcesywnie, stosując opisane techniki, aż do uzyskania dobrze zróżnicowanych klonów.

Po odrzuceniu klonów o nieregularnym zachowaniu lub trudnych do amplifikacji, wyselekcjonowane klony testowano pod względem podatności na zakażenie wyjściowym, zjadliwym szczepem wirusa PRRS. Klon 8 wyselekcjonowano ze względu na jego wysoką podatność na replikację szczepu wirusowego (wysokie TCID₅₀) oraz na odtwarzalność i konsystencję otrzymanych skosów wirusowych.

Zjadliwy szczep atenuowano przez kolejne replikacje w hodowlach Klonu 8, korzystnie w temperaturze 34°C. Oznaczano zawartość infekcyjnych cząstek wirusowych w celu oceny żywotności replikacyjnej i badano efekt cytopatyczny (CPE) w celu oszacowania stopnia adaptacji. Zgodnie z otrzymanymi wynikami wirus jest zdolny do replikacji w Klonie 8 bez utraty żywotności w co najmniej 20 pasażach, a uzyskana atenuacja daje praktycznie nieszkodliwego wirusa, o utrzymanej czynności antygenowej.

W konsekwencji otrzymuje się w stabilny i przemysłowo odtwarzalny sposób atenuowany szczep wirusa PRRS według wynalazku, co ułatwia jego stosowanie do otrzymania szczepionek przeciwko PRRS i zestawów diagnostycznych do PRRS.

Testy porównawcze między grupami świń zakażonymi szczepem zjadliwym a grupami zakażonymi wirusem atenuowanym wykazują wyraźnie, że szczep atenuowany jest nieszkodliwy dla zwierząt nim zakażonych. Z drugiej strony atenuowany szczep według wynalazku wykazuje wysoką efektywność replikacji u świń seroujemnych i jest zdolny do wywoływania serokonwersji u zwierząt zaszczepionych drogą domięśniową dawkami tak niskimi jak 200 TCID₅₀. Przeciwciała wywołane tą drogą utrzymują się co najmniej przez 80 dni.

W konsekwencji atenuowany szczep według wynalazku stanowi doskonałą podstawę do wytwarzania szczepionek do profilaktyki PRRS u świń. Takie szczepionki mogą być wytwarzane przy użyciu dowolnego sposobu wytwarzania szczepionek znanego specjalistom, oraz różnych typowych form, takich jak zawiesiny wodne, emulsje olejowe, kompozycje lipozomowe, liofilizaty, i tym podobne. Kompozycje szczepionki mogą być dopełnione różnymi adiuwantami, takimi jak immunostymulatory, emulgatory, stabilizatory, i tym podobne. Szczepionki mogą być podawane drogą domięśniową lub podskórną donosową dotchawiczną skórną podskórną lub doskómą.

Efektywne dawki szczepionki mogą być bardzo zmienne, korzystnie w zakresie od 10 do 10 TCID₅₀ atenuowanego wirusa według wynalazku.

Otrzymane szczepionki, będące także przedmiotem wynalazku, mogą być także formułowane jako szczepionki poliwalentne, razem z innym żywym lub inaktywowanym wirusem świńskim, lub razem z żywą lub inaktywowaną bakterią.

Jak jest oczywiste dla specjalisty, mogą być także otrzymane szczepionki zawierające antygeny wirusowe otrzymane ze szczepu wirusowego według wynalazku, na przykład szczepionki zawierające ten szczep w postaci starannie inaktywowanej za pomocą dowolnej typowej metody, na przykład metody chemicznej lub termicznej, szczepionki zawierające kapsułę lub fragmenty RNA tego wirusa, i tym podobnie.

Atenuowany szczep według wynalazku może także znaleźć zastosowanie do wytwarzania, za pomocą typowych technik, odpowiednich zestawów diagnostycznych zawierających elementy antygenowe zdolne do wykrywania przeciwciał u zwierząt seropozytywnych. Na przykład procedura IPMA wykrywania przeciwciał PRRS może obejmować następujące etapy:

a) Adaptacji atenuowanego wirusa według wynalazku do stabilnej hodowli komórkowej, korzystnie do Klonu 8, w hodowli mikropłytkowej, w taki sposób że każda studzienka jest zakażona około 20-40 cząstkami infekcyjnymi.

185 841

b) Utrwalenia zakażonych komórek do fazy stałej za pomocą znanych środków utrwalających.

c) Detekcji świńskich przeciwciał z surowicy przez inkubowanie ich w mikropłytce, następnie wybarwianie przeciwciał w mikropłytce technikami IPMA.

Do niniejszego opisu dołączono dwie strony rysunku z czterema figurami. Na rysunku:

Figura 1 przedstawia dwuwymiarowy obraz ewolucji temperatury ciężarnych macior, zaszczepionych drogą donosową atenuowanym wirusem według wynalazku.

Figura 2 przedstawią dwuwymiarowy obraz ewolucji ciężaru ciała prosiąt narodzonych z macior zaszczepionych atenuowanym wirusem według wynalazku.

Figura 3 przedstawia dwuwymiarowy obraz kinetyki przeciwciał w siarze, oznaczonych za pomocą techniki IPMA, u potomków macior zaszczepionych atenuowanym wirusem według wynalazku. Niższe miana u potomków maciory 1 i 10 przy narodzeniu są związane z faktem, że niektóre prosięta w momencie pobierania krwi nie ssały jeszcze siary.

Figura 4 przedstawią trójwymiarowy obraz przedstawiający ewolucję odpowiedzi humoralnej u prosiąt zaszczepionych drogą domięśniową dawką 200, 200 i 20000 TCID₅₀ atenuowanego szczepu według wynalazku.

Przykłady

Przedstawiono kilka przykładów procedur w celu bardziej dokładnego zilustrowania opisu i niniejszego wynalazku. Przykłady te nie ograniczają wynalazku.

Przykład 1. Otrzymywanie klonów komórek ze stabilnej linii komórkowej nerki małpiej MA.-104.

Przeprowadzono sześć pasaży wyselekcjonowanego zjadliwego wirusa PRRS, stosując stabilną linię komórki małpiej MA-104, otrzymaną z European Animal Celi Culture Collection (EACCC), numer depozytu 85102918, w statycznej jednowarstwowej hodowli komórkowej wzrastającej w plastykowych kolbach hodowlanych, w podłożu MEM Earle'a suplementowanym 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS), w 37°C i bez dodatku CO₂. Skosy wirusowe zbierano 6-7 dni po zaszczepieniu w każdym pasażu.

W celu zbadania wydajności skosów wirusowych linię komórkową zaszczepiano zjadliwym szczepem przy różnych wielokrotnościach zakażenia (dalej MOI). Otrzymane wydajności skosów wirusowych były niskie (między 10 a 10⁴ TCID₅₀) i niewystarczające dla stosowania w produkcji szczepionki, nawet po czterech pasażach adaptacyjnych.

W eksperymentach tych zaobserwowano, że tylko część zakażonych komórek była podatna na zjadliwego wirusa, natomiast reszta komórek pozostawała oporna na zakażenie. Z tego powodu tę linię komórkową klonowano w celu selekcji tych populacji komórek, które były całkowicie podatne na szczep zjadliwy.

Selekcję klonów przeprowadzono w sposób następujący.

Zawiesinę linii komórkowej rozcieńczano pożywką MEM EarFa z 20% FBS i w różnych rozcieńczeniach posiewano w 96-studzienkowych mikropłytkach (NUNC®). Płytki inkubowano przez 8 dni w 37°C w 5% CO₂. 3 dnia drogą obserwacji mikroskopowej wyselekcjonowano studzienki zawierające tylko jedną komórkę i trypsynizowano je dnia 8. Otrzymano w ten sposób 44 klony. Następnie otrzymane klony ekspandowano w kolbach hodowlanych aż do uzyskania zawiesiny 5xl0⁷ komórek/ml. Komórki te następnie klonowano drugi i trzeci raz stosując tę samą procedurę.

Po trzecim klonowaniu 44 otrzymane klony ekspandowano aż do otrzymania 25 ml zawiesiny komórek każdego klonu, zawierającej 6x10⁶ komórek/ml. Podłoże stosowane podczas tego procesu zawierało 20% FBS.

Klony te następnie selekcjonowano dalej według ich charakterystyki wzrostu i żywot-ności.

Przykład 2. Selekcją klonu komórkowego Klon 8.

Klony otrzymane w poprzednim przykładzie oceniano pod względem ich efektywności wzrostu, a te które wykazywały problemy z amplifikacją nieregularną morfologię lub były trudne do utrzymania w37°C, odrzucano. Po tej wstępnej selekcji odrzucono 35 klonów, a pozostałe 9 wybrano.

Wybrane klony komórkowe zakażono zawiesiną zjadliwego szczepu wirusa PRRS na ósmym pasażu wirusowym (P-8) w hodowlach PAM (w sposób opisany w artykule M. Blo

185 841 emberga i współpr. wVet. Microb. 42, 361-371, 1994). Przedtem przeprowadzono proces adaptacji do klonów komórkowych: wirusa replikowano w 37°C podczas 3 pasaży przez utrzymywanie zlanych w 80-90% monowarstw w kontakcie z zawiesiną wirusa przez 6 dni, następnie zamrażanie w -80°C i rozmrażanie 24 godziny później.

Jako podłoże do infekcji zastosowano MEM Earl’a, suplementowane 10% FBS i gnetamycyną (0,4 mg/ml). Nie stosowano związków przeciwgrzybiczych ani przeciwdrożdżowych. Każdy otrzymany w ten sposób skos wirusowy miareczkowano w odpowiadającym klonie komórkowym. Po przeanalizowaniu wyników wyciągnięto wniosek, że 9 klonów było podatnych na zakażenie wirusowe przy mianach równych lub wyższych niż IO^4,2 TCID₅₀. Wyniki przedstawiono w tabeli I.

Tabela I

Wrażliwość otrzymanych klonów komórkowych w stosunku do wybranego zjadliwego szczepu

Klon lub linia komórkowa	Miano jako TCID₅₀/ml
Nieklonowana linia komórkowa	10³
Klon 1	io⁵·⁷⁵
Klon 2	io⁴·⁵
Klon 3	IO⁵²
Klon 4	IO⁵³
Klon 8	10⁶
Klon 29	io⁵·⁷⁵
Klon 30	105.58
Klon 41	l₀5.58
Klon 44	io⁴·²

Jak jest widoczne z tabeli I, nieklonowana linia komórkowa wykazuje bardzo niską wrażliwość na wirusa i zatem jej użycie jako antygenu dla uzyskania skutecznych szczepionek nie wydaje się wykonalne. Tabela I przedstawia także niektóre klony, zwłaszcza Klon 8, bardziej czułe na wirusa niż nieklonowana linia komórkowa. Szczególnie wart uwagi jest Klon 8. W skosach wirusowych z Klonu 8 można uzyskać miana wirusa aż do 10⁶ TCID^5o/ml.

Na podstawie opisanych powyżej wyników, wybrano Klon 8. Przeprowadzono szereg testów w celu zbadania odtwarzalności tego klonu. W różnych testach miana skosów wirusowych były w wysokim stopniu powtarzalne, dając wartości między 10⁵ a 10⁷TCID⁵⁰/ml.

Przykład 3. Otrzymywanie atenuowanego szczepu wirusowego.

Atenuowany szczep wirusa według wynalazku otrzymuje się przez replikację w 34°C wyselekcjonowanego zjadliwego szczepu w hodowlach komórkowych Klonu 8.

Zakażone wirusem monowarstwy komórek Klonu 8 utrzymywano w 34°C aż do rozwinięcia się CPE. CPE zawsze wykrywano od 24 do 48 godzin później w hodowlach utrzymywanych w37°C. Jednakże nie stwierdzano żadnych istotnych różnic w cechach CPE rozwijających się w obu temperaturach.

Uzyskane skosy wirusowe mianowano, stosując monowarstwy komórek Klonu 8. Ponadto sprawdzano tożsamość wirusa za pomocą IPMA.

Wirusem inokulowano monowarstwy bliskich zlania się komórek Klonu 8 o powierzchni 75 cm² i pozostawiano do adsorbcji na 2 godziny w 34°Ć. Następnie do mono-warstwy dodawano podłoże infekcyjne. Jako podłoże infekcyjne stosowano zmodyfikowane minimalne podłoże podstawowe Earle'a, suplementowane 10% FBS, ogrzane do 34°C.

Kolbę o powierzchni 75 cm¹ umieszczano w inkubatorze w 34°C i codziennie sprawdzano aż do zaobserwowania wyraźnego CPE. Gdy 80-95% monowarstwy komórek wykazywało CPE, zwykle między piątym a siódmym dniem po zakażeniu, zbierano skos wirusa. Na

185 841 stępnie skos wirusa wirowano przy 200 rpm i mianowano supematant w celu oznaczenia miana wirusa (TCID₅₀/ml).

Stosując opisaną wyżej metodę przeprowadzono 20 pasaży. Zawartość wirusa oceniano po pasażach P.l, P.5, P.10, P.15 i P.20. Wyniki wykazują, że wirus może replikować się w mono-warstwach komórek Klonu 8 w 34 °C bez utraty żywotności, co najmniej aż do pasażu P. 20 (tabela II).

Tabela II Ewolucja wirusa namnażanego w Klonie 8 w 34°C od pasażu P.l do pasażu P.20.

Pasaż w Klonie 8	Zawartość wirusa w TCID_S0/ml
P. 1	1O⁵·⁵
P. 5	10⁵·⁷
P.10	10⁵·⁵
P.15	1O⁵·⁸
P.20	10⁶²

Dalsze wyniki potwierdziły, że monowarstwy komórek Klonu 8 mogą być zakażone przy MOI 0,001.

Próby przeprowadzone w sposób opisany w następnym przykładzie wykazały, że otrzymany z P. 20 szczep wirusowy był nieszkodliwy dla świń.

Przykład 4. Charakterystyka biologiczna atenuowanego szczepu wirusowego i wpływ zaszczepienia tym wirusem

Jako wirus wyjściowy do wytworzenia atenuowanego szczepu według wynalazku zastosowano wirusa zjadliwego. Jego główny wpływ na ciężarne maciory to przedwczesne porody oraz rodzenie się słabych, martwych i/lub zmumifikowanych prosiąt. Zakażone maciory wykazują również depresję i 3-5 dniowy okres niewielkiej anoreksji w 4-5 dni po zakażeniu.

Cztery ciężarne maciory (oznaczenia 01, 02, 03 i 06) zakażono drogą donosową 10^6,6TCID₅₀ wyjściowego zjadliwego wirusa. Dwie niezakażone maciory (oznaczenia 73 i 74) użyto jako kontrole. Wyniki przedstawiono w tabeli III.

Tabela III

Wpływ zakażenia ciężarnych macior zjadliwym wirusem na ich potomstwo.

Oznaczenie maciory	Zaszczepienie zjadliwym wirusem	Liczba urodzonych prosiąt	Liczba martwych prosiąt do czasu odsądzenia
żywe	martwe	zmumifikowane
01	+	10	2	0	2
02	+	15	0	0	4
03	+	6	5	0	2
06	+	6	6	0	1
73	-	13	0	0	0
74	-	10	0	0	0

Tylko jedna zakażona maciora oprosiła się w oczekiwanym czasie. Zakażone maciory urodziły odpowiednio 2, 0, 5 i 6 płodów nieżywych i 2, 4, 2 i 1 słabych prosiąt. Słabe prosięta umierały kilka dni po narodzeniu. Do czasu odsądzenia od sutka średnio 11 prosiąt od każdej z macior kontrolnych było żywych. W dniu odsądzenia od sutka zdrowych było tylko średnio 6,5 prosiąt od każdej z macior zakażonych. Przy odsądzaniu średnia waga prosiąt wynosiła 4,621 g (prosięta od macior zakażonych) i 5,365 g (prosięta od macior kontrolnych). Ze zhomogenizowanych płuc słabych narodzonych prosiąt wyizolowano zjadliwego wirusa PRRS. Po zaszczepieniu zaobserwowano serokonwersję zarówno macior zakażonych jak i ich potomstwa.

185 841

Przeprowadzono charakterystykę biologiczną atenuowanego szczepu wirusowego według wynalazku, stosując świnie obu płci, zależnie od rodzaju testu. Test szkodliwości przeprowadzono na 3 seroujemnych ciężarnych maciorach zmalej farmy, gdzie nigdy nie wykrywano wybuchów PRRS. Maciory zaszczepiono w ostatnim trymestrze ciąży, gdy wrażliwość na wirusa jest maksymalna. Dawkę 10 TCID₅₍₎ atenuowanego wirusa na maciorę podawano drogą donosową między dniami 78 a 93 ciąży. Po zaszczepieniu wirusem stałe fizjologiczne trzech macior pozostały niezmienione a temperatura w odbycie mieściła się w granicach normy (patrz fig. 1). Trzy maciory oprosiły się o czasie. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli IV.

Tabela IV

Wpływ zaszczepienia ciężarnych macior atenuowanym wirusem na ich potomstwo.

Oznaczenie maciory	Zaszczepienie atenuowanym wirusem	Liczba urodzonych prosiąt	Liczba zgonów wywołanych PRRS do czasu odsądzenia
żywe	martwe	zmumifikowane
1	+	13	0	3	0
2	+	4	1	0	0
10	+	16	0	1	0

Trzy maciory dały odpowiednio 13, 4 i 16 prosiąt. Żywotność nowonarodzonych prosiąt uznano za normalną. Jednakże w potomstwie dwóch macior stwierdzono kilka prosiąt zmumifikowanych. Możną to uznać za normalne, biorąc pod uwagę duże mioty od tych macior. We wszystkich przypadkach przyrost wagi prosiąt uznano za prawidłowy (patrz fig. 2) i mieszczący się w granicach normalnych parametrów aż do końca okresu obserwacji (45 dni). U żadnego z prosiąt nie stwierdzono objawów osłabienia i zaburzeń, które mogą być związane z zakażeniem wirusem PRRS. Ponadto nie wykryto wirusa PRRS ani w próbkach krwi ani w próbkach surowicy pobranych od nowonarodzonych prosiąt.

Wirusa PRRS nie wykryto także w próbkach krwi i surowicy od ciężarnych macior w 21-36 dni po zaszczepieniu wirusem. Wszystkie te fakty dowodzą nieszkodliwości atenuowanego szczepu wirusa PRRS dla ciężarnych macior, które są najbardziej podatne na zakażenie dzikim typem wirusa. Wszystkie próbki surowicy od prosiąt nowonarodzonych od macior zaszczepionych badane typowymi technikami na obecność wirusa PRRS w hodowlach PAM okazały się negatywne. Trzy maciory zaszczepione atenuowanym wirusem miały przeciwciała humoralne o mianach IPMA 1/480 w 45 dni po oprosieniu, a od tego dnia z małymi odchyleniami były pod tym względem stabilne. Już 21 dni po zaszczepieniu maciory były seropozytywne. Jak jest widoczne na figurze 3, prosięta od zaszczepionych macior po rozpoczęciu ssania siary były seropozytywne i pozostawały seropozytywne co najmniej do wieku 75 dni.

Następny test nieszkodliwości przeprowadzono w grupie 12 ciężarnych macior w ostatnim trymestrze ciąży. Osiem macior zaszczepiono domięśniowo 39 dawkami szczepionki (10 TCID₅₀) a pozostałe cztery maciory zastosowano jako kontrole do oceny wpływu atenuowanego szczepu wirusa na parametry rozrodu. Nie zaobserwowano zmian parametrów fizjologicznych zaszczepionych macior, które oprosiły się w oczekiwanym terminie. Wyniki przedstawiono w tabeli V. Jak jest widoczne w tej tabeli, zarówno osiem macior zaszczepionych jak i cztery maciory kontrolne urodziły normalną liczbę prosiąt. Prosięta charakteryzowały się także normalną żywotnością.

185 841 β

α <ο w ο

Ο ο <ΰ e λ ο >< C Μ <0 •Ν α>

•Η U •ο ο Μ

Ν Ο 3 > Μ

Φ β <ΰ 3 Φ a <0

3 & 3 <0 3 Ο 3 3 Φ 4-> Φ

Łączna liczba prosiąt (F)

12

10

13

16

11

12

17

CO

cn

14

GA

12

a + a

Liczba zmumifikowanych prosiąt (E)

O

r-4

O

CM

o

O

r-4

o

CM

O

rH

Liczba martwych prosiąt (D)

I-i

O

o

t-l

r*4

r-4

CM

o

t—4

O

t-l

Liczba słabych prosiąt (C)

o

O

t-l

O

t—1

o

r-4

o

A obejmuje B i C F = A +

Liczba prosiąt o wadze mniejszej niż średnia w grupie (B)

rH

o

CM

o

O

CM

o

CM

O

Liczba żywych prosiąt (A)

11

03

13

1 1°

11

14

co

13

OA

O

1 ( + )

O

1 ( + )

2 ( + )

o

I ( + )

i (-)

2( + )

O

1

Odchylenie od spodziewanego terminu porodu (w dniach)

Szczepienie

tak

nie

Oznaczenie maciory

86

94

96

102

116

121

ε > i

151

76

79

81

CO 00

185 841

Atenuowany wirus według wynalazku namnaża się efektywnie w świniach PRRSseronegatywnych. Dowodzi tego fakt, że tak mała dawka jak 200 TCID₅₀ podana domięśniowo może replikować się i indukować serokonwersję u świń. Jak jest widoczne na fig. 4, indukowane przeciwciała utrzymują się u zaszczepionych zwierząt przez co najmniej 52 dni.

Atenuowany wirus według wynalazku nie rozprzestrzenia się na cztery nie zaszczepione prosięta umieszczone razem z grupą ośmiu prosiąt zaszczepionych drogą domięśniową. Fakt że wirus nie przenosi się na zwierzęta nieszczepione ilustruje odpowiedniość atenuowanego wirusa jako szczepionki. Ponadto u zaszczepionych świń nie zaobserwowano leukopenii ani innych oznak klinicznych, co wskazuje że wirus jest także nieszkodliwy po podaniu drogą domięśniową. Już po 11 dniach od szczepienia średnio 86% zaszczepionych prosiąt stawało się seropozytywne.

Atenuowany wirus według wynalazku indukuje ochronną odpowiedź immunologiczną u zaszczepionych świń, chroniącą przed skutkami klinicznymi zakażenia zjadliwym szczepem PRRS. Zatem u 75% czterotygodniowych zaszczepionych prosiąt nie obserwowano po ich zakażeniu zjadliwym wirusem żadnych objawów klinicznych. Z drugiej strony, jak wynika z tabeli VI, u 80% niezaszczepionych prosiąt kontrolnych nastąpił po eksperymentalnym zakażeniu znaczny wzrost temperatury w odbycie. Ponadto w sekcji przeprowadzonej w 19 dni po eksperymentalnym zakażeniu w płucach prosiąt zaszczepionych wykryto znacznie mniej uszkodzeń niż u kontrolnych prosiąt nieszczepionych. W ten sam sposób, po eksperymentalnym zakażeniu zjadliwego wirusa znaleziono tylko u 25% zaszczepionych zwierząt, natomiast do co najmniej 12 dnia po zakażeniu można wykryć wirusa u 80% nieszczepionych zwierząt kontrolnych.

Tabela VI

Hipertermia u zwierząt szczepionych i nieszczepionych po zakażeniu

	Liczba prosiąt z hipertermią/ łączna liczba prosiąt	Liczba dni z hipertermią
Prosięta szczepione (droga domięśniowa)	1/4	1
Prosięta nieszczepione	4/5	8

Informacja o depozytach mikroorganizmów

Zgodnie z Traktatem Budapesztańskim szczep wirusowy i komórki Klon 8 według wynalazku złożono do depozytu w International Authority of the Collection Nationałe de Cultures de Microorganismes (CNCM) w Instytucie Pasteura, Paryż (Francja).

Oznaczenie u zgłaszającego Numer CNCM Data depozytu

VP-046-BIS 1-1642 23/11/95

Klon 8 1-1643 23/11/95

Depozyty te znajdują się w dyspozycji publicznej na warunkach określonych w Traktacie Budapesztańskim. Nie może to być interpretowane jako pozwolenie na stosowanie praktyczne niniejszego wynalazku, co stanowiłoby naruszenie praw zgłaszającego z niniejszego patentu.

185 841

Średnie miano Ab (IPMA) u prosiąt

Wiek prosiąt w dniach

Fig. 4

185 841

Fig. 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Atenuowany szczep wirusa powodującego chorobę świń znaną jako zespół rozrodczy i oddechowy świń (PRRS), odpowiadający zasadniczo depozytowi o numerze dostępu 11642 w CNCM w Instytucie Pasteura, złożonemu w dacie 23 listopada 1995.
2. Szczepionka zabezpieczająca dla świń przeciwko chorobie znanej jako zespół rozrodczy i oddechowy świń (PRRS), znamienna tym, że zawiera szczep wirusowy zastrzeżony wzastrz. 1 i/lub co najmniej jeden antygen wirusowy, który może być otrzymany z tego szczepu.
3. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że antygen wirusowy stanowi wirus inaktywowany.
4. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera między 10² a 10⁶ TCID₅₀atenuowanego szczepu wirusa.
5. Szczepionka według zastrz. 2 albo 3, znamienna tym, że dawka szczepionki zawiera ilość antygenu wirusowego równoważną ilości wytwarzanej przez między 10² a 10⁶ TCID₅₀atenuowanego szczepu wirusa.
6. Szczepionka według zastrz. 2 albo 3, albo 4, albo 5, znamienna tym, że zawiera dodatkowo adiuwanty immunostymulujące i/lub emulgatory i/lub stabilizatory.
7. Szczepionka według zastrz. 2 albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, znamienna tym, że zawiera dodatkowe wirusy świńskie żywe lub inaktywowane, w postaci pojedynczej lub łączone.
8. Szczepionka według zastrz. 2 albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, znamienna tym, że zawiera dodatkowo żywe lub inaktywowane bakterie.
9. Klon komórkowy pochodzący od stabilnej linii komórek nerki małpiej MA-104, odpowiadający zasadniczo depozytowi o numerze dostępu 1-1643 w CNCM w Instytucie Pasteura o dacie złożenia 23 listopada 1995.
10. Sposób otrzymywania atenuowanego wirusa PRRS, znamienny tym, że modyfikuje się szczep zjadliwy przez kolejne pasaże w klonie komórkowym zastrzeganym w zastrz. 9.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że w kolejnych pasażach utrzymuje się temperaturę 34°C.
12. Sposób otrzymywania aktywnej szczepionki przeciwko PRRS, znamienny tym, że przeprowadza się propagację szczepu wirusowego zastrzeganego w zastrz. 1 w klonie komórkowym zastrzeganym w zastrz. 9.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że propagację szczepu wirusowego przeprowadza się w temperaturze 34°C.
14. Sposób według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że otrzymany atenuowany szczep formułuje się w postaci dyspersji wodnych lub emulsji olejowych, kompozycji lipozomowych albo w postaci liofilizowanej, w obecności lub nie adiuwantów zastrzeganych w zastrz. 6.
15. Sposób według zastrz. 12 albo 13, albo 14, znamienny tym, że otrzymany atenuowany szczep inaktywuje się termicznie lub chemicznie do całkowitej inaktywacji.
16. Zestaw do diagnostyki PRRS, znamienny tym, że zawiera atenuowany szczep zastrzegany w zastrz. 1 i/lub co najmniej jeden antygen wirusowy z tego wirusa.
17. Sposób wykrywania przeciwciał PRRS, znamienny tym, że:

a) atenuowany szczep wirusowy zastrzegany w zastrz. 1 adaptuje się do namnażania w stabilnej hodowli komórkowej w mikropłytkach, zakażając każde wgłębienie mikropłytki około 20-40 cząstek infekujących;

b) ustala się zainfekowane, komórki do fazy stałej za pomocą znanych środków utrwalających;

185 841

c) wykrywa się przeciwciała z surowicy świńskiej przez inkubowanie ich w mikropły tkach i wybarwianie za pomocą techniki IPMA.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako stabilną hodowlę komórkową stosuje się klon komórkowy zastrzegany w zastrz. 9.
19. Zastosowanie atenuowanego szczepu wirusowego zastrzeganego w zastrz. 1 do wytwarzania szczepionek przeciwko chorobie świń znanej jako PRRS.
20. Zastosowanie atenuowanego szczepu wirusowego zastrzeganego w zastrz. 1 do wytwarzania zestawów diagnostycznych do wykrywania choroby świń znanej jako PRRS.

* * *