WO1997027288A1 - Nueva cepa atenuada del virus causante del sindrome respiratorio y reproductivo porcino (prrs), las vacunas y medios de diagnostico obtenibles con la misma y los procedimientos para su obtencion - Google Patents

Nueva cepa atenuada del virus causante del sindrome respiratorio y reproductivo porcino (prrs), las vacunas y medios de diagnostico obtenibles con la misma y los procedimientos para su obtencion Download PDF

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Pere Riera Pujadas
Narcis Saubi Roca
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Laboratorios Hipra, S.A.
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Definitions

  • the present invention relates to a new attenuated strain of the virus responsible for swine cattle disease known as porcine respiratory and reproductive syndrome (PRRS).
  • PRRS porcine respiratory and reproductive syndrome
  • the etiologic agent of PRRS is a small encapsulated RNA virus that was first isolated in the Netherlands, being named Lelystad virus and suggested belonging to the Arteriviridae group. Said virus is described in the PCT patent application WO-92/21375 and in the European patent EP-B-0587780 (Stichting Centraal Diegeneeskunding Institut), derived from the previous one, on the occasion of which a deposit of an isolate was made of said virus at the Institut Pasteur in Paris, with the number I-1102.
  • European patent application EP-A-0595436 (Solvay), describes a new strain of the American type, more virulent than the one initially described, as well as the vaccines obtainable therefrom; The strain has been deposited with the ATCC, but the deposit number is not indicated in the patent application.
  • Spanish patent application with publication number ES-A-2074950 (Cyanamid Ibérica) describes a so-called "Spanish strain” that presents differences with other European and American strains, deposited in the European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) with the number V93070108.
  • the incubation period of the disease is very variable, ranging from 5 to 37 days (I.B. Robertson Eurp. Comm. Seminar on PRRS, 11: 4-5 Brussels, 1991). Spread of the disease is sometimes very slow, but once established on a farm it can persist for months (B.Thacker, Int. Symp. On SIRS, St. Paul / Minnesota, 1992).
  • the PRRS virus is distributed throughout most of the countries where there is an important swine population.
  • inactive vaccines produced in porcine alveolar macrophage (MAP) crops produces acceptable results at the laboratory level, although their effectiveness in field conditions depends in part on the environmental and management conditions of vaccinated animals.
  • PRRS virus could only be replicated in porcine alveolar macrophage (MAP) cultures (Wensvoort G et al. In The Vet. Quart. 13: 121-130, 1991), with the consequent easement that entailed in having to use pigs of a certain age and free of other diseases to obtain them.
  • MAP porcine alveolar macrophage
  • obtaining MAP does not guarantee virus sensitivity of the PRRS, therefore, each lot must be assessed to determine its susceptibility. This implies a great difficulty in being able to produce batches of antigen of a constant and homogeneous quality, always starting from variable substrates from various animals.
  • PCT patent application WO-94/18311 proposes to propagate a certain strain of the PRRS virus, in a single clone, which it calls clone 9009B, derived from an African green monkey kidney cell line, called MA-104 (M ) by the patent applicant, from a commercial cell line known as MA-104.
  • MA-104 African green monkey kidney cell line
  • the object of the present invention is a new attenuated strain of PRRS virus that allows stable and reproducible vaccines to be obtained for pigs, with high effectiveness for the prevention of PRRS.
  • Another object of the present invention is a new cell clone derived from the stable monkey kidney cell line MA-104, capable of supporting the growth of PRRS virus at high titers and allowing obtaining stable viral crops of the strain. attenuated selected, as well as the procedure for obtaining said clone.
  • Another object of the present invention are vaccines effective against PRRS disease that can be obtained from a new attenuated strain or mutants thereof, as well as the method of obtaining it.
  • Still another object of the present invention are the means of diagnosis of the PRRS disease that can be obtained from the new attenuated strain or mutants thereof, as well as the method for obtaining it.
  • mutants of the new attenuated strain includes those natural and artificial variations of the new attenuated strain of the invention that retain the essential characteristics thereof and, in particular, that are suitable for the production of safe vaccines for pigs. effective in preventing PRRS or likely to be used in the diagnosis of said disease. DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • the attenuated strain of PRRS virus object of the present invention comes from the attenuation of a virulent strain isolated from infected pigs of a Spanish farm and, for the purposes of sufficiency of the description, a deposit of said attenuated strain has been made in the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) of the Institut Pasteur, which has assigned deposit number 1-1642. This deposit has been made on 11/23/95.
  • CNCM Collection Nationale de Cultures de Microorganismes
  • Viral strains that essentially correspond to the attenuated strain of PRRS causing virus deposited with access number 1-1642 fall within the scope of this invention.
  • the term "which essentially corresponds" includes the natural and artificial variations of the attenuated strain object of this invention that allow its detection by hybridization techniques, enzymatic amplification of the nucleic acid or serological techniques using specific materials of the strain object of this invention.
  • the attenuation of the virulent strain and the replication of the attenuated strain have been carried out by serial passes in a cell clone, object of the present invention and also called Clone-8 by the authors thereof, from a commercial kidney cell line of monkey known as MA-104. Also for the purposes of sufficiency of the description, on the same date as the deposit of the attenuated strain, a deposit of Clone-8 has been made at the CNMC of the Institut Pasteur, which has assigned the deposit number 1-1643 . Cell clones that correspond essentially to the deposited clone with access number 1-1643 fall within the scope of the present invention.
  • the term "which corresponds essentially” includes the natural and artificial variations of the attenuated strain object of the present invention that allow its detection by hybridization techniques, enzymatic amplification of nucleic acids or serological techniques using specific materials of the cell clone object of this invention.
  • a cloning of the MA-104 cell commercial line was first carried out, by means of suspension techniques in an appropriate growth medium, such as MEM Earles ("minimum essential medium”) Earles) and fetal bovine serum (FBS), plating the suspensions at different concentrations, selection and trypsinization of the clones and their expansion in culture bottles.
  • MEM Earles minimum essential medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Clone-8 was selected due to its high sensitivity for the replication of the viral strain (high DICT 50 ) and the reproducibility and consistency of the viral crops obtained therewith.
  • the virulent strain is attenuated by successive replications thereof in Clone-8 cultures, preferably at 34 ° C, determining the content of infective viral particles to observe the viability of replication, and studying the evolution of the cytopathic effect (ECP), in order to determine the degree of attenuation.
  • ECP cytopathic effect
  • the attenuated strain of PRRS virus object of the invention is consequently obtained in a stable and industrially reproducible manner, which facilitates its use in obtaining vaccines and diagnostic means of
  • the attenuated strain object of the invention shows a high capacity of replication in seronegative pigs, being able to replicate and induce seroconversion in inoculated animals with doses of only 200 TCID 50 intramuscularly, and persisting antibodies induced during period longer than 80 days.
  • the attenuated strain object of the invention constitutes an excellent basis for preparing vaccines for the preventive treatment of pigs against PRRS.
  • Said vaccines can be prepared by any procedure known to those skilled in the art and in different conventional ways such as aqueous dispersions, oily emulsions, liposomatic, lyophilized compositions, etc ...
  • Vaccine compositions can be completed with different adjuvant types, such as for example immunostimulants, emulsifiers, stabilizers, etc., and the vaccines admit their administration intramuscularly or subcutaneously. , intranasal route, intratracheal route, cutaneous, percutaneous or intracutaneous administration, etc.
  • the effective vaccine doses can be very variable, but preferably they can be between 10 2 and 10 6 TCID 50 of the attenuated strain object of the invention.
  • the vaccines obtained, also object of the present invention can also be formulated, as polyvalent vaccines, together with other live or inactivated swine viruses, or together with live or inactivated bacteria.
  • vaccines containing viral antigens generated from the viral strain of the invention can also be prepared, for example, vaccines containing said strain totally inactivated by any conventional method, for example thermal or chemical, or containing fragments of the capsule or RNA thereof, etc.
  • the attenuated strain object of the invention can also be used to prepare, by using conventional techniques, appropriate diagnostic means containing the antigenic elements capable of detecting the antibodies of the seropositive animals.
  • an IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay) procedure for the detection of PRRS antibodies may comprise the following steps:
  • Figure 1 shows a two-dimensional graph depicting the evolution of the rectal temperature in pregnant sows inoculated intranasally with the attenuated strain object of the present invention.
  • Figure 2 shows a two-dimensional graph depicting the weight evolution of piglets born from sows inoculated with the attenuated strain object of the present invention.
  • Figure 3 shows a two-dimensional graphic representing the kinetics of the calostral antibodies, determined by IPMA, in piglets from sows vaccinated with the attenuated strain object of the present invention.
  • the lowest titers of piglets in sows 1 and 10 on day 0 are due to the fact that some piglets had not yet taken colostrum at the time of blood collection.
  • Figure 4 shows a three-dimensional graph depicting the evolution of the humoral response in piglets inoculated intramuscularly with
  • Example 1 Obtaining cell clones of stable monkey kidney cell line MA-104.
  • the virulent strain was inoculated to the cell line at different multiplicities.
  • the yields obtained in the viral harvest were low (between 10 3 and 10 4 DICT 50 / ml) and in any case insufficient to be able to be used in vaccine production, even after making four adaptation passes.
  • the clonal selection was performed as follows:
  • a suspension of the cell line was diluted in MEM Earles medium with 20% FBS, then the different concentrations obtained in 96-well microplates (of the NUNC * trademark) were plated. These were incubated at 37 ° C with 5% C0 2 for 8 days. At 3 days the wells containing a single cell were selected by microscopic observation, and the clones were trypsinized at 8 days. In this way 44 clones were obtained. Subsequently, they were expanded in culture bottles until a suspension of 5 x 10 7 cells / ml was obtained. These cells were then subjected to a second and third cloning using the same procedure.
  • the clones obtained were expanded to obtain 25 ml of a cell suspension containing 6 x 10 6 cells of each one of the 44 clones obtained, always in medium containing 20% FBS.
  • the clones obtained in the previous example were assessed for their growth capacity, eliminating those that presented amplification difficulties and those that had an irregular behavior in their morphology or prolonged maintenance at 37 ° C. After making this previous selection, 35 clones were removed, selecting the remaining 9.
  • the uncloned cell line has a very low sensitivity to the virus, so its direct use is not viable in order to obtain effective vaccines.
  • the table also shows the increased sensitivity to the virus of some clones, including Clone-8, compared to the uncloned cell line. Highlights among all clones the Clone-8 that allows to obtain titers of 10 6 DICT 50 / ml of viral harvest. Thus, among the clones tested, Clone-8 is selected with which, as repeated tests carried out, reproducible and consistent viral harvests with titres between 10 5 and 10 7 DECD 50 / ml are obtained.
  • Example 3 Obtaining the attenuated viral strain.
  • the attenuated virus object of the invention is obtained by replication of the selected virulent virus to the Clone-8 cultures at 34 ° C.
  • Clone-8 monolayers infected with the virus were placed at 34 ° C until the time of the appearance of the cytopathic effect (ECP). This appeared in all cases between 24 or 48 hours later than when crops were used at 37 ° C. However, there are no substantial differences in the type of ECP observed on the cells after infection.
  • the viral crops obtained were titled in Clone-8, and an identity test was also carried out through IPMA.
  • the virus was inoculated to the almost confluent 75 cm 2 monolayers of Clone-8, allowing it to absorb for 2 hours at 34 ° C.
  • infection medium was added to the monolayer, consisting of a solution of MEM Earle with 10% FBS, previously heated to 34 ° C.
  • the viral crop was collected. This happened between the fifth and seventh day. Subsequently, the viral crop obtained was centrifuged at 2,000 tr / m and the supernatant was collected to determine the content of infective viral particles (DICT 50 / ml).
  • the results obtained confirm that the virus can replicate in Clone-8 at 34 ° C, without loss of viability, until it passes at least P-20.
  • Example 4 Biological characterization of the attenuated virus and effects of vaccination with it.
  • the virulent starting virus used to obtain the attenuated strain that is the object of the invention produces premature deliveries and the birth of weak, dead and / or mummified piglets in pregnant sows. Between 4 and 5 days post-infection, the sows have a slight anorexia and this is maintained for 3 - 5 days, also observing their dejection.
  • pigs of both sexes were used according to the type of assay to be performed.
  • a safety test was carried out on 3 seronegative sows to PRRS and from a small farm that had never suffered outbreaks of this disease. These were inoculated in the last third of pregnancy, when the sensitivity to the PRRS virus is maximum.
  • the attenuated virus was inoculated intranasally between 78 and 93 days of gestation, at the dose of 10 6 TCID 50 per sow. The sows did not experience any change in their physiological constants.
  • the rectal temperature was maintained within the parameters considered normal, as shown in Fig. 1, and the three sows gave birth on the expected date of delivery. Table IV shows the results obtained. Table IV Effects on offspring of attenuated virus inoculation.
  • Table V Effects of attenuated virus inoculation on reproductive parameters in pregnant sows, in the last third of pregnancy.
  • the attenuated virus object of the present invention has a high replication capacity in pigs seronegative to the PRRS virus, as evidenced by the fact that, administered intramuscularly, it is capable of replicating and inducing seroconversion with only 200 DICT 50 , persisting antibodies induced for a period of at least 52 days in inoculated animals, as shown in Figure 4.
  • the attenuated virus object of the present invention does not spread by being inoculated intramuscularly to a group of 8 piglets, by keeping them in contact with 4 non-inoculated piglets. This demonstrates the suitability of the virus as a vaccine strain by not spreading in unvaccinated animals. In addition, it does not produce any clinical sign in vaccinated animals or leukopenia, being also harmless by this route of inoculation. 86% of piglets are already seropositive after 11 days of inoculation.
  • the attenuated virus object of the invention is capable of inducing in immunized pigs an immune response that protects them from the clinical effects of an experimental infection with virulent virus.
  • 75% of the four-week-old piglets to whom the vaccine virus was administered did not experience any clinical symptoms when infected with virulent virus.
  • 80% of the unvaccinated control animals suffered a significant increase in temperature. rectal after experimental infection.
  • the results of the autopsy performed 19 days after the experimental infection showed significantly lower lung lesions in the vaccinated piglets, compared to the piglets of the unvaccinated control group.

Abstract

Se describe una nueva cepa atenuada (CNCM Institut Pasteur I-1642) del virus causante de la enfermedad del ganado porcino conocida como síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), así como un procedimiento de atenuación y replicación de la misma por medio del empleo de un nuevo clon obtenido a partir de células de riñón de mono MA-104 (CNCM Institut Pasteur I-1643). Debido a su inocuidad para los suidos y a su elevada actividad inmunogénica, la mencionada nueva cepa atenuada permite obtener vacunas y medios de diagnóstico que posibilitan un diagnóstico precoz del PRRS y un eficaz tratamiento preventivo de dicha enfermedad.

Description

NUEVA CEPA ATENUADA DEL VIRUS CAUSANTE DEL SÍNDROME RESPIRATORIO Y REPRODUCTIVO PORCINO (PRRS) . LAS VACUNAS Y MEDIOS DE DIAGNÓSTICO OBTENIBLES CON LA MISMA Y LOS PROCEDIMIENTOS PARA Sü OBTENCIÓN
D E S C R I P C I Ó N
CAMPO DE LA TÉCNICA
La presente invención se refiere a una nueva cepa atenuada del virus responsable de la enfermedad del ganado porcino conocida como síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS) . La replicación y atenuación de la cepa virulenta, mediante el empleo de un nuevo clon celular de riñon de mono, permite preparar vacunas y medios de diagnóstico que posibilitan un diagnóstico precoz del PRRS y un eficaz tratamiento preventivo de dicha enfermedad.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
En 1987 se detectó por primera vez en América del Norte una enfermedad del ganado porcino a la que se llamó "Mystery Swine Disease" o MSD (enfermedad misteriosa del cerdo) y, posteriormente, "Swine Infertility and Respiratory Syndrome" o SIRS (síndrome respiratorio y de infertilidad del cerdo) . Un síndrome muy parecido se detectó por primera vez en Europa central en 1990 y posteriormente se extendió a otros países europeos, incluyendo España. En Europa la enfermedad fue llamada en principio "Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome" o PEARS (síndrome epidémico porcino respiratorio y abortivo) y, finalmente, "Porcine Reproductive Respiratory Syndrome" o PRRS (síndrome respiratorio y reproductivo porcino) , nombre que se ha generalizado y que en la actualidad se utiliza universalmente para referirse a la enfermedad.
Ahora se sabe que el agente etiológico del PRRS es un pequeño virus de RNA encapsulado que fue aislado por primera vez en Holanda, siendo nombrado virus Lelystad y sugerida su pertenencia al grupo Arteriviridae. Dicho virus se encuentra descrito en la solicitud de patente PCT WO-92/21375 y en la patente europea EP-B-0587780 (Stichting Centraal Diegeneeskunding Instituut) , derivada de la anterior, con motivo de las cuales se efectuó un depósito de un aislado de dicho virus en el Institut Pasteur de París, con el número I- 1102.
Casi simultáneamente al aislamiento del virus del tipo europeo se produjo el aislamiento del virus del tipo norteamericano, tal como se describe en las solicitud de patente PCT WO-93/03760 (Collins et al.) y europea EP-A- 0529584 (Boehringer Ing.) y, con motivo de ello, se efectuó un deposito de un aislado de dicho virus en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) con el número VR-2332.
Los virus del tipo europeo y del tipo americano presentan claras diferencias, tanto en lo que se refiere a sus reacciones serológicas como en el grado de homología de las secuencias de nucleótidos de fragmentos significativos de su RNA. En las dos primeras páginas de la solicitud de patente europea EP-A-0676467 (Akzo) se efectúa una detallada descripción de dichas diferencias citando numerosas referencias bibliográficas. En dicha solicitud de patente se llega a la conclusión de que los tipos americano y europeo del virus han divergido claramente desde hace tiempo, lo que hace previsible que las eventuales vacunas efectivas contra alguno de dichos tipos sean poco o nada efectivas contra el otro.
Tanto en la rama europea del virus como de la americana se han aislado a su vez diferentes cepas, cada una con sus características específicas, que han dado lugar a varias solicitudes de patente. Así, por ejemplo, la solicitud de patente PCT W0-93/07898 (AJczo) describe una cepa europea, así como las vacunas obtenibles de la misma, depositada en el CNMC (Institut Pasteur) con el número 1-1140. La solicitud de patente PCT WO-93/14196 y la solicitud de patente europea EP-A-541418 (Rhóne- Merieux) , ambas procedentes de la misma solicitud prioritaria, describen una nueva cepa aislada en Francia depositada en el CNMC (Institut Pasteur) con el número I- 1153. La solicitud de patente europea EP-A-0595436 (Solvay) , describe una nueva cepa del tipo americano, más virulenta que la descrita inicialmente, así como las vacunas obtenibles de la misma; la cepa se ha depositado en la ATCC, pero en la solicitud de patente no se indica el número de depósito. Por último, la solicitud de patente española con número de publicación ES-A-2074950 (Cyanamid Ibérica) describe una denominada "cepa española" que presenta diferencias con otras cepas europeas y americanas, depositada en la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC) con el número V93070108.
Así pues, parece claro que el agente etiológico del PRRS presenta numerosas variedades que suponen la necesidad de disponer de diferentes tipos de vacunas con el objeto de poder combatir eficazmente la enfermedad en función del tipo de cepa vírica que infecte al ganado porcino. En las cerdas la enfermedad se caracteriza por la aparición de inapetencia, anorexia, trastornos reproductivos (abortos, partos prematuros, nacimiento de lechones muertos o débiles y muerte fetal, con o sin momificaciones) y, ocasionalmente, por la muerte de las cerdas infectadas. Un signo menos frecuente observado es la aparición de una coloración azul transitoria de las orejas, abdomen o vulva, por lo cual al principio la enfermedad se denominó en Holanda "Abortus blauw" y en Gran Bretaña "Blue Ear". En lechones los síntomas dependen de la edad. Así, en recién nacidos se aprecia disnea, temblores musculares y en grupos de edad más avanzada, se observa paresia posterior y ataxia. En el punto álgido del brote la mortalidad durante los primeros días es escasa, pero a los 10 días de edad puede alcanzar al 80% de los lechones. Los cerdos de engorde infectados temporalmente comen menos y muestran problemas respiratorios.
El período de incubación de la enfermedad es muy variable, oscilando desde 5 a 37 días (I.B. Robertson Eurp. Comm. Seminar on PRRS, 11 : 4-5 Brussels, 1991) . La diseminación de la enfermedad es a veces muy lenta, pero una vez establecida en una granja puede persistir durante meses (B.Thacker, Int. Symp. on SIRS, St. Paul/Minnesota, 1992) .
Se ha detectado la presencia de anticuerpos frente al virus, mediante la técnica de Inmunoperoxidasa o IMPA (Immunoperoxidase monolayer assay) , tal como ha sido descrito por Wensvoort G. et al. en The Vet. Quart. 13:121-130, 1991), en el día 6 post-infección, alcanzando títulos de 1/20.000 cinco días más tarde y persistiendo generalmente, por encima de los 12 meses, aunque algunos cerdos se volvían seronegativos a los 4 - 5 meses (V. Ohlinger et al. Meredith, M. De. Pig Dis. Info. Center Cambridge Dec. 1992) . Estos mismos autores consiguieron aislar el virus de distintos órganos tras la infección, e incluso a títulos de 104 DICT50 (dosis infectiva del cultivo de tejidos 50%) a las 6 semanas post infección, en homogenados de pulmón, suero, plasma y células sanguíneas; es decir, virus y anticuerpos pueden persistir conjuntamente varias semanas. Es bien sabido además, que animales recuperados de un brote pueden servir como fuente de infección para cerdos susceptibles. La viremia se puede detectar el día 1 post-infección y puede durar hasta 56 días, aunque suele ser de más corta duración.
Uno de los lugares a los que puede llegar el virus tras su diseminación hematógena es a la placenta, en el caso de las hembras gestantes. Se ha demostrado que el virus es capaz de atravesarla y producir la muerte de los fetos, mostrando una máxima susceptibilidad en el último tercio de la gestación. El virus es capaz de multiplicarse en los fetos sin producir la muerte de los mismos. Sin embargo, no se han podido aislar en ningún caso fetos momificados o autolisados.
En los lechones, la aparición de la enfermedad se produce cuando ha disminuido el nivel de anticuerpos maternales ingeridos por el calostro. Entre los lechones nacidos vivos, procedentes de madres infectadas en el último tercio de la gestación, se han observado casos de animales que ya presentan anticuerpos frente al virus antes de mamar el calostro. Estos animales suelen presentar también viremia en el momento del nacimiento (C. Terpstra et al. Vet. Q. , 13: 131 - 136, 1991).
A pesar de destruir un alto número de macrófagos no se ha podido demostrar de una forma clara la acción inmunosupresora del virus causante del PRRS. Sin embargo, con frecuencia presentan infecciones secundarias asociadas que tiene graves repercusiones económicas en las granjas de ganado porcino.
Actualmente, el virus del PRRS se halla distribuido por la mayor parte de los países donde existe una importante población porcina.
Las pérdidas económicas, tanto directas como indirectas debido a la acción de agentes secundarios resultantes de la acción de virus del PRRS, sitúan a la enfermedad entre las más importantes de las que afectan actualmente al sector porcino.
La utilización de vacunas inactivas producidas en los cultivos de macrófagos alveolares porcinos (MAP) produce resultados aceptables a nivel de laboratorio, aunque su eficacia en condiciones de campo depende en parte de las condiciones ambientales y de manejo de los animales vacunados.
Uno de los problemas que ha dificultado la obtención de inmunológicos contra el virus del PRRS ha sido la escasa disponibilidad de substratos estables para la replicación del virus.
Hasta hace poco, solamente se podía replicar virus del PRRS en cultivos macrófacos alveolares porcinos (MAP) (Wensvoort G et al. en The Vet. Quart. 13:121-130, 1991), con la consiguiente servidumbre que ello conllevaba al tener que utilizar para su obtención cerdos de una determinada edad y libres de otras enfermedades. Además, la obtención de MAP no garantiza la sensibilidad al virus del PRRS, por lo cual, cada lote debe valorarse para determinar su susceptibilidad. Ello implica una gran dificultad para poder producir lotes de antígeno de una calidad constante y homogénea al partir siempre de substratos variables procedentes de diversos animales.
Por todo ello, la reducida disponibilidad de substratos celulares estables y continuos ha dificultado seriamente el estudio de estrategias para la obtención de mutantes basados en la propagación de virus del PRRS en los mismos, con la finalidad de seleccionar las variantes atenuadas.
Uno de los problemas más graves a resolver consiste en la neutralización de la acción del virus virulento, evitando la replicación del mismo en los MAP a los cuales destruye.
En consecuencia, la adaptación de un virus a un substrato estable, procedente de una línea celular transformada permitiría disponer de un medio adecuado, tanto para la obtención de mutantes atenuados como para la preparación de vacunas inactivas, eliminando la dependencia y variabilidad de los MAP.
La solicitud de patente PCT WO-94/18311 (Miles) propone propagar una determinada cepa del virus PRRS, en un clon único, que denomina clon 9009B, derivado de una línea celular de riñon de mono verde africano, denominada MA-104(M) por el solicitante de la patente, procedente de una línea celular comercial conocida como MA-104. En la solicitud de patente no consta depósito de dicho clon único, lo que dificulta su ejecución y reproducción. OBJETO DE LA INVENCIÓN
El objeto de la presente invención es una nueva cepa atenuada del virus del PRRS que permite obtener de forma estable y reproducible vacunas inocuas para el ganado porcino, con una alta efectividad para la prevención del PRRS.
Otro objeto de la presente invención consiste en un nuevo clon celular derivado de la línea celular estable de riñon de mono MA-104, capaz de soportar el crecimiento de virus del PRRS a títulos elevados y de permitir la obtención de cosechas víricas estables de la cepa atenuada seleccionada, así como el procedimiento de obtención de dicho clon.
Otro objeto de la presente invención son las vacunas eficaces contra la enfermedad PRRS que se pueden obtener a partir de una nueva cepa atenuada o de mutantes de la misma, así como el procedimiento de su obtención.
Todavía otro objeto de la presente invención son los medios de diagnóstico de la enfermedad PRRS que se pueden obtener a partir de la nueva cepa atenuada o de mutantes de la misma, así como el procedimiento para su obtención.
El término "mutantes de la nueva cepa atenuada"incluye aquellas variaciones naturales y artificiales de la nueva cepa atenuada de la invención que conservan las características esenciales de la misma y, en particular, que son adecuadas para la producción de vacunas inocuas para el ganado porcino eficaces en la prevención del PRRS o susceptible de ser utilizadas en el diagnóstico de dicha enfermedad. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La cepa atenuada de virus del PRRS objeto de la presente invención procede de la atenuación de una cepa virulenta aislada de cerdos infectados de una granja española y, a los efectos de la suficiencia de la descripción, se ha efectuado un depósito de dicha cepa atenuada en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) del Institut Pasteur, que le ha asignado el número de depósito 1-1642. Dicho depósito se ha efectuado en fecha 23/11/95.
Quedan comprendidas dentro del ámbito de esta invención las cepas virales que corresponden esencialmente a la cepa atenuada del virus causante de PRRS depositada con el número de acceso 1-1642. La expresión "que corresponde esencialmente" incluye las variaciones naturales y artificiales de la cepa atenuada objeto de esta invención que permiten su detección mediante técnicas de hibridación, amplificación enzimática del ácido nucleico o técnicas serológicas utilizando materiales específicos de la cepa objeto de esta invención.
La atenuación de la cepa virulenta y la replicación de la cepa atenuada se han efectuado mediante pases seriados en un clon celular, objeto también de la presente invención y denominado Clon-8 por los autores de la misma, procedente de una línea celular comercial de riñon de mono conocida como MA-104. También a los efectos de la suficiencia de la descripción, en la misma fecha que el depósito de la cepa atenuada, se ha efectuado un depósito del Clon-8 en la CNMC del Institut Pasteur, que le ha asignado el número de depósito 1-1643. Quedan comprendidos dentro del ámbito de la presente invención los clones celulares que corresponden esencialmente al clon depositado con el número de acceso 1-1643. La expresión "que corresponde esencialmente" incluye las variaciones naturales y artificiales de la cepa atenuada objeto de la presente invención que permiten su detección mediante técnicas de hibridación, amplificación enzimática de ácidos nucleicos o técnicas serológicas utilizando materiales específicos del clon celular objeto de esta invención.
Para proceder a la selección y aislamiento del Clon-8 se procedió en primer lugar a una clonación de la línea comercial celular MA-104, mediante técnicas de suspensión en un medio de crecimiento apropiado, como por ejemplo MEM Earles ("mínimum essential médium" de Earles) y suero fetal bovino (FBS) , plaqueado de las suspensiones a distintas concentraciones, selección y tripsinización de los clones y expansión de los mismos en frascos de cultivo. Los clones obtenidos se sometieron a clonaciones sucesivas, utilizando las mismas técnicas, hasta obtener clones bien diferenciados.
Después de eliminar los clones que manifestaban un comportamiento irregular o presentaban dificultad para su amplificación, se ensayaron los clones seleccionados respecto a su capacidad de ser infectados con la cepa virulenta del virus del PRRS de partida. El Clon-8 se seleccionó debido a su elevada sensibilidad para la replicación de la cepa vírica (elevado DICT50) y a la reproducibilidad y consistencia de las cosechas víricas obtenidas con el mismo.
La cepa virulenta se atenúa mediante replicaciones sucesivas de la misma en cultivos de Clon-8, preferiblemente a 34°C, determinando el contenido en partículas víricas infectivas para observar la viabilidad de la replicación, y estudiando la evolución del efecto citopático (ECP) , con el fin de determinar el grado de atenuación. De acuerdo con los resultados obtenidos, el virus puede replicarse en Clon-8, sin pérdida de viabilidad, por lo menos durante 20 pases, y la atenuación conseguida hace que el virus resulte prácticamente inocuo sin pérdida de su actividad antigénica.
La cepa atenuada de virus del PRRS objeto de la invención se obtiene, consecuentemente, de manera estable y reproducible industrialmente, lo que facilita su empleo en la obtención de vacunas y medios de diagnóstico del
PRRS.
Los ensayos comparativos entre grupos de cerdos infectados con la cepa virulenta y con la cepa atenuada muestran con toda claridad la inocuidad de la cepa atenuada para los animales infectados con la misma. Por otra parte, la cepa atenuada objeto de la invención muestra una alta capacidad de replicación en cerdos seronegativos, siendo capaz de replicarse e inducir seroconversión en los animales inoculados con dosis de tan sólo 200 DICT50 por vía intramuscular, y persistiendo los anticuerpo inducidos durante período superior a 80 días.
En consecuencia, la cepa atenuada objeto de la invención constituye una base excelente para preparar vacunas para el tratamiento preventivo del ganado porcino contra el PRRS. Dichas vacunas se pueden preparar mediante cualquier procedimiento de los conocidos por el experto y en diferentes forma convencionales tales como dispersiones acuosas, emulsiones oleosas, composiciones liposomáticas, liofilizados, etc... Las composiciones vacunales pueden estar completadas con distintos tipos adyuvantes, tal como por ejemplo inmunoestimulantes, emulsificadores, estabilizadores, etc., y las vacunas admiten su administración por vía intramuscular o subcutánea, vía intranasal, vía intratraqueal, administración cutánea, percutánea o intracutánea, etc.
Las dosis efectivas vacunales pueden ser muy variables, pero de manera preferida pueden estar comprendidas entre 102 y 106 DICT50 de la cepa atenuada objeto de la invención.
Las vacunas obtenidas, también objeto de la presente invención, pueden ser también formuladas, como vacunas polivalentes, junto con otros virus porcinos vivos o inactivados, o bien junto con bacterias vivas o inactivadas.
Como resulta obvio para el experto, también se pueden preparar vacunas que contengan antígenos víricos generados a partir de la cepa vírica de la invención, por ejemplo, vacunas que contenga dicha cepa totalmente inactivada mediante cualquier método convencional, por ejemplo térmico o químico, o bien que contengan fragmentos de la cápsula o del RNA de la misma, etc.
La cepa atenuada objeto de la invención puede ser utilizada también para preparar, mediante el empleo de técnicas convencionales, medios de diagnóstico apropiados que contengan los elementos antigénicos capaces de detectar los anticuerpos de los animales seropositivos. Así, por ejemplo, un procedimiento de IPMA (Inmunoperoxidase monolayer assay) para la detección de anticuerpos de PRRS puede comprender los siguientes pasos:
a) Adaptación del virus atenuado objeto de la invención a un cultivo celular estable, preferiblemente de Clon-8, en una microplaca de cultivo de forma que cada pocilio sea infectado con aproximadamente 20-40 partículas infectivas.
b) Fijación de las células infectadas al soporte sólido con fijadores conocidos.
c) Detección de anticuerpos de sueros porcinos mediante incubación de los mismos en la microplaca con posterior tinción mediante técnicas de IPMA.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Acompañan a la presente descripción, como parte integrante de la misma, dos hojas con cuatro dibujos en los que, con carácter ilustrativo y no limitativo, se representa lo siguiente:
La figura 1 muestra un gráfico en dos dimensiones en el que se representa la evolución de la temperatura rectal en cerdas gestantes inoculadas por vía intranasal con la cepa atenuada objeto de la presente invención.
La figura 2 Muestra un gráfico en dos dimensiones en el que se representa la evolución ponderal de los lechones nacidos de cerdas inoculadas con la cepa atenuada objeto de la presente invención.
La figura 3 muestra un gráfico en dos dimensiones en el que se representa la cinética de los anticuerpos calostrales, determinada por IPMA, en lechones procedentes de cerdas vacunadas con la cepa atenuada objeto de la presente invención. Los títulos más bajos de los lechones de las cerdas 1 y 10 en el día 0 se deben a que algunos lechones no habían tomado aún el calostro en el momento de efectuarse la extracción de sangre.
La figura 4 muestra un gráfico en tres dimensiones en el que se representa la evolución de la respuesta humoral en lechones inoculados por vía intramuscular con
200, 2.000 y 20.000 DICT50 de la cepa atenuada objeto de la presente invención.
EJEMPLOS
A continuación, con el objeto de ilustrar con más precisión la descripción de la presente invención, se exponen unos ejemplos de realización que no deben ser considerados como limitativos del objeto de la misma.
Ejemplo 1. Obtención de clones celulares de linea celular estable de riñon de mono MA-104.
Utilizando una línea celular estable de riñon de mono MA-104 suministrada por la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC) , número de depósito 85102918, se efectuaron seis pases de la cepa virulenta de PRRS seleccionada, en medio MEM Earles con un 10% de Suero Fetal Bovino (FBS) , a 37°C, en ausencia de C02 en frascos de cultivo de plástico, en monocapa con cultivo estático, recogiendo la cosecha vírica en cada pase entre los 6 y 7 días post-inoculación.
Con el fin de estudiar los rendimientos de cosecha obtenidos, la cepa virulenta fue inoculada a la línea celular a distintas multiplicidades. Los rendimientos obtenidos en la cosecha vírica fueron bajos (entre 103 y 104 DICT50/ml) y en todo caso insuficientes para poderse utilizar en la producción vacunal, aun después de realizar cuatro pases de adaptación.
En estos ensayos se comprobó que, en todo caso, solo una parte de las células infectadas era permisible al virus virulento, permaneciendo el resto refractario a la infección. Por ello, se efectuó un clonaje de esta línea con el fin de seleccionar aquellas poblaciones celulares permisibles totalmente a la cepa virulenta.
La selección clonal se realizó de la siguiente forma:
Se procedió a la dilución de una suspensión de la línea celular en medio MEM Earles con un 20% de FBS procediéndose a continuación a plaquear las distintas concentraciones obtenidas en microplacas de 96 pocilios (de la marca comercial NUNC*) . Estas se incubaron a 37°C con un 5% de C02 durante 8 días. A los 3 días se seleccionaron mediante observación microscópica los pocilios que contenían una sola célula, procediéndose a tripsinizar los clones a los 8 días. De esta forma se obtuvieron 44 clones. Seguidamente se procedió a la expansión de los mismos en frascos de cultivo hasta la obtención de una suspensión de 5xl07 celúlas/ml. Estas células fueron sometidas a continuación a una segunda y tercera clonación utilizando el mismo procedimiento.
Después del tercer clonaje, se procedió a expansionar los clones obtenidos hasta obtener 25 mi de una suspensión celular que contenía 6xl06 células de cada uno de los 44 clones obtenidos, siempre en medio que contenía un 20% de FBS.
Estos clones se sometieron a un proceso de selección basado en las características de crecimiento y viabilidad de los mismos.
Ejemplo 2 Selección del clon celular Clon-8.
Los clones obtenidos en el ejemplo anterior se valoraron en cuanto a su capacidad de crecimiento, eliminándose aquellos que presentaban dificultades de amplificación y los que tenían un comportamiento irregular en su morfología o mantenimiento prolongado a 37°C. Después de efectuar esta selección previa se eliminaron 35 clones, seleccionando los 9 restantes.
A partir de una suspensión de la cepa virulenta de virus PRRS propagada anteriormente 8 veces (P-8) en cultivos de MAP (tal como se describe en Bloemberg, M. et al. Vet. Microb. 42,361 - 371, 1994), se infectaron los clones celulares seleccionados, efectuando previamente un proceso de adaptación del virus a los mismos. Esta adaptación consistió en la replicación del virus a 37° durante 3 pases. Para ello, las monocapas en un 80% - 100% de confluencia se mantuvieron en contacto con la suspensión vírica durante 6 días, pasados los cuales, se congelaron a -80°C, descongelándose a las 24 horas.
Como medio de infección se utilizo MEM Earle suplementado con un 10% de FBS y gentamicina (0,4 mg/ml) . No se emplearon antifüngicos ni antilevaduras. Las cosechas víricas así obtenidas fueron tituladas cada una de ellas en el respectivo clon celular. Analizados los resultados, se observó que los 9 clones eran permisibles al virus alcanzándose títulos superiores o iguales a 104'2 DICT50/ml. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla I.
Tabla I. Sensibilidad de los clones celulares obtenidos respecto de la cepa virulenta seleccionada.
Figure imgf000019_0001
Tal como puede observarse en la tabla I, la línea celular no clonada presenta una sensibilidad muy baja al virus por lo que su utilización directa no resulta viable de cara a la obtención de vacunas efectivas. La tabla muestra también la mayor sensibilidad al virus de algunos clones, entre ellos el Clon-8, en comparación con la línea celular no clonada. Destaca entre todos los clones el Clon-8 que permite obtener títulos de 106 DICT50/ml de cosecha vírica. Así pues, de entre los clones ensayados, se selecciona el Clon-8 con el que, según muestran repetidos ensayos efectuados, se obtienen de forma reproducible y consistente cosechas víricas con títulos comprendidos entre 105 y 107 DICT50/ml.
Ejemplo 3 Obtención de la cepa vírica atenuada.
El virus atenuado objeto de la invención se obtiene mediante replicación del virus virulento seleccionado a los cultivos de Clon-8 a 34°C.
Las monocapas del Clon-8 infectadas con el virus, se colocaron a 34°C hasta el momento de la aparición del efecto citopático (ECP) . Éste apareció en todos los casos entre 24 u 48 horas más tarde que cuando se utilizan cultivos a 37°C. Sin embargo, no se aprecian diferencias sustanciales en cuanto al tipo de ECP observado sobre las células después de la infección.
Las cosechas víricas obtenidas fueron tituladas en Clon-8, efectuándose además una prueba de identidad mediante IPMA.
El virus fue inoculado a las monocapas de 75 cm2 de superficie casi confluentes de Clon-8, dejándose absorber durante 2 horas a 34°C. Seguidamente, se añadió medio de infección sobre la monocapa, consistente en una solución de MEM Earle con 10% de FBS, previamente calentado a 34°C.
A continuación, el frasco de 75 cm2 se colocó a
34°C y se observo diariamente hasta la aparición del ECP.
Cuando el ECP afectó a un 80-95% de la monocapa celular se recogió la cosecha vírica. Esto ocurrió entre el quinto y el séptimo día. Posteriormente, la cosecha vírica obtenida se centrifugó a 2.000 tr/m y se recogió el sobrenadante para determinar el contenido en partículas víricas infectivas (DICT50/ml) .
Siguiendo esta metodología se efectuaron 20 pases, valorándose el contenido vírico en los pases P.l, P.5, P.10, P.15, y P.20 que se representan en la tabla II
Tabla II. Evolución del virus propagado en Clon-8 a 34°C del pase 1 (P.l) al pase 20 (P.20) .
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Resultados posteriores confirman que las monocapas de Clon-8 pueden infectarse con una multiplicidad de infección (m.o.i) de 0,001.
Los resultados obtenidos confirman que el virus puede replicarse en Clon-8 a 34°C, sin pérdida de viabilidad, hasta su pase P-20 como mínimo.
Sin embargo, la cepa vírica obtenida en su pase P-20 resulta ser inocua para los animales, tal como se muestra en los ejemplos posteriores. Ejemplo 4 Caracterización biológica del virus atenuado y efectos de la vacunación con el mismo.
El virus virulento de partida utilizado para obtener la cepa atenuada objeto de la invención produce en cerdas gestantes partos prematuros y nacimiento de lechones débiles, muertos y/o momificados. Entre los 4 y los 5 días post-infección, las cerdas cursan con una ligera anorexia y ésta se mantiene durante 3 - 5 días, observándose también abatimiento de las mismas.
Cuatro cerdas gestantes (referencias 01, 02, 03 y 06) se infectaron por vía intranasal con 106*6 DICT50 de virus virulento de partida y se observaron los efectos producidos, comparativamente con dos cerdas testigo (referencias 73 y 74) . Los resultados obtenidos se muestran en la tabla III.
Tabla III Efecto sobre la descendencia de la inoculación del virus virulento a cerdas gestantes.
Figure imgf000022_0001
Sólo una cerda infectada parió en la fecha prevista para el parto. Las cerdas infectadas parieron 2, 0, 5 y 6 mortinatos y 2, 3, 2 y 1 lechones débiles respectivamente, los cuales murieron en los días siguientes. Sólo llegaron al destete una media de 6,5 lechones por cerda infectada, mientras que esta cifra era de 11 en el caso de las cerdas testigo. El peso medio de los lechones procedentes de cerdas infectadas era, en el destete, de 4.621 gramos, mientras que el de las cerdas testigo era de 5.365 gramos. A partir de macerados de pulmones de los lechones nacidos débiles se aisló virus virulento de PRRS. Después de la infección experimental todas las cerdas seroconvirtieron, así como todos los lechones procedentes de las madres infectadas.
Para la caracterización biológica de la cepa de virus atenuado objeto de la invención se utilizaron cerdos de ambos sexos según el tipo de ensayo a realizar. Se efectuó una prueba de inocuidad en 3 cerdas seronegativas a PRRS y procedentes de una pequeña granja que jamás había padecido brotes de esta enfermedad. Éstas fueron inoculadas en el último tercio de la gestación, cuando la sensibilidad al virus del PRRS es máxima. El virus atenuado fue inoculado por vía intranasal entre los 78 y los 93 días de gestación, a la dosis de 106 DICT50 por cerda. Las cerdas no experimentaron ningún cambio en sus constantes fisiológicas. La temperatura rectal se mantuvo dentro de los parámetros considerados como normales, tal como se muestra en la Fig. 1, y las tres cerdas parieron en la fecha prevista del parto. En la tabla IV se muestran los resultados obtenidos. Tabla IV Efectos sobre la descendencia de la inoculación del virus atenuado.
Figure imgf000024_0001
En los tres partos nacieron 13, 4 y 16 lechones con una vitalidad considerada como normal. Aunque se observaron fetos momificados en el parto de 2 cerdas, este hecho puede considerarse como normal debido al gran número de lechones que parieron las cerdas seleccionadas. La evolución ponderal de los lechones fue, en todos los casos, normal hasta el final del período de observación (45 días de edad), tal como se muestra en la figura 2. Ninguno de los lechones presentaba signos de debilidad o trastornos que pudieran asociarse a PRRS. En los análisis virológicos en ningún caso se detectó virus del PRRS a partir de muestras de sangre y de suero de los lechones nacidos.
Tampoco se aislaron virus a partir de las muestras de sangre y suero de las cerdas a los 21-36 días de su inoculación. Ello confirma la inocuidad de la cepa atenuada en hembras gestantes, las cuales presentan una mayor susceptibilidad al virus del PRRS. Todos los sueros de los lechones procedentes de las cerdas inoculadas fueron negativos a la presencia del virus PRRS después de efectuarse el cultivo en MAP, utilizando técnicas convencionales. Las 3 cerdas inoculadas con el virus atenuado presentaban títulos de anticuerpos humorales de 1/480 por IPMA a los 45 días del parto. Estos se habían mantenido estables desde este día con pequeñas oscilaciones. Las cerdas ya eran seropositivas a los 21 días de la inoculación. Los lechones procedentes de las cerdas inoculadas eran seropositivos desde el momento de tomar el calostro hasta como mínimo los 75 días de edad, tal como se muestra en la figura 3.
Además, se efectuó una prueba de inocuidad en otro grupo de 12 cerdas gestantes, en el último tercio de la gestación, ocho de las cuales fueron vacunadas por vía intramuscular con 39 dosis vacunales quedando las cuatro restantes como grupo testigo con el fin de evaluar los efectos de la cepa vacunal sobre los parámetros reproductivos. Las cerdas no experimentaron ningún cambio en sus constantes fisiológicas y parieron en las fechas previstas. Los resultados se muestran en la tabla V.
Tabla V. Efectos de la inoculación de virus atenuado sobre los parámetros reproductivos en cerdas gestantes, en el último tercio de la gestación.
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Figure imgf000026_0002
CΛ O ≥ Sí
4-,
Como se observa en la citada tabla V, tanto las ocho cerdas inoculadas como las cuatro cerdas testigo parieron un número de lechones considerado como normal, con una vitalidad también considerada como normal.
El virus atenuado objeto de la presente invención posee una alta capacidad de replicación en cerdos seronegativos al virus del PRRS, tal como lo demuestra el hecho de que, administrado por vía intramuscular, es capaz de replicarse e inducir seroconversión con tan solo 200 DICT50, persistiendo los anticuerpos inducidos por un período de al menos 52 días en los animales inoculados, tal como se muestra en la figura 4.
El virus atenuado objeto de la presente invención no difunde al ser inoculado por vía intramuscular a un grupo de 8 lechones, al mantener a éstos en contacto con 4 lechones no inoculados. Ello demuestra la idoneidad del virus como cepa vacunal al no difundir en animales no vacunados. Además no produce ningún signo clínico en los animales vacunados ni leucopenia, mostrándose inocuo también por esta vía de inoculación. El 86% de los lechones son ya seropositivos a los 11 días de la inoculación.
Asimismo, el virus atenuado objeto de la invención es capaz de inducir en cerdos vacunados una respuesta inmune que protege a los mismos de los efectos clínicos de una infección experimental con virus virulento. Así el 75% de los lechones de cuatro semanas a los que se administró el virus vacunal no experimentó ninguna sintomatología clínica al ser infectados con virus virulento. Por el contrario, tal como se muestra en la tabla VI, el 80% de los animales testigo no vacunados sufrió un incremento significativo de su temperatura rectal después de la infección experimental. Además, los resultados de la necropsia realizada a los 19 días de la infección experimental mostraron lesiones pulmonares significativamente inferiores en los lechones vacunados, en comparación a los lechones del grupo testigo no vacunado.
Tabla VI Incidencia en la hipertermia de lechones vacunados y testigo después de la infección experimental
Figure imgf000028_0001
Asimismo solo se aisló virus virulento en el 25% de los cerdos vacunados sometidos a la infección experimental, mientras que en los cerdos testigos no vacunados dicho virus virulento persistió en el 80% de los animales como mínimo hasta los 12 días post¬ infección.
Información sobre el depósito de microorganismos
Los depósitos de la cepa vírica y el clon celular objeto de la presente invención se han efectuado, conforme a las provisiones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes, en la Autoridad Internacional de Depósito Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) del Institut Pasteur, París (Francia) .
Identificación Número CNCM Fecha del del solicitante depósito
VP-046-BIS 1-1642 23/11/95
Clon-8 1-1643 23/11/95
Los depósitos efectuados están a disposición del público bajo las condiciones previstas en el mencionado Tratado de Budapest y dicha disponibilidad no se debe interpretar como una licencia para practicar el objeto de la presente invención infringiendo los derechos del solicitante de la presente patente.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S
I».- La cepa aislada del virus causante de la enfermedad del ganado porcino conocida como síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS) que corresponde esencialmente al depósito con número de acceso 1-1642 efectuado el 23/11/95 en el CNCM del Institut Pasteur.
2a.- Una vacuna para la protección del ganado porcino contra la enfermedad conocida como síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS) , caracterizada porque contiene la cepa vírica de la reivindicación ia y/o al menos un antígeno vírico obtenible de la misma.
3a.- Una vacuna, de acuerdo con las reivindicación 28, caracterizada porque el antígeno vírico es el virus inactivado.
4a.- Una vacuna, de acuerdo con la reivindicación
2*, caracterizada porque cada dosis vacunal contiene entre 102 y 106 DICT50 de la cepa vírica atenuada.
5*.- Una vacuna, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2* ó 3a, caracterizada porque la dosis vacunal contiene una cantidad de antígeno vírico equivalente a la que producen entre 102 y 106 DICT50 de la cepa vírica atenuada.
6a.- Una vacuna, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2» a 5a, caracterizada porque además contiene adyuvantes inmunoestimulantes y/o emulsificadores y/o estabilizadores.
7a.- Una vacuna, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2a a 6a, caracterizada porque además contiene otros virus porcinos vivos o inactivados, solos o combinados.
8a.- Una vacuna, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2a a 6a, caracterizada porque además contiene bacterias vivas o inactivadas.
9a.- El clon celular derivado de la línea celular estable de riñon de mono MA-104 que corresponde esencialmente al depósito con número de acceso 1-1643 efectuado el 23/11/95 en el CNCM del Institut Pasteur.
loa.- Un procedimiento para la obtención de una cepa atenuada del virus PRRS, caracterizado porque consiste esencialmente en la modificación de una cepa virulenta mediante pases sucesivos en el clon celular de la reivindicación 9a.
lia.- un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 10β, caracterizado porque los sucesivos pases se efectúan a la temperatura de 34°C.
12a.- Un procedimiento para la preparación de una vacuna activa contra el PRRS, caracterizado porque consiste esencialmente en propagar la cepa vírica de la reivindicación la en el clon celular de la reivindicación
9a.
13a.- Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 12a, caracterizado porque la propagación de la cepa vírica se efectúa a 34°C.
14a.- Un procedimiento, de acuerdo con las reivindicaciones 12a ó 13a, caracterizado porque la cepa atenuada obtenida se formula en forma de dispersiones acuosas o emulsiones oleosas, composiciones liposomáticas o liofilizados, con presencia o no de los adyuvantes de la reivindicación 6a.
15a.- Un procedimiento, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12a a 14a, caracterizado porque la cepa atenuada obtenida se inactiva térmica o químicamente hasta su inactivación total.
16a.- un medio de diagnóstico del PRRS, caracterizado por contener la cepa vírica de la reivindicación la y/o al menos un antígeno vírico obtenible de la misma.
17a.- Un procedimiento para detectar anticuerpos de PRRS que comprende las siguientes etapas:
a) Adaptación de la cepa atenuada de la reivindicación ia a un cultivo celular estable en una microplaca de cultivo de forma que cada pocilio sea infectado con aproximadamente 20-40 partículas infectivas.
b) Fijación de las células infectadas al soporte sólido con fijadores conocidos.
c) Detección de anticuerpos de sueros porcinos mediante incubación de los mismos en la microplaca con posterior tinción mediante técnicas de IPMA.
18a.- Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 17a, en el que el cultivo de vacunas estable es el clon celular de la reivindicación 9a. 19a.- La utilización de la cepa vírica atenuada de la reivindicación Ia en la fabricación de vacunas para combatir la enfermedad del ganado porcino conocida como PRRS.
20a.- La utilización de la cepa vírica atenuada de la reivindicación la en la fabricación de medios de diagnóstico para detectar la enfermedad del ganado porcino conocida como PRRS.
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