HU176307B - Eljárás juh adenovirus által okozott betegségek elleni védekezésre használható inaktivált bivalens vakcina előállítására - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás juh adenovirus által okozott betegségek elleni védekezésre használható inaktivált bivalens oltóanyag előállítására.

A juhtenyésztésben az intenzív tartási viszonyok, illetve az iparszeríí tenyésztési rendszerek elterjedésével nagy termelőképességű, de kisebb természetes ellenállóképességű fajták bárányainak hizlalására tértek át. Ekkor eddig ismeretlen vírusos megbetegedések jelentkeztek. A betegséget a bárányok vírusos tüdő-bélgyulladása néven írtuk le (Arch. ges. Vírusforsch. 44, 1974, 177). A kóroktanban eddig a reoés a parainfluenza 3, valamint az adenovírusok szerepét igazoltuk (Magyar Állatorvosok Lapja, 1976, 31. kötet). Járványtani felmérő munkánk során megállapítottuk, hogy e vírusok közül az adenovírusok a legelteijedtebbek és ezek okozzák a járványos betegségek zömét.

Ismeretes, hogy az adenovírusok okozta megbetegedések leküzdésére borjak védelmére használtak oltóanyagot. A borjak adenovirus okozta megbetegedése ellen kétféle változatban készítettek vakcinát (Bartha A.: Acta Vet. Hung. 17, 1967, 209-216). Az egyik esetben az elszaporított vírust 0,3%-os formaiinnal inaktiválták, a másik vakcina 72 szövet passzázson átvezetett élő vírust tartalmazott. Ezek a vakcinák adjuvánst nem tartalmaztak. Az inaktivált oltóanyaggal végzett kétszeri oltás után viszonylag alacsony titerii ellenanyagok jelentek meg. Az élő vírusos vakcinával való oltás után az áthangolódás felülmúlta a másik vakcina hatását, de az állatok az oltást követően lázas hőmérséklet-emelkedést mutattak és váladékukkal ürítették a vírust.

A találmány célja, hogy eljárást biztosítson juhok adenovírusok által okozott megbetegedésének meg5 előzéséhez használható vakcina előállítására. Ez a betegség ugyanis igen nagy kárt okoz a gazdaságokban. Felméréseink szerint előfordulhat, hogy a járvány szopós bárányok több mint 40%-át pusztítja el, míg a hízóbárányok több mint 5%-a hullik el a járványok 0 során. Az 1 kg súlygyarapodáshoz szükséges táp mennyisége eközben 20%-kal emelkedik. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az adenovírusos megbetegedések által okozott járvány leküzdése igen nagy jelentőségű a juhtenyésztésben.

Azt találtuk, hogy a juh adenovirus által okozott betegségek elleni védekezésre használható inaktivált bivalens vakcinát állíthatunk elő, ha az Országos Közegészségügyi Intézetnél 00174, illetve 00175 számon letétbe helyezett ORT/111, illetve GY/14 jelű adenovirus törzset bárányvese-sejteken szaporítjuk, célszerűen a szövet teljes széteséséig, az így kapott vírusfolyadékot egy ismert adjuvánssal, előnyösen alumíniumhidroxid-géllel összekeverjük, majd egy ismert inaktiválószerrel, előnyösen formaldehiddel vagy /3-propiolaktonnal inaktiváljuk és az így kapott vakcinához adott esetben egy tartósítószert, előnyösen nátriumazidot adunk.

Az oltóanyag előállításához használt ORT/111 jelzésű vírustörzs juh eredetű és a bovin adenovíru0 sok 2-es típusával rokon, ezt a törzset egy hazai járvány során izoláltuk (Magyar Állatorvosok Lapja, 1976. 31. 629). Ugyancsak egy hazai járvány során izoláltuk a GY/14 jelzésű törzset. Ez az 1-es típusú juh-adenovírus törzsekhez tartozik (Zbl. Vet. Med. B., 1976. 23. 320; Magyar Állatorvosok Lapja. 1976. 31.629).

A vírustörzsek az alábbiak szerint azonosíthatók: elektronmikroszkópos vizsgálatok során a vírustörzsek partikulái ikozahedrális szimmetriát mutatnak, külső peplonjuk nincs, ármérőjük átlagban 75 nanométer. A virionok úszósűrűsége céziumkloridban végzett ultracentrifugálás során 1,34 g/cm³. A vírusok a PH 3-as közeget, a zsíroldószerekkel és a nátriumdezoxikoláttal végzett kezelést titerveszteség nélkül elviselik. A virionok kettős szálú DNS-t tartalmaznak. A vírusok jól replikálódnak számos emlős eredetű szövetféleségen, így többek között bárányvesén, bárányherén, boíjúvesén, borjúherén és sertésvesén. A fertőzött sejtekben sejtmagzárványokat képeznek. Mind az ORT/111, mind a GY/14 vírustörzs a Mastadenovirus genusban az emberi adenovírusokkal közös szolubilis antigénnel rendelkezik.

Ezt többek között a komplementkötési próbával és az agar-gél precipitációs próbával vizsgálhatjuk. A vírusok egymástól való elkülönítésére a vírussemlegesítési próba alkalmas (Magyar Állatorvosok Lapja. 1976, 31.629; Bélák S.: A juh-adenovírusok tulajdonságai, kandidátusi értekezés, Budapest. 1978.), amely nyúlban termelt immunsavók segítségével a következő eredményt adta:

Vírusok Immunsavók

ORT/111 GY/14

Magnézium-szulfát 2,02 g

Dinátrium-hidrogén-foszfát 1,4 g (2 H₂ 0)

Glükóz 10 g

Fenolvörös 10 ml

Nátrium-hidrogén-karbonát 16,8 g

Laktalbumin 50 g

A tenyésztést célszerűen a szövet teljes széteséséig folytatjuk. Ekkor a tenyészetekhez adjuvánst adunk és azokat az adjuvánssal alaposan összekeverjük. Bármely ismert adjuvánst használhatjuk az eljáráshoz, előnyösen azonban az alumíniumhidroxidgélt vagy az alumíniumhidroxidgél és szaponin keverékét használjuk.

Az így elkészített oltóanyagot azután inaktiváljuk. Ehhez a művelethez használhatunk bármilyen ismert inaktiválószert. Inaktiválószerként előnyösen formaldehidet vagy béta-propiolaktont használunk. Az így kapott használatra kész vakcinához kívánt esetben hozzáadhatunk egy tartósítószert, előnyösen nátriumazidot.

Az így kapott vakcinát fertőzésnek kitett állatok beoltására, valamint vemhes anyajuhok beoltására használhatjuk. A vakcina adagja 2 ml, melyet az izomba előnyös oltani. A vakcinát, mint később részletezzük legelőnyösebb oly módon használni, hogy az oltást megismételjük.

Igen hatékonyan védhetjük a hízóbárányokat, ha azokat hizlaldába állítás előtt oltjuk be a vakcinával.

A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül.

1. példa

ORT/111

GY/14 :1024 :1024 35

A fentiekből kitűnik, hogy a két vírustörzs egymással nem rokon. Ennek megfelelően egymással szemben védelmet sem alakítanak ki. Mivel a járványokat tapasztalatunk szerint általában e két vírus idézte elő, az oltóanyaghoz szükségesnek láttuk mindkét vírus felhasználását.

A vírusokat juhmagzat vagy egy-két hetes bárány veséjéből készített sejttenyészetben szaporítjuk. A sejttenyészeteket 37 °C-on 7,2-7,4 pH tartományban szaporítjuk és tartjuk fenn. A sejtek szaporításához tápfolyadékként Hanks oldatot vagy Earle oldatot használunk.

A Hanks oldat összetétele a következő: 10 liter 2-szer desztillált vízhez:

Nátrium-klorid Kálium-klorid Kálium-dihidrogén-foszfát Dinátrium-hidrogén-foszfát Kalcium-klorid Magnézium-szulfát Glükóz

Laktalbumin Fenolvörös

Nátrium-hidrogén-karbonát

Az Earle oldat összetétele a következő: 10 liter 2szer desztillált vízhez:

Nátrium-klorid 68 g

Kálium-klorid 4 g

Kalcium-klorid 2,6 g (2 H₂O) g

4g 0,6 g l,52g(12H₂O) l,2g(2 H₂O) 2g(7H₂O) 10g 50 g 10 ml 7g

ORT/111 jelzésű, illetve GY/14 jelzésű juh adenovírus törzset juhmagzat veséjéből készült egyrétegű sejttenyészeten szaporítunk. Tápfolyadékként 10% foetál borjúsavót tartalmazó Hanks oldatot, fenntartóként szintén Hanks oldatot használunk. A tápfolyadékként használt Hanks oldatot 10%-foetális borjúsavóval egészítjük ki. A vérsavó újszülött, colostrummentes borjakból származik (előnyösen a Phylaxia által forgalmazott és használt „colostrummentes borjú vérsavó”). A fenntartó folyadékként használt Hanks oldathoz nem adunk borjúsavót.

A vírusokat 2000 ml-es Roux-palackokban szaporítjuk a 100%-os sejtkárosító hatás megjelenéséig. Ekkor a palackokat lefagyasztjuk, majd felolvasztás után centrifugálás nélkül használjuk fel a továbbiakban.

A vakcinát ezután oly módon adjuváljuk, hogy a vírustenyészethez 3% alumíniumoxidot tartalmazó alumíniumhidroxid-gélt adunk és a vírustenyészetet szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük az adjuvánssal.

Ezután az adszorbeált vírust szobahőmérsékleten 24 órán át kezeljük 0,15%-os vizes formaldehid-oldattal. Az így kapott vakcinához azután tartósítószerként 0,05% nátriumazidot adunk és a vakcinát üvegekbe töltjük.

2. példa

ORT/111 jelzésű vírustörzset és GY/14 jelzésű vírustörzset 2 hetes bárány veséjéből készült egyrétegű sejttenyészeten szaporítunk. Tápfolyadékként 10% foetal borjúsavót tartalmazó Hanks-oldatot, fenntartóként Earle-oldatot használunk. A tenyésztést a továbbiakban az 1. példa szerinti módon folytatjuk azzal az eltéréssel, hogy adjuvánsként az alumínium- 5 hidroxid-gél mellett 1 mg/ml szaponint is adunk a tenyészethez. Az inaktiválást β-propiolaktonnal végezzük.

A fentiek szerint előállított oltóanyaggal kísérleteket végeztünk az ártalmatlanság és a hatékonyság 10 megállapítása végett.

Az ártalmatlanságot úgy vizsgáltuk, hogy vemhes anyajuhokat, szopós bárányokat és hízóbárányokat ötszörös adaggal (előnyösen 10 ml) oltottuk be.

A vakcinázott állatokat egy hónapig tartottuk megfi- 15 gyelés alatt. Ezalatt semmiféle klinikai tünetet nem tapasztaltunk.

A hatékonyságot az alábbiak szerint vizsgáltuk.

db szeronegatív választott bárányt egyszeri beoltással vakcináztunk. Az oltás napján, valamint a 8., 20

14., 21., 42. és 56. napon vett vérmintákban ellenőriztük a víros-semlegesítő anyagok megjelenését. Már a 8. napon vett mintákban mutattunk ki ellenanyagokat, melyek titere a 21. nap körül érte el a maximális 1 ; 16 — 1 :48 értéket. Ezután az ellenanyag titere 25 fokozatosan csökkent az 56. napig, amikoris átlagban 1 :4 értéket ért el.

További kísérleteinkben a kétszeri vakcinázás hatását vizsgáltuk. Azt találtuk, hogy a második oltás időpontja lényegesen befolyásolja a vakcinázás haté- 30 konyságát.

Az első oltást követő 10., 21. és 42. napon 20-20 állatot vakcináztunk újból. Az első csoportban (második oltás a 10. napon) a 30. napon 1 : 512 — : 1024 titerü ellenanyagokat mutattunk ki. A má- 35 sodik csoportban (második oltás a 21. napon) nem észleltünk számottevő ellenanyag-titer emelkedést a második vakcinázást követően. A harmadik csoportban (második oltás a 42. napon) a 65. napon 1 :192 - 1 : 384 titerü ellenanyagokat mutattunk ki. 40

Az ellenanyagok titere még a kísérletet lezáró 110. napon is 1 :64 volt.

A kontrollcsoportokban az elvégzett vizsgálatok valamennyi kísérlet esetén negatív eredményt adtak. A kontrollcsoporthoz tartozó bárányokban specifikus ellenanyagokat egyetlen esetben sem mutattunk ki.

Amint a fenti kísérletek eredményei mutatják, a találmány szerinti eljárással előállított oltóanyaggal kétszer kell vakcinázni. Fertőzött környezetbe került állatoknál az. oltást a 10. napon, vemhes anyajuhok esetében a 6. héten ajánlatos megismételni.

A találmány szerinti eljárással előállított vakcinát nagyüzemekben is kipróbáltuk. A rendszeres vakcinázás meggátolta a korábban többször is előforduló járványok kialakulását. A vakcinázás eredményeként a bárányok elhullása 12-15%-ról 6% alá csökkent. A hízóbárányok súlygyarapodása havonta 1,2-1,8 kg-mal emelkedett. Ez utóbbi eredmény annak tulajdonítható, hogy a vakcinázott hízóbárányokat a betegség még enyhe formájában sem érte.

Claims (2)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás juh adenovírus által okozott betegségek elleni védekezésre használható inaktivált bivalens vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy a 00174, illetve 00175 számon letétbe helyezett adenovírus törzset bárányvese-sejteken szaporítjuk, célszerűen a szövet teljes széteséséig, az így kapott vírusfolyadékot egy ismert adjuvánssal, előnyösen alumíniumhidroxidgéllel alaposan összekeverjük, majd egy ismert inaktiválószerrel. előnyösen formaldehiddel vagy β-propiolaktonnal inaktiváljuk és az így kapott vakcinához adott esetben egy tartósítószert, előnyösen nátriumazidot adunk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a vírusok szaporítását 37 °C-os inkubálással 7,2-7,4 pH értéken végezzük.