SU700069A3 - Способ получени аттенуированного штамма вируса - Google Patents

Description

аборта, но период осеменени  кобыл и энзоотическа  картина у молодых лслиадей имеют значительное вли ние на сезонное число заболеваний и возраст зародыша во врем  аборта, Период инкубации между носовой инокул цией и абортом составл ет от трех недель до четырех мес цев, что указывает на то, что инфекци , котора  приводит к аборту, совпадает с более ранним энзоотическим заражением молодых лошадей на фермах Вирус легко распростран етс  при непосредственном контакте через различные посторонние предметы и через аэролизованные выделени . Вирус может передаватьс  от одной , у которой был аборт, к другой кобыле, но в большинстве эпидемий (как показывают данные) до полного аборта в течение 1-4 мес цев заражаютс  почти все кобылы.

Болезнь случаетс  ежегодно у молодых лошадей на многих фе;рмах, на которых не было новых лошадей, что позвол ет сделать предположени о наличии переносчиков среди взросл4х лошсщей. Регул рность вспышек при сборе восприимчивых молодых лошадей также свидетельствует о наличии носител . Вспышки часто происход т тогда, когда восприим|чивые лошади собираютс  дл  продажи во дворах, на тренировочных площадках,, скачках и в военных организаци х.

Инкубационный период ERP длитс  от 2 до 10 суток. Первична  инфекци  полностью восприимчивых лошадей про вл етс  в виде лихорадки и сильного вы,целени  из ноздрей. Температура может составить 41°С и лихорадка в несложных случа х продолжа етс  от 1 до 7 суток. Температура после полудн , как правило , выше, чем утром. Агранулоцитоз происходит параллельно с лихорадко В течение первых двух суток лихорадки нейтрофилы и лейкоциты угнеТ аютс . Лимфоциты возвращаютс  к нормально 1у уровню через 2-4 суток а нейтрофилы - через 5-9 суток. Потребление кормов и воды падает. Наблюдаетс  средн   гипереми  носовой слизистой оболочки и прощупываетс  Ьтек нижнечелюстных лимфатических узлов. В несложных случа х части наблюдаютс  энтерит и диаре  отекног и тендовагинит, Обща  депресси  у лошадей, которые содержатс  в покое, незначительна . Все признаки обостр ютс  при выполнении упражнений или при pa6ote Полное выздоровление наступает через недели, если не развиваютс  осложнени .

Повторное заражение происходит через 4-5 мес цев и более. Это

последующее заражение, как npasvi ло, бессимптомно, безлихорадочно и не дает осложнений, в частности, у взрослых лошсщей на плег енных фермах. Вли ние повторного заражес ни  на лошадей, участвующих в скачках или зан тых на т желой работе, неизвестно.

Известен способ получени  аттенуированного штамма вируса Eq,uine g phinopneumonitis при проведении 3-10 пассажей в культуре клеток печени мартышки, а затем в первичных культурах клеток, полученных от овец, свиней, порос т и в перевиваемых лини х клеток, выделенных из первичных культур клеток 1.

Недостатком известного способа  вл етс  потер  иммуногенности вирусом . .

Целью изобретени   вл етс  сохранение иммуногенной активности вируса .

Это достигаетс  тем, что вирус культивируют в перевиваемой линии клеток Веро (печень зеленой мартышки) в течение 30-60 пассажей при 23-33°С.

Модификаци  или ослабление морфологии или патогенности вируса осуществл етс  многочисленными способами. Иногда неоднократный серийных перенос в ткань хоз ина ослабл ет организм, серийный перенос в ткань, котора  отличаетс  от ткани хоз ина , иногда приводит к ослаблению; 5 химический шок организма, облучение , низкотемпературный перенос и другиеспособы широко используют-  бактериологами и вирусологами сщ  получени  патогенно инертных Q организмов, который сохран ет свою способность заставл ть своего хоз ина образовывать антитела или клеточный промежуточный иммунитет, способный эффективно нейтрализовать болезнетворный организм. Ослабление без потери имму ногенности живого организма совершенно непредсказуемо и действенность любого способа определ етс  только опьатным путем.

Например, способ, пригодный дл  одного типа вируса, может оказатьс  непригодным дл  другого типа.

В известном способе ослаблени  вирулентного штамма ERP производитс  путем выравдивани  и размножени  ри5 нопневмонических вирусов, выделенных из плода зараженных лошадей, зараженных жереб т и выкидьией вг чувствительной ткани, полученной из чувствительных органов (например, 0 печень мартышки), восприимчивых опытных животных и восприимчивых перевиваемых линий клеток, пригодных дл  выращивани  и размножени  указанных вирусов, при этом размно5 жение включает от трех до дес ти

переносов, полное ослабление вирусов до тех пор, пока они не потер ют патогенность дл  лошади путем серийного переноса через первичные культуры клеток, полученных от овец, свиней и поро.с т и из посто нных стабильных линий клеток, -выделенных из первичных культур клеток. Предполагаетс , что иммуногенна  защита от повторного заражени  вирулентным вирусом Е(Р не происходит , если авирулентный вирус не воспроизведет себ  в животном-хоз ине , Авирулентный вирус может быть извлечен и опознан после вакцинации .

Установлено, что если стабильную линию клеток из Африканской зеленой мартышки Cenocopithecus aethiops, лини  клеток Веро, инокулировать вирулентным вирусом КРВ и серийно переносить в такой линии клеток при пониженной температуре, например 23-33°С, вирус становитс  ослабленным и невирулентным , но в то же врем  остаетс  иммуногенным, т.е. при введении в лошадь-хоз ина он приведет в действие свой иммунологический механизм дл  производства вирусных антител и получени  клеточного промежуточного иммунитета. После этого животное становитс  стойким к последующей инфекции и из вакцинированного животного может быть получен вирулентный вирус, который опознаетс .

При использовании обычных методов серийного переноса, которые  вл ютс  стандартными в данной области , было установлено, что необходимый авирулентный характер развиваетс  без потери иммуногенности после примерно 30-60 переносен при температуре в диапазоне примерно 23 - 33°С. Однако может быть использовано примерно 250 - 300 переносов и более.

Вакцина KRP может назначатьс  юбому виду из семьи либо внепарентерально , либо внутрипарентерально. Вакцина в жидком виде может вводитьс  в ноздри, внутриглазно, внутримышечно , внутривенно, внутрибрюинно и т.д. В виде сухого порошка вакцина может назначатьс  внепарентерально . Как правило, вакцины такого типа в количестве 3000 - 100000 единиц TClOgp назначаютс  в одной дозе.

Воспроизведение вируса. Тканевые культуры клеток готов т использованием стабильной линии леток Веро, полученной из Африканкой зеленой мартышки при количестве ереносов 129. Стандартный стекл ный сосуд дл  культуры засеивают рипсинизированной суспензией клеок Веро, содержащей-достаточное

количество среды дл  закрыти  клеток на глубину 13 iVM, Используетс  среда Eo.gCes .п Es., (Aedium (, котора  содержит 10% сыворотку эмбрионального теленка лл 

питательной среды (5 %

Б под .дерниЕсИощей среде) . Однако может быть использована люба  питательна  среда, например, Лактальбум на  гндролизатна  среда в сбалансированном сол ном растворе ланкса Среда 199 и т.д. Сосуды с культ рой инкубируют при 37°С в течение суток, после чего образуетс  монослой клеток Веро.

Затем сосуд заражают Herpes I, (культура А183, полученна  из калифорнийского университета) с использованкег-- стандартных асептических способов и после 24-72 час инкубации при 37°С цитопатологи  клеток показывает, что вирус воспроизвел себ . Число переносов вируса в клеткк Веро при 37°С составл ет 13 раз, как и ранее. Затем вирус подвергаетс  ослаблению. Ослабление.

Использу  стандартные колбы с культурой клеток ткани н питательной средой, указанной выше, готов т монослой клеток Веро. Примерно 100 TClOso/ Л вируса .13-го переноса взо .д т в колбн и инокулированные колбы инкубнр тот при 26°С. Через 8-10 суток отмечают небольшие зоны перерождени  клеток, и второй серийный перенос делают с некоторым количеством жидкой среды.. Инкубаци  при 26° продолжаетс  и клеточна  цитопатологи  увеличиваетс . После каждого серийного переноса цитопатологи  возрастает и после npHMep io 30-60 серийных переносов устанавливают, что цитопатологи  завершаетс  через 3-5 суток инкубации при 26°С. Этот ослабленный вирус обозначен как вакцина A2S3 У26 Р50 ERP.

Последующие эксперименты в opiaнизме провод т с 50-ым или 55-ым :переносом холодного адаптированного вируса. Все количество вируса вакцины ERP ввод т глубоко внутpи 1ышeчнo .

Заражение вирулентным ERP производ т путем серийного переноса неослабленного вируса А183 в носовые выделени  и во всю кровь через четырех лошадей. Перенесенный конский вирус вызывает классические симптомы ринопневмонии, а также аборты беременных животных. Пул, зараженный вирусами ERP, используетс  неоднократно дл  заражени  экспериментальных лошадей с отличньоми результатами и неиммунных животных. Все вирусы ввод т в ноздри.

Дл  определени  всех серологических реакций на вакцину ERP

.или заражение вирусом используют серологическую реакцую нейтрали зации .

Чистота вируса вакцины ЕКр, полученного указанным способом, определ етс  путем нейтрализации цитопатогенного действи , получаемохо в культуре ткани с помощью известной сы-воротки типа Eq,uine Негре I.

Вирус вакцины дает большое количество синцити  в клетках ик-т и клетках Веро при 37°С. Синцитий, мо Лет быть использован в. качестве маркера дл  вируса вакцины, так как вирулентный вирус ЕРР производит индиЭидуальное цитопатологическое действие округл ющего типа на клетку в указанной линии клеток при 37°С.

Вирус вакцины убивает новорожденных хом ков и вирус выдел етс  из метровых хом ков дл  получени  маркера того же типа дл  синцити . KJ-IHническйе cимптo IЫ конских вирусных болезней не наблюдаютс  в вакцинированных лошад х или жереб тах в различных- возрастных группах,

Вирус вакцины может быть выделен из конских периферийных лейкоцитоз через 2-11 суток после вакциналии ERP. Другие вирусные агенты не выдел ютс  после вакцинации, за иск.шочением местной группы Иегрез( 11 вирусов ) „ Кроме зтого, вирус вакцин1:а, Полученной из лошадей, содержит вакцинный маркер (синцитий).

Экспериментальный вирус вакцины А183 У2б Р50 провер лс  на следующи вирусные агенты с помощью известных способов и ни один из агентов не Зыл обнаружен Eq,bivie infections /Kneniia virus Eq,uine Herpes н virus, aderno -irus,

tciuine EucephaEomyeEit-ta virus,Eouirie- 1

-nnftuenza CK ltq,ui M, AlEq.uil 2|.

ПриготоЁление вакцины. Ослабленный вирус, приготовленный описанным выше способом, выращивают в больших количествах с использованием той же питательной среды, которую примен ют в стандартных колбах дл  получени  моносло  клеток Веро. Колбы инкубируют до завершени  цитопатологии, как правило в течение 3-4 суток. Затем питательную среду собирают и перемешивают со стабилизирующим раствором и раздл ют на дозы примерно 1000-10000000 единиц ТС10 в обычные ампулы дл  вакцийы. Затем материал подвергалс  замораживанию, высушиванию в ампулах и запечатывалс .

Пример 1« Проверка сохранности вакцины ERP и передачи вируса вакцины контактным лошад м. Кроме этого, провер ют действие вакцин в организме, по сравнению с неослабленным вирусом.

Группу из шести разных племенных лошадей обоих полов содержат в групповс л загоне. В пищу добавл ют трав ное сено и  чмень, устанавливают автопоилки. Группа получает ослабленную вакцину ЕРР, которую ввод т всем глубоко внутримышечно. После первой через 28 дней делают аналогичную вакцинацию. Через 56 дней после первой вакцинации все лошади были заражены вирулентным вирусом S(. Определ ют следующие параметры: всех лошадей ежедневно провер ют , на клинические признаки ERP, измер ют температуру и провер ют серологическую реакцию. Три лошади ВЕЛбиршот дл  выделени  вируса из 1 носовых тампонов, и клеток кожи. .Выделение вируса началось на двух контактных точках в момент заражени . Полный подсчет кров ных телец провод т на лошад х, предназначенных дл  выделени  вируса (см.табл.1i).

Выделение вирусов и идентификаци осуществл ют на лошад х, у которых наблюдались выделени  из носовых раковин Принципалам присваивают номера; 104, 77, 52, 53 и 54, а контактному контрольному экземпл ру - номер 79. Результаты экспериментов приведены в табл.2,

Данные таблиц С1;идетельствуют о ЮМ, что

вакцина не вызывает симптомов болезни после любой в-акцинации;

вирус вакцины не. передаетс  контактным котрольным животным в течение более 56 суток пребывани  вместе перед зараж€ нием. Во врем  эксперимента производ т многочисленные выделени  вируса 11 Ео.. Herpes

Хот  контроль (К79) дает нормальные клинические сигчптог-Ы конской ринопневмонии , т.е. воспаление дыхательных органов, отсутствие аппетита и недомогание, повышение температуры на несколько градусов выше нормальной в течение двух дней после зарадсени  вирулентным вирусом и сильное понижение счета белых кров ных телец, вакцинированные принципапы были защищены от вирулентрюго вируса-; отсутствие симптомов, нормальна  температура тела и нормальный счет белых кров ных телец.

Пример 2. Определение сохранности ослабленной вакцины ERP у жеребых кобыл (отсутствие клинических симптомов или абортов), а также определение действенности вакцины у беременных лшвотных против вирулентного вируса ERP с целью получни  информации по пассивному антителу ERP, переданному жереб там, безопасности вакцины на различных стади х беременности к определение пердачи вируса вакцины контактным коптрольным животным, которыми были невакцинированные беременные животные Опыт провод т на жеребых кобылах че .тырех групп (см. табл.З). Жеребых был п той группы используют в ка- честве контрольной. Две группы вак нируют сразу, их. заражают в нос ви рулентным вирусом ERP спуст  40 дней. Одна из этих групп получает холодный адаптированный вирус вакцины 50-го переноса. Оставшиес  две группы жеребых кобыл вакцинируют дважды через промежуток в 20 дней указанным выше образом холод .ным адаптированным вирусом того же уровн  переноса. Две последние группы заражают в нос через ъи дней после первой вакцинации. Исследуют следующие параметры: температуру, выделение вируса и идентификацию, цитопатогенное воздействие , титры нейтрализации сыворотки и клинические симптомы. Эти параметры определ ли у кобыл и жереб т. Жереб т исследуют на ви рус из лейкоцитов крови и носовых раковин непосредственно сразу после обнаружени  и через два или три дн  после рождени . Кроме этого, собирают сыворотку в момент в лжере ки новорожденного жеребенка и чере неделю после этого. В некоторых сл ча х на молочную железу надевают чехлы из холста дл  предотвращени  подсоса после родов дл  получени  нескольких образцов предмолозивной сыворотки. Молозиво ЕРР, нейтрализующее антитело, замер ют у некото рых кобыл. Парные образцы сыворотки собирают у некоторых жеребчиков и кобыл в момент рождени  и после. Пример 3, Получение данных о сохранности вакцины в жереб тах (определ етс  по томам и исследовани м клинической патологии), Опреде ление времени вакцинации жеребцов п наличии материнского антитела: выделению типа вируса у двухнедельног вакцинатного жеребенка и действенность пассивного антитела ERP (табл По группам 1-4 определ ют следующие параметры: температуру тела, цитопа тогенное действие, выделение вируса из носовых раковин и лейкоцитов кро нейтрализующие серологии E.R и ежедневное наблюдение за клиническими признаками болезни; Группа 1, Реакци  жеребчика на вакцинацию ERP. Эта группа из восьми жеребчиков получена от кобыл хорошо продокументированной родословной относительно их статуса ERP. Вакцину ввод т жеребцс1м внутримышечно в количестве одной сублимированной 1 мл дозы вакцины Al83-y26-EUP содержаще 8 логов вируса/2 мЛ, который восстанавливает 2 мл стерильной вод перед использованием. Группа 2. Реакци  жеребчика на вакцинацию ERP Жеребчик № Ь без матери. Истори  матери по Енр неизвестна. Жеребчик № 74 от зараокенной контрольной кобылы, котора  родила жеребенка через п ть дней после заражени  рулентным вирусом ЕРР, через носовую раковину. Этот вирус вьаделен у кобЕллы, однако у жеребенка ,после родов ввделен не был. Следо-вательно , увеличение не наблюдаетс  в молозивном антителе ERP за короткий период времени до рождени  после заражени . Группа 3. Жеребчики, зараженные вирулентным вирусом ERP. Эта группа состоит из четырех жеребцов, которых заражают через носовые раковины с помощью катетера с 10 мл вируса, содержащего логов вируса/2 мл. Истори  кобылы ЕРР хорошо документирована, Группа 4. Состоит из двух жеребчиков от матерей с неизвестными истори ми по ERP. Жеребчиков заражают аналогичным образом, так же как и в группе 3. Ни один из вакцинированных жеребцов не показал серьезных клинических симптомов. Иногда выдел лись . бактерии Streptococcus zooepidetti-icus из носовых каналов во врем  нечастых выделений из 1осовых раковин, которые не имели отношени  к ERP. Ни один из четырех зараженных жеребцов (группа 3), содержащих молозивное антитело ERP, не был болен или подавлен, как зараженные жеребцы , у которых не хватало молозивного антитела ERP.. Таким образом, нормальна  температура Т€гла жеребцсгв выше чем у взрослых. Кроме этого, стресс от воздействи  окружающей среды, например , тренировка жеребцов или лежание на солнце, по-видимому, оказывают большее вли ние на колебани  температуры. Тенденци  к лейкопении чаще про вл етс  у вакцинированных жеребцов в период между 3-7 дн ми . Лейкопени  про вл етс  сильнее у зараженных контрольных жеребцов. После заражени  сильна  лихорадочна  реакци  наблюдаетс  у зарал енных жеребцов без пассивного антитела в период между 2-6 дн ми. Очевидно,нет посто нного повы1иени  температуры после вакцины ERP или зарал ени  ERP высокими уровн ми пассивных антител ETIP. Один х еребец 155, показавший самое низкое нейтрализующее антитело ERP, имеет такое же повышение температуры , как и контрольные заргикенные жеребчики, однако, не была замечена депресси  или анорекси . Из полученных экспериментальных данных можно сделать следующие выоды .

Приспособленный к холоду (26°С) вирус клетки Веро воспроизводитс в организме при внутримышечном введении , образу  защитный иммунитет от вирулентного -вируса ERP, введенного Б носовую раковину.

Вирус вакцины не  вл етс  патогенным при введении жеребым и жереб там из различных иммунологических сред ERP.

Вирус вакцины может быть выделен из лошадей, которые до этого были подвержены ERP (измерение проводилось с помощью нейтрализующего антитела ERP) или от животных, не имеющих нейтрализующего антитела. Иногда вирус может быть выделен из промытых лейкоцитов крови или редко из носовых раковин.

Вирус вакцины ERP не передаетс  контактным контрольным лошад м при отсутствии сероконверсии контактных контрольных животных или при выделении негативного вируса из контрольных животных,

Нейтрализующие серологии из вакцинированных животных успешно сравнивают с серологи ми, вызванными вирулентным вирусом ЕКР, который используетс  дл  заражени .

Молозивное антитело ERP с высоким титром пассивно переходившее к жеребцам, по-видимому, защищает (отсутствие симптомов) жеребцов От вирулентного вируса ERP.

Клеточный промежуточный иммунитет , играет важную роль в защите лошадей от абортов ERP и клинических симптомов ERP, однако, до сих пор не представл етс  возможным измерить клеточный иммунитет ЕЙР это делаетс  только путем заражени ,

Число выделений вируса, сделанных после вакцинаций с помощью воспроизведенной вакцины ERJ или воздействи  вирулентным вирусом .ERP,. во мноком зависит от типа и степени иммунитета, которым обладает хоз и Ьредпочтительно выдел ть вирусы из жеребцов с высокими уровн ми молозивного нейтрализующего антитела ERP. Читаетс , что эти жеребцы имеют гуморальный иммунитет, который в зависимости от силы представет улучшенную симптоматологию при заражении вирулентным вирусом. Однко гу 1оральный иммунитет играет неначительную роль в изол ции состо ни  носител  вируса. В противополоность этому активный иммунитет, вызываемый вирусной инфекцией образует клеточный промежуточный и гуморальный иьадунитет. Отсюда после повторного воздействи  воспроизведенным вирусом вакцины или вируленньзм вирусом состо ние переносчика вируса практически устран етс . Повидимому , существуют животные, невосприимчивые к ERP, у которых наблюдаетс  такое состо ние, и животные , перенесшие до этого ERPjу которых тоже наблюдаетс  такое же состо ние по серологи м. Клеточный иммунитет, как гормональный иммунитет , тер етс  со временем. В насто щее врем  неизвестны сроки истощени  клеточного иммунитета ERP.

Вирус вакцины ERP не переходит плацентальный барьер, суд  по негативным нейтрализующим премолозивным образом сыворотки от восьми новорожденных жереб т. Кроме этого, у 18 новорожденных жереб т от вакцинированных и зараженных кобыл не был выделен положительный вирус вакцины bt uirie Hefpg 1 .Мно предположить, что кривые истощени  пассивно приобретенного нейтрализующего антитела ERP, полученного от 5 жереб т путем выделени , неуклонно снижаютс , не показыва  внутриутробного воздействи  вируса H6V-pes 1, так как, очевидно, не происходит активна  индукци  антитела.

Выделени  вируса вакцины ЕДР чаще всего делаютс  из лейкоцитов крови, а не из носовых раковин. Эти данные также относ тс  к введению вируса вакцины через нос. Хот  только четыре; принципа из четырех дали выделени , все выделени  были сделаны из лейкоцитов крови . Многие носовые выделени  вируса , полученные во врем  экспериментов , могут быть получены из незначительных количеств крови, выделенной из капилл ров, поврежденных при вз тии образцов длинными носовыми тампонами размером 150 мм, когда животные двигались. Образцы некоторых носовых Тс1мпонов были потер ны из-зй. бактерий и загр знени .

Наблюдаютс  три  вных клинических случа  мыта и были выделены Streptococcus zooepifle,mous,5tv-ep ec uiR-imiEi i cTpen-rpynnat.Stapn.oureus и у одного жеребенка был обнаружен51герtocbccus . Эти бактерии периодически выдел ли у испытываемых животных . Все бактерии могут давать клинические симптомы лихорадки или

5 вьаделений из носовой раковины или то и другое вместе, поэтому их наличие часто исследуют дл  определени  причины любого клинического отклонени , которое могло повли ть

0 на результаты исследований опытных животных. В больишнстве случаев бактериальные вспышки были довольно  сны, когда температура лошади и общие карты лейкоцитов просматривались. Stre-ptococcus z.ooe-pidemicus  вл етс  частным сопутствующим агентом вируса Eq, Rtvinopneumonitra присутствие которого не вызывает удивлени , если прин ть о внимание повсеместный характер этой попул ции. Следовательно любой серьезный стресс лошади может обусловить вспышку Strep, zooepidemicus Изобретение относитс  к вакцик ,э и к способу ее приготовлени . Емрулентный изоб т А183 вируса Et Uine 1 Heirpes вводитс  в монослой посто нной линии клеток Веро, Проверка сохранности вакцины ERP и контактным лошад который инкубируетс  в течение 3-5 дней при и цитопатологи  клеток завершаетс , СвежеприготовленнЬгй стабильный клеточный монослой клеток Веро инокулируетс с частью приготовленного собранного вируса. Культура вновь инкубируетс  дл  получени  цитопатологии по меньшей мере части клеток ткани. После этого часть полученного вируса серийно переноситс  по меньшей мере 30 раз при инкубационной температуре И получаетс  иммуногенно активный авирулентный вирус, Табл-ииа 1 ачи вируса вакцины

Примечание. Ни одна из подопытных признаков ERP. лошгщей не имела клинических

I I

I I I I

t:

I I

I I

+гН

W «

Ш

«

о

СЛ

Г-- «

Д

H

a

X

о

« о

Ю

о и о

 

(в

.

W

« .

Ю re

JC

о «

(tf   го

к

Ш

tJ

ПЗ

а: m о

ID

о

и .

D, S

т

« Я    

Ш

f

rfl

  т

О

с о

S

tt) з:

X Ю

у ф S

EH

. a

к а

G

Ol

г W -,.. . Результаты исследований по выделению Таблица4 вируса у новорожденных жереб т