DE2717919A1 - Verfahren zur herstellung eines pferde-rhinopneumonievakzins und durch dieses verfahren hergestelltes vakzin - Google Patents
Verfahren zur herstellung eines pferde-rhinopneumonievakzins und durch dieses verfahren hergestelltes vakzinInfo
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Description
PHA. 20755.
- / - 10.4.1977-
>.p. ■■<·■'
■ ( VA/EVH.
Philips ionone
Verfahren zur Herstellung eines Pferde-Rhinopneumonievakzins
und durch dieses Verfahren hergestelltes Vakzin.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Vakzins zum Schützen von Einhufern vor
den Einflüssen von Pferde-Rhinopneumonie, auf das durch
dieses Verfahren hergestellte Vakzin und auf ein Verfahren zum Schützen von Einhufern mit diesem Vakzin.
Kurz; gesagt betrifft die Erfindung die Attenuierung
des virulenten ERP-Virusstammes durch Durchgang über eine
Vero-Zellinie bei einer herabgesetzten Temperatur während
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einer Anzahl von Seriendurchgängen, die genügend ist, um die Virulenz des Virus zu verringern, ohne dass dessen
immunogener Charakter angegriffen wird.
Rhinopneumonie ist eine akute virale Infektion, von der angenommen wird, dass sie durch das Pferde-Herpes-Virus
vom Typ I herbeigeführt wird, und die Infektion kennzeichnet sich durch Fieber, Leukopenie und katarrhalische
Entzündung der Luftwege. Infolge der viralen Krankheit werden die Tiere empfindlich für sekundäre bakterielle
Infektion, die verschiedene Teile der Luftwege angreift.
Rhinopneumonie kommt auf Bauernhöfen in Gebieten vor, in denen intensiv Pferde gezüchtet werden. Ein verhältnismässig
gleichmässiges Muster wird in Zentral-Kentucky wahrgenommen, λ/ο sowohl die Krankheit der Luftwege als auch
Abort studiert worden sind. Die Krankheit der Luftwege wurde fast ausschliesslich bei jungen Pferden gefunden, sowohl auf
Bauernhöfen, als auch wenn sie für Handelszwecke oder für Training zusammengebracht sind. Die meisten Bauernhöfe im
Gebiet kenne Ausbrüche von Rhinopneumonie im Herbst oder früh im Winter, insbesondere im Oktober, November und Dezember.
Diese Ausbrüche bei jungen Pferden hängen mit dem Absetzen und dem Zusammenbringen in den Winterquartieren zusammen.
In dieser Periode weisen Stuten auf Bauernhöfen keine deutlichen Symptome der Krankheit auf, aber die Infektion
kann mit Hilfe serologischer Versuche nachgewiesen werden.
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J(O 10.4.77.
Die Krankheit verbreitet sich schnell in einem Stall oder in einem Trainingsgebiet, wobei innerhalb einiger Tage
oder Wochen alle Pferde infiziert werden.
Abort wurde in jedem Monat, ausgenommen im Juli und August, gefunden. Abort kommt am meisten mitten im
Winter und am Anfang des Frühlings vor. Von 700 registrierten Abortfällen in Kentucky trat 15$ im Januar, 24$ im Februar,
29$ im März und 18$ im April auf. Abort kann vom fünften
Monat der Tracht bis zum Ende der Tracht vorkommen. Gewisse pränatal infizierte Füllen werden nach einer vollständigen
Trachtzeit lebendig geboren. Daten von 623 Abortfällen
zeigen, dass 11$ im achten Monat, 30$ iai neunten Monat,
36$ im zehnten Monat und 19$ im elften Monat auftritt.
Die Daten deuten auf eine Beziehung zwischen dem Alter des Fötusses und dem Auftreten von Abort hin, aber die Zucht—
periode von Stuten und das enzootische Muster bei jungen Pferden üben einen wesentlichen Einfluss auf das Auftreten-
von Abort in einer bestimmten Saison und auf das Alter des Fötusses aus, in dem Abort auftritt.
Die Inkubationszeit zwischen nasaler Inokulation und Abort variiert von drei Wochen zu vier Monaten,
wodurch bewiesen wird, dass die Infektion, die Abort zur Folge hat, mit der früheren enzootischen Infektion junger
Pferde auf dem Bauernhof zusammenhängt. Das Virus verbreitet sich leicht durch direkten Kontakt, über Gegenstände,
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PIIA. 20735.
die von mehr als einem Pferd benutzt werden ("fomites")
und durch Ausscheidungen in Form eines Aerosols. Ein Virus kann sich von einer abortierenden Stute zu anderen
Stuten verbreiten, aber bei den meisten Ausbrüchen stellt sich heraus, dass fast alle anwesenden Stuten 1 bis h Monate
bevor der erste Abort stattfand, infiziert waren.
Auf vielen Bauernhöfen, wo keine neuen Pferde aufgenommen sind, kommt bei jungen Pferden die Krankheit
jährlich vor, was auf das Vorhandensein von Trägern unter den erwachsenen Pferden hindeutet. Die Regelmässigkeit,
mit der die Krankheit ausbricht, wenn junge empfindliche Pferde zusammengebracht werden, deutet ebenfalls auf einen
Trägerzustand hin. Ausbrüche der Krankheit ergeben sich vielfach, wenn empfindliche Pferde für Handelszwecke, in
Wiesen, in Trainingsgebieten, bei Wettkämpfen und in Lagerplätzen zusammengebracht werden.
Die Inkubationsperiode von ERP variiert von 2 zu 10 Tagen. Primäre Infektion völlig empfindlicher
Pferde äussert sich durch Fieber und serösen Ausfluss aus den Nasenlöchern. Die Temperaturen können auf 41°C
ansteigen und das Fieber dauert 1 bis 7 Tage in Fällen, in denen keine Komplikationen auftreten. Gewöhnlich
sind die Temperaturen mittags höher als morgens. Leukopenie tritt zugleich mit Fieber auf. Sowohl neutrophile Leukocyte
als'auch Lymphocyte werden während der ersten zwei Tage des Auftretens von Fieber unterdrückt. Innerhalb von
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zwei bis vier Tagen sind die Lymphocyte wieder auf dem normalen Pegel und die neutrophilenLeukocyte kehren in
fünf bis neun Tagen zu dem normalen Pegel zurück. Der Verbrauch von Futter und Wasser kann abnehmen.Milde
Kongestion der Nasenschleimhäute wird beobachtet und es können fühlbare Oedeme der Kieferlymphdrüsen auftreten.
In Fällen ohne Komplikationen treten Enteritis und Diarrhöe, Oedeme der Beine und Tendovaginitis nicht so
oft auf. Die vollständige Depression ist mild bei Pferden, die in Ruhe gelassen werden. Alle Symptome werden ernster
bei gezwungener Uebung oder Arbeit. Eine vollständige Erholung findet innerhalb von einer bis zwei Wochen statt,
es sei denn, dass Komplikationen auftreten.
Wiederinfektion kann mit Intervallen von vier bis fünf Monaten oder langer auftreten. Diese aufeinanderfolgenden
Infektionen verlaufen gewöhnlich ohne Symptome, ohne Fieber und führen keine Komplikationen herbei, insbesondere
bei erwachsenen Pferden in Züchtereien. Der Einfluss von Wiederinfektion auf Rennpferde oder auf
Pferde, die schwere Arbeit machen müssen, ist nicht bekannt.
Das Vakzin nach der vorliegenden Erfindung ist eine attenuierte Form des Virus, das aus einem virulenten
Pf erde-Rhinopneuinonievirus- (ERP)-Stamm hergestellt wird, der 50 Durchgängen über die Vero-Zellinie (Affenniere)
bei 260C unterworfen wurde.
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FHA.
10.4.77.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Vakzin, das
mittels eines Verfallrens hergestellt wird, das darin besteht,
dass eine Gewebekultur mit einem virulenten Stamm des ERP-Virus inokuliert wird, s"o dass Vervielfachung des
Virus stattfinden wird, während Seriendurchgänge des auf diese Weise fortgepflanzten Virus über zusätzliche
Gewebezellkulturen während einer genügenden Anzahl von Durchgängen und unter derartigen Bedingungen stattfinden,
dass das Virus zu einem avirulenten Zustand attenuiert wird, ohne dass der immunogene Charakter des Virus verloren geht.
Attenuierung oder Modifikation des virulenten oder pathogenen Charakters von Bakterien oder eines Virus
zu einem avirulenten oder nichtpathogenen Zustand ist aus der Literatur bekannt.
Modifikation oder Attenuierung der Morphologie und/oder Pathogenizität ist mit Hilfe vieler Techniken
erzielt. Manchmal wird der Organismus durch wiederholten Seriendurchgang über das Wirtsgewebe attenuiert; manchmal
führt Seriendurchgang über ein Gewebe, das von dem Wirtsgewebe verschieden ist, zur Attenuierung; auch chemischer
Schock des Organismus, Strahlungsbehandlung, Durchgang bei niedriger Temperatur und andere Techniken werden vom
Bakteriologen und vom Virologen dazu benutzt, pathogen inerte Organismen zu erzeugen, die die Fähigkeit behalten,
in ihren Wirten Antikörper zu bilden oder eine zellgebundene
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Immunität zu liefern, die ein Pathogen auf zweckmässige
Weise neutralisieren kann. Die Attenuierung ohne Verlust der Immunogenität eines lebendigen Organismus ist völlig
unvorhersagbar und es können nur empirische Verfahren zur Feststellung der 'Wirksamkeit einer bestimmten Technik
angewandt werden. Eine bestimmte Technik, die, wie gefunden wurde, bei einem bestimmten Typ eines Virus angewandt
werden kann, soll nicht immer als bei anderen Viren anwendbar betrachtet werden. Bekannte Techniken zum Attenuieren
eines virulenten Stammes des ERP-Virus sind beschrieben. Seriendurchgang eines virulenten ERP—Virus in Hamstergewebe
gepaart mit einer gewissen Anpassung, ist von E.R. Doll, Vet.Bull. J32, S. 1^93 beschrieben. Die US-PS 3 725 5^2
beschreibt die Attenuierung eines virulenten Stammes des ERP-Virus durch Züchtung und Vervielfachung von Rhinopneunionieviren,
die von einer Quelle stammen, die aus infizierten Pferden, infizierten Füllen und abortierten Fötussen
gewählt ist, in geeigneten Geweben, die aus geeigneten Organen, wie Affenniere, geeigneten Versuchstieren und
geeigneten kontinuierlichen Zellinien gewählt sind, die sich zur Züchtung und Vervielfachung der genannten
Viren eignen, wobei die Vervielfachung 3 bis 10 Durchgänge mit sich bringt; eine vollständige Attenuierung der Viren,
bis sie ihre Pathogenizität für das Pferd verloren haben, durch Seriendurchgang über die Primären Zellkulturen,
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die von Schafen, Schweinen und Ferkeln und von stabilen
kontinuierlichen Z>ellinien stammen, die von diesen primären Zellkultviren abgeleitet sind.
Es wird angenommen, dass der immunogene Schutz von einer nachfolgenden Infektion mit einem virulenten
ERP-Virus nicht stattfindet, es sei denn, dass sich das avirulente Virus im Wirtstier vervielfacht, und wiedergewonnen
und identifiziert werden kann, nachdem die Vakzination
stattfindet. Bisher weist keiner der beschriebenen attenuierten Virusstämme diese charakteristische Eigenschaft
auf und liefern sie nicht den gewünschten Schutzgrad.
Es wurde nun aber gefunden, dass, wenn die
stabile Zellinie des afrikanischen grünnen Affen Cercopithecus
aethiops, die Vero-Zellinie, mit einem virulenten ERP-Virus
inokuliert wird und ein Seriendurchgang über eine derartige Zellinie bei herabgesetzten Temperaturen von
23 bis 33°C durchgeführt wird, das Virus attenuiert wird
und nicht virulent ist, aber noch immer den immunogenen~ Charakter aufweist, d.h., dass, wenn es in einen Pferdewirt
eingeführt wird, der immunologische Mechanismus des Tieres dazu Anlass geben wix^d, virale Antikörper und eine zellgebundene
Immunität zu erzeugen. Dann wird das Tier immun für eine nachfolgende Infektion und das avirulente Virus
kann aus dem vakzinierten Tier wiedergewonnen und als solches identifiziert werden.
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Durch Anwendung üblicher Seriendurcligangstechniken,
die aus der Literatur bekannt sind, wurde gefunden, dass der gewünschte avirulente Charakter ohne Verlust der
Iiiimunogenität nach etwa 30 bis 60 Durchgängen bei einer
Temperatur im Bereich von etwa 23 bis etwa 33°C entwickelt
wird. Es können aber auch etwa 25Ο oder 300 oder mehr
Durchgänge stattfinden.
ERP—Vakzin nach der Erfindung-kann jedem Spezies
der Familie der Einhufer durch extra- oder interparenterale Methoden verabreicht werden. In flüssiger Form kann das
Vakzin intranasal, intraoral, intraokular, intramuskulär, entravenös, intraperitoneal usw. verabreicht werden. In
Form eines trockenen Pulvers eignet es sich zur extraparenteralen Verabreichung. Wie für Vakzine dieses Typs
üblich ist, werden etwa 3000 bis 100.000 TCID -Einheiten in einer einzigen Dosis verabreicht.
Das Verfahren zur Herstellung des Vakzins nach der Erfindung wird nachstehend im Detail beschrieben.
1. Vervielfachung des Virus:
Zellgewebekulturen werden mit Hilfe der stabilen Vero-Zellinie hergestellt, die von dem afrikanischen grünen
Affen abgeleitet ist, wobei ein Durchgangspegel von 129 auftritt.
Ein genormtes Glaszüchtungsgefäss wurde mit einer mit Trypsin behandelten Suspension von Vero-Zellen
inokuliert, wobei dieses Gefäss eine genügende Menge Medium
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10.^.77.
enthielt, um die Zellen bis zu einer Höhe von etwa 1,3 cm
zu bedecken. Als Wachstumsmedium wurde Eagles Minimum Essential Medium (MEM) verwendet, wie in "Handbook of Cell
and Organ Culture" von Merchant und anderen, Burgess Publishing Co., Λ96Η beschrieben ist, das 10$ fetales
Kalbserum enthielt (im Aufrechterhaitungsmedium 5$)·
Jedes Normwachstumsmedium, wie Lactalbuminhydrolysatmedium
in Hanks Balanced Salt Solution, Medium 199 usw., kann aber auch verwendet werden. Die Züchtungsgefässe wurden
bei 37°C während 1 bis 3 Tagen inokuliert, wonach sich eine Monoschicht von Vero-Zellen gebildet hatte.
Dann wurden die Gefässe mit Pferde-Herpes I inokuliert, das als ein A 183-Isolat identifiziert wurde,
das von der University of California erhalten war, wobei übliche aseptische Methoden verwendet wurden, und nach
einer Inkubation von Zh bis 72 Stunden bei 37°C war die
Cytopathologie der Zellen nahezu vollständige was angibt,
dass sich das Virus vervielfacht hat. Das Virus wurde 13 mal über Vero-Zellen bei 37°C auf die obenstehende
Weise geführt und wurde anschliessend der nachstehend zu beschreibenden Attenuierung unterworfen.
2.Attenuierung;
Unter Verwendung von Normgewebezüchtungskolben und des MEM-Wachstumsmediums, das oben beschrieben wurde, wurden
Monoschichten von Vero-Zellen hergestellt. In die Kolben
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wurden etwa 100 TCID_ pro ml des 13· Virusdurchgangs
eingeführt und die inokulierten Kolben wurden bei einer Temperatur von 26°C inkubiert. Nach etwa 8 bis 10 Tagen
wurde ein kleines Gebiet mit Zellendegeneration wahrgenommen und es wurde ein zweiter Seriendurchgang mit einer kleinen
Menge flüssigen Mediums durchgeführt. Inkubation bei 260C
wurde fortgesetzt und die zellulare Cytopathologie nahm zu. Nach jedem Durchgang nahm die Cytopathologie zu und nach
30 bis 60 Durchgängen stellte sich heraus, dass die Cytopathologie nach 3- bis 5-tägiger Inkubation bei 26°C vollständig
war. Dieses attenuierte Virus wurde als A 183 V 26 P50-ERP-Vakzin
identifiziert.
Die folgenden Versuche in vivo wurden mit dem 50. oder 55· Durchgang des kalt angepassten Virus durchgeführt.
Alles ERP-Vakzinvirus wurde tief intramuskulär verabreicht.
Eine virulente ERP-Infektion wurde durch Seriendurchgang
des nicht attenuierten A I83 Virus in Nasenspülmitteln
und heilem Blut in vier Pferden erhalten. Das über Pferde geführte Virus verursachte die bekannten
Rhinopneumoniesymptome von ERP sowie Abort bei trächtigen Tieren. Die für die Infektion verwendete ERP-Virusquelle
wurde jeweils für die Infektion von Versuchspferden verwendet, wobei bei nicht immunisierten Tieren sehr gute
Ergebnisse erzielt wurden. Das Infektionsvirus wurde
jeweils intranasal verabreicht.
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Serumneutralisationsversuche wurden zur Bestimmung aller serologischer Reaktionen auf das ERP-Vakzin oder
auf das Infektionsvirus benutzt.
Die Reinheit des auf die obenbeschriebene Weise erzeugten ERP—Vakzinvirus wird durch Neutralisation des
cytopathogenen Effekts (CPE) bestimmt, der in Gewebekultur mit das bekannte Pferde-Herpes I charakterisierendem Serum
herbeigeführt wird.
Das Vakzinvirus ergibt ein erhebliches Syncytium in RK.._-Zellen und in Vero-Zellen bei 37°C. Das Syncytium
kann als eine Markierung ("Markei'") für das Vakzinvirus verwendet
werden, weil das virulente ERP—Infektionsvirus in
den obengenannten Zellinien bei 37°C einen Typ CPE ergibt, bei dem die einzelnen Zellen abgerundet werden. ι
Das Vakzinvirus tötet neugeborene Hamster und
das Vakzinvirus wurde aus den toten Hamstern wiedergewonnen und ergab denselben Typ Syncytiummarkierung. Es wurden
keine klinischen Symptome viraler Pferdekrankheiten bei
vakzinierten Pferden oder Füllen verschiedener Altersgruppen induziert.
Das Vakzinvirus kann aus peripher umlaufenden Leucocyten von 2 bis 11 Tagen nach der ERP-Vakzination
isoliert werden. Andere Virusagenzien sind nach der Vakzination nicht isoliert, ausgenommen die bereits vorhandenen
Viren vom Typ Herpes II. Das aus den Pferden
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wiedergewonnene Vakzinvirus weist ebenfalls die Vakzinmarkierung ,"Syncytium" auf.
Das bei den Versuchen verwendete Vakzinvirus AI83 V26 P5Ö wurde auf die folgenden viralen Agenzien
mit Hilfe bekannter Techniken geprüft und es stellte sich heraus, dass keines der folgenden Viren vorhanden war:
Infektiöse Pferde-Anämie, Pferde-Herpes II, Pferde-Adeno,
Pferde-Enzephalomyelitis und Pferde-Influenza (A/Equi/1 ;
A/Equi/2).
3· Herstellung des Vakzins:
3· Herstellung des Vakzins:
Das auf die obenbeschriebene Weise attenuierte
Virus liess man in grossen Mengen unter Verwendung desselben
Wachstumsmediums in Standardkolben mit Monoschicht—Yero—
Zellen wachsen. Die Kolben wurden inkubiert, bis die Cytopathologie vollständig war, gewöhnlich in 3 bis 4 Tagen.
Dann wurde das' Wachstumsmedium geerntet und mit einer
stabilisierenden Lösung gemischt und in Einheitsdosen von etwa 1000 - 10.000.000 TCID pro ml geteilt, je
in den üblichen Vakzinflaschen. Dann wurde das Material gefriergetrocknet und für Gebrauch abgeschlossen.
Versuch I
Der nachstehende Versuch wurde entworfen, um zu bestimmen, ob das entwickelte ERP-Vakzin sicher war, und um zu
prüfen, ob das Vakzinvirus auf Pferde mittels Kontaktinfektion übertragen wurde. Ausserdem sollte die Wirksamkeit
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des Vakzins in vivo gegen das Infektionsvirus geprüft werden.
Eine Gruppe von sechs nicht rassereinen Pferden beider Geschlechter wurde unter demselben Dach in einem Raum
zusammengebracht. Das Futter bestand aus Hafern und grasartigem Heu und es waren automatische Trinktröge vorhanden.
Der Gruppe wurde das attenuierte ERP-Vakzin verabreicht. Alle Vakzinationen wurden tief intramuskulär verabreicht.
Der ersten Vakzination folgte nach 28 Tagen eine gleiche Vakzination. Alle Pferde wurden 56 Tage nach der ersten
Vakzination mit virulentem ERP-Virus infiziert. Die folgenden Parameter wurden geprüft; alle Pferde wurden täglich auf
klinische Symptome von ERP geprüft und die Temperaturen und Seren wurden während des Versuches kontrolliert.
Es wurden drei Pferde zum Kontrollieren von Virusisolationen aus den "buffy coat"-Zellen und Nasenausstrichen ausgewählt.
Mit Virusisolationen wurde bei zwei Kontakt-Kontrollpferden zu dem Zeitpunkt der Infektion angefangen. Vollständige
Blutzellzählungen wurden vielfach bei den Pferden durchgeführt, die auf Virusisolationen geprüft wurden.
Bakterielle Isolationen und Identifikation derselben wurden wiederholte Male bei Pferden mit Nasenausfluss
durchgeführt. Behandelte Versuchspferde sind mit den
Nummern 104, 77» 52, 53 und $h angegeben. Das Kontakt-Kontrollpferd
ist mit Nr. 79 angegeben. Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen A und B erwähnt.
709844/09*1
Serumneutralisationen
Zweimal I.M. vakziniert
Zweimal I.M. vakziniert
Infektion
1. +12 +21 2.Vakz. +12 Tage +20 Tage +28 Tage +11 Tage +21 Tage +29 Tage +66 Tage
Vakz. Tage Tage +28 Tage 2.Vakz. 2.Vakz. 2.Vakz. Infektion Infektion Infektion Infektion
Vakz. Tage Tage +28 Tage 2.Vakz. 2.Vakz. 2.Vakz. Infektion Infektion Infektion Infektion
P52 | 16 | 128 | 512 | 256 | 128 | 512 | 256 | 512 | 512 | 1024 |
P53 P54 |
-4 8 O CD k CO |
256 64 |
512 512 |
1024 256 |
128 256 |
512 256 |
128 128 |
• 256 512 |
128 · 128 |
256 256 |
P77 | N.D. | 2048 | 512 | 256 | 256 | 128 | 1024 | 256 | 256 | |
P104 C79 |
ο ο co» O3» |
Ö 0 |
64 0 |
8 0 |
64 0 |
128 0 |
128 0 |
256 512 |
256 2048 |
128 2048 |
P = Versuchspferd (behandelt) C = Kontakt-Kontrollpferd
N.D.= nicht durchgeführt
Keines der behandelten Versuchtiere indiesem Versuch wies klinische Symptome von ERP auf.
CD
CD
P77 | co 00 |
BC |
'»/096* | NS | |
P10i| | BC | |
NS | ||
C79^ | C79* | BC NS |
P77 | BC NS |
|
P 1Oi | BC | |
NS | ||
BC | ||
NS | ||
I· | ||
1 | .Vakzination | +6 +7 | + 10 | + 12 +14 ' | 2. Vakzination | +3 +4 +5 | +6 | +7 | +8 | + 12 | + 14 | • | y | Infektion | I I | + 4 +7 |
t° | TaK+3 +4 +5 | I | + | S+28 | II | II | + 28 | *+1 +2 +3 | ||||||||
I I | II | II | II | II | I | + | ||||||||||
I | II | + . | ||||||||||||||
I | II | II | II | II | II | II | II | II | II' | II + | ||||||
II | II | |||||||||||||||
nicht durchgeführt
+8 +9 +10 +11 +14 +16 +18 +21
II II II II II
II II II II II II II
I I
I II II II II ' II II I I III I
Abort 15 Tage nach der Infektion +
Herpes-I-Vlrus wurde aus dem Fötus P
wiedergewonnen. C
I = Pferde-Herpes-I-Virus BC
II = Pferde-Herpes-II-Virus NS
nicht identifiziertes Virus Versuchstier (behandelt)
Kontaktkontrolltier
Kontaktkontrolltier
Buffy Coat
Nasenaus s tri chi.
Nasenaus s tri chi.
fs)
CO CO
■vj IV
PHA. 20755. 10.^.77.
Studierung der in diesen Tabellen erwähnten Daten des Versuches I und das Fehlen klinischer Symptome ergeben
folgendes:
1. , Das Vakzin induzierte keine Krankheitssymptome
nach jeder der Vakzinationen.
2. Das Vakzinvirus wurde nicht durch Kontaktinfektion
auf Kontrolltiere während einer Periode von 56 Tagen übertragen,
in der die Tiere zusammengehalten wurden, bevor sie infiziert wurden. Es gab zahlreiche Isolationen von Pferde-Herpes-II-Virus
während des Versuches.
Obgleich das Kontrolltier C79 die gewöhnlichen klinischen Symptome von Pferde-Rhinopneumonie aufwies, d.h.
Entzündung der Luftwege, Anorexie und allgemeine Malaise,
eine Temperaturerhöhung von mehreren Grad über der normalen Temperatur innerhalb von 2 Tagen nach der Infektion mit
virulentem Virus und eine starke Abnahme der Anzahl weisser Blutzellen, waren die vakzinierten Ver»uchstiere vor der
Infektion mit virulentem Virus geschützt, wie aus dem Fehlen klinischer Symptome, normalen Körpertemperaturen
und normalen Mengen weisser Blutzellen hervorgeht. Versuch II
Der nachstehende Versuch wurde entworfen, um zu bestimmen, ob das attenuierte ERP-Vakzin für trächtige Stuten sicher
war (keine klinischen Symptome oder Abort), und um die Wirksamkeit des Vakzins bei trächtigen Tieren gegen eine
7098U/0968
PKA. ;Ό7!γ5.
10.4.77.
Infektion mit virulentem ERP-Virus festzustellen, damit
Information über ERP-passive Antikörperübertragung auf die Füllen und über die Sicherheit des Vakzins mit verschiedenen
Intervallen während der Tracht erhalten wird, und um zu bestimmen, ob das Vakzinvirus mittels Kontaktinfektion
auf nichtvakzinierte trächtige Kontrolltiere übertragen werden würde.
Der Versuch II wurde über vier Gruppen trächtiger Pferde verteilt. Zwei Gruppen wurden einmal vakziniert
und kO Tage später intranasal mit virulentem ERP-Virus
infiziert. Einer der obengenannten Gruppen wurde der 50.Durchgang des kalt angepassten Vakzinvirus verabreicht.
Die zwei anderen Gruppen trächtiger Pferde wurde zweimal mit einem Zeitintervall von 20 Tagen auf die gleiche
Weise wie oben mit demselben Durchgang des kalt angepassten Vakzinvirus vakziniert. Diese zwei Gruppen wurden 50 Tage
nach der ersten Vakzination intranasal infiziert. Eine fünfte Gruppe wurde als infizierte Kontrolltiere und
-füllen benutzt.
Die folgenden Parameter wurden gemessen:
Temperatur, Virusisolation und Identifikation, vollständige Blutzellenzahlungen, Serumneutralisationstiter und
klinische Symptome. Die obengenannten Parameter wurden sowohl bei den Stuten als auch bei den Füllen gemessen.
Die Füllen wurden auf Virus aus Blutleukocyten und Nasen-
709844/0968
PHA. 20755. 10.4.77.
muschelausscheidungen sofort nachdem sie gefunden sind
und 2 oder 3 Tage nach der Geburt geprüft. Auch die
Seren der neugeborenen Füllen wurden zum Zeitpunkt des Werfens und danach wöchentlich gesammelt. In gewissen
Fällen wurden Abschirmungsglieder über die Euter angebracht, um das Säugen nach der Entbindung zu verhindern, damit
das Erhalten einiger Precolostrum-Serumproben gesichert ist. ERP-Colostrum neutralisierende Antikörper wurden
bei gewissen Stuten gemessen. Auch viele paarweise Serumproben wurden von Füllen und Stuten bei der Geburt oder
später gesammelt.
Viele der während dieses Versuches geborenen Füllen wurden mit dem attenuierten ERP-Vakzinvirus in
einem Alter von 10 bis 21 Tagen vakziniert und diese Daten werden aus Sicherheitsgründen ber.m Versuch XXI
erwähnt. Die Daten, die bei diesem Versuch erhalten sind, sind in der nachstehenden Tabelle C angegeben.
- Tabelle C -
7098U/0968
.- 20 -
PHA.. 20755 | ο | Gruppe | 1 - Trächtige | Stuten zweimal | + 5 | + 14 | trächtige Stute hinzuge | Stuten zweimal | 512 | 256 | TABELLE C(Versuch II) | +6 +14 +21 | 256 256 256 | 256 256 512 | lebendig Tot nach | 128 512 256 | 512 512 512 | I3-5-74 2*5 | +21 | Infektion | + 7 | 1-4-74 | 5-4-74 , ν |
10.4.77 | (O | 8-2-74 | 1-3-74 | 512 | 512 | fügt bei Infektion | 1024 | 128 | 128 | ERP-Serumneutralisation und sich darauf beziehende Daten | wurde 1 Tag vor | wurde 3 Tage vor | 256 256 64 | Reboren Abort Geburt ν | 128 256 128 | >1024 512 512 | 22-4-74 _^ | 256 | + 40 | 256 | +14 +21 +05 | 23-2-74 23-2-74^ ; | |
QO | I.D. | 1 .Vakz. | 2.Vakz | 2 - Trächtige | 128 | 128 | 128 | vakziniert mit Ai83-V26-P5O-Virus | Infektion geboren | Infektion geboren | 32 1024 1024 | 27-3-74 entfernt ' | Füllen wurde 6 Tage vor | 16 512 1024 | 27-3-74 entfernt .Λ ,η | 024 | 256 | 256 | 256 128 128 | 22-4-74 | |||
.ρ- | Nr. | 0 Tage +14 | + 21 | 256 | 512 | 4 512 | 128 | 2-4-74 | 256 | 256 | 32 512 1024 | Infektion geboren | 4 256 1024 | to w | 512 | 1024 | 512 | 512 256 256 | 24-6-74 | ||||
Ρ65 | 16 512 | 1024 | 256 | 256 | 8 64 | 256 | 512 | Füllen | 512 | 4-5-74 | 512 | 28-4-74 30-4-74 "** | 024 | 1024 | 1024 | 256 256 128 | 15-5-74 | ||||||
σ | 2 128 | 256 | 512 | 2048 | infiziert | 16 | 3Ο-3-74 entfernt | 512 | nicht trächtig | 512 | 512 | 256 | 512 512 1024 | 16-4-74 | |||||||||
(O | Ρ70 | 16 512 | 512 | 512 | 1024 | 256 | 8 | 8 | + 02 | /> 16 | 8 | Hengst | 32 | 256 | 32 | 256 256 256 | 9-4—7^ 40-iwjk. | ||||||
OT | Ρ150 | 0 128 | 128 | 512 | 512 | 2 128 | a | trächtige Stute hinzugefügt | Füllen | 20-5-74 | >2 | NA 19-4-74 | trächtige Stute hinzu- | 64 | 512 512 256 | ||||||||
09 | 16 | 16 | 4 512 | bei Infektion | 21-4-74 | >32 | 64 1024 1024 1024 | ||||||||||||||||
Ρ155 | 4 256 | 512 | 8 8 | 3 - Trächtige | Hengst | Stuten einmal vakziniert mit Ai83-V26-P5O-Virus | |||||||||||||||||
Ρ157 | 8 256 | 256 | 20-2-74 | 7-4-74 ^ | |||||||||||||||||||
>32 16 | ?16 | O Taf*e +7 | + 14 | ||||||||||||||||||||
C74 | 2 64 | vakziniert mit A183-V26-P55-Virus _* | 512 | ||||||||||||||||||||
16 16 | 256 | 1024 1 | |||||||||||||||||||||
Gruppe | 2 64 | 128 | 512 | ||||||||||||||||||||
Ρ151 | 16 64 | 1024 1 | |||||||||||||||||||||
ΡΙ52 | 4 16 | 256 | |||||||||||||||||||||
ΡΙ53 | 8 32 | >16 | |||||||||||||||||||||
ρ 154** | |||||||||||||||||||||||
ΡΙ56 | |||||||||||||||||||||||
C148*" | |||||||||||||||||||||||
CI59 | |||||||||||||||||||||||
Gruppe | |||||||||||||||||||||||
ρ 160 | |||||||||||||||||||||||
ΡΙ6Ι | |||||||||||||||||||||||
ΡΙ62 | |||||||||||||||||||||||
Ρ164 | |||||||||||||||||||||||
Ρ165 | |||||||||||||||||||||||
C163 | |||||||||||||||||||||||
C158 | |||||||||||||||||||||||
gefügt bei Infektion
PHA 20753
•Η C
ro ·Η
•Η | U | R | • |
H | φ | O | R |
cd | -ρ | > | Φ |
•Η | |||
■ρ | cd | ||
3 | I | φ | |
Φ | |||
R | «! | H | J- |
< | |||
R | φ | ι | |
Φ | •d | ε | η |
H | φ | ||
H | φ | C | |
Ö | (η | •Η | |
I | Φ | η | |
φ | 3 | ||
00 | +j | ||
U | :ο | ||
φ | Ui | ||
TD" | R | ||
Φ | m | Φ | |
•Η ■^ |
3 | ||
? | cd | ||
(D | R | ||
φ | |||
•Η O
U Xi
Φ Φ
Λ O
Λ ο U
C Cd Φ
C -ρ
Φ · tD
ω«Η η
Oi C O £π H «η
■Ρ
I (π fc 3
Φ Xl
O ϋ
cd a U
C C Φ
• -P
Φ N 00
ODAi H
ώ cd ο
Ε-· > «η
-3" QO
O ·-
CV
CO MD OO CV ι- CNJ
co <! J-
CM 55MD
MD
CM ; »Λ
ι ι
I I
00 On <j| i
O <! cm t?;
MD <!
M ^
'- co ^t moo
cm co -^ «-
ΙΛ 00 ΙΛ
ι- cm <; co
ο t^sz; »λ
MD
* λ! οο ιλϊζ;
709844/0969
PHA.20755 10.4.77.
- 22 -
TABELLE C (Fortsetzung)
Gruppe 4 - Trächtige Stuten einmal vakziniert mit Ai83-V126-P55-Virus
8.2.7** Vakz. 0 Tage
+7 + 14 +21
(-40
2.4.74
Infektion
-t-7
+
+
lebendig geboren
Abort
Tot nach Geburt
P166 P167 PI69 PI70
PI7I CI68
0 2 4
32 4
16
>64 >64
128
64
256
1024
128
256
128
256 1024
512
1024
64
<4
128
512
128
1024
128
16
128
512
256
512
64
32
64 512 128 256
64 1024
16 512 128 256 256 >1O24
NA
trächtig?
trächtig?
5-4-74 23-6-74 27-3-74 trächtig?
19-2-74
(2)
Gruppe 5 - ERP-Serumneutralisationstiter bei infizierten Kontrollpferden und Füllen
Infektion | +7 | + 14 | +21 |
128 | 64 | >512 | |
8 | 16 | 4 | 128 |
2 | 0 | > 16 | 2 |
32 | 32 | 512 | 256 |
0 | 0 | 2 | 32 |
CII9 CMI74
CCI74 CMI75
CCI75
C14O und C148 waren Kontakt-Kontroll-Hengste
Stute 154 versorgte ihr Füllen nicht
starb während Geburt
abortierte 1 Tag vor der Vakzination NA
cc
CM
trifft nicht zu Versuchstier (behandelt KontrollVersuchstier
infiziertes Füllen infizierte Stuten
CO
(2.Teil - Anhang - )
Tage nach Tage nach Virus wiederge- Füllen neutralisierende
Vakz.nach er- Inf.nach er- wonnen aus Abtlter in einem Alter
Geburt folffter Geburt · Füllen Fötusvon 3-1 h Tagen
NA NA - NA
kk
h
-
122 82 τ
96 56 . - 1024
o> co>
PKA..2O75"'.
10.4.77.
Die obenstehende zum Versuch II gehörige Tabelle zeigt die Sicherheit und die Wirksamkeit des
attenuierten ERP-Vakzins nach der Erfindung. Die Pferde wurden vakziniert und infiziert und die Daten der Gruppen
1 und 2, die zweimal vakziniert wurden, und der Gruppen 3 und 4, die einmal vakziniert wurden, zeigen sowohl die
Sicherheit als auch die Wirksamkeit des attenuierten ERP-Vakzins bei trächtigen Stuten während und nach der Tracht,
und es wurde kein positives Pferde-Herpes—I—Vakzinvirus
aus den neugeborenen Füllen isoliert. Virusisölationstäbe11en.
Die Anzahlen von Virusisolationen nach der ersten und der zweiten ERP-Vakzination sind in den nachstehenden Tabellen
miteinander verglichen. Die Anzahlen von ERP-Virusisolationen, die nach Vakzination und Infektion von vakzinierten Tieren
und von Kontroll tieren durchgeführt wurden, werden miteinander verglichen.
- Tabelle D -
TABELLE D
Pferde-Herpes-Virus-Isolationen
Pferde-Herpes-Virus-Isolationen
Gruppe 1 (A183-V26-P5O) zweimal I.M.vakziniert
I.Vakz. 2.Vakz. Infektion
Tage Tage Tage
I.D. | BC NS |
0 +3 +5 | +7 | + 10 | +12 +14 0 +3 +5 +7 +10 +12 +14 | I | + + + | 0 +2 +4 +6 | +7 +g +11 +14 +17 +21 +23 +28 +48 | I | I I I I |
|
Ρ65 | DC NS |
I | I | I | II II I |
|||||||
Ρ70 | BC NS |
I | I | II II | I | |||||||
ΡΙ30 | BC NS |
I | I | I | I | |||||||
Ρ155 | BC NS |
I | I I |
I | ||||||||
σ | Ρ.137 | BC NS |
I | I I |
I | |||||||
IO 00 |
Ci4o | BC NS |
I I I |
|||||||||
*>■ O |
C7U | I I I |
||||||||||
BC NS |
I | II I | I I |
I | I | Gruppe | 2 (A183-V26-P55)- | zweimal | I.M. vakziniert | I | I | I | I | II | 271 | |
P151 | BC NS |
I | II II |
I | I | I I | I | I | I | I I I I |
.1 I I I |
I | co | |||
P132 | BC NS |
I | II | I | I I |
I I |
β I | |||||||||
P153 | BC NS |
I I |
I | I | II | |||||||||||
P154 | BC NS |
+ | + + |
I | ||||||||||||
P1j6 | BC NS |
+ | II II | II II | II I | |||||||||||
P146 | 5S | I | ||||||||||||||
P I 59 | ||||||||||||||||
TABELLE D (Fortsetzung)
O
CD
OO
CD
OO
Gruppe 3 (A183-V26-P5O ) - einmal I.M. vakziniert
Infektion
Vakz. -ι-5 +7 + 14 0 Tage +2 +4 +6 +7 + 9 +11 + 14 +17 +21 +28 +48
Vakz. -ι-5 +7 + 14 0 Tage +2 +4 +6 +7 + 9 +11 + 14 +17 +21 +28 +48
P16O BC NS |
I | I | + | I | I I |
P161 BC NS |
I | I . I |
I | III I I I I I |
|
PI62 BC NS |
I | ||||
P164 BC NS |
I | I | |||
PI65 BC NS |
|||||
C163 BC NS |
|||||
C158 BC NS |
|||||
Gruppe 4 (A183-V26-P55) - einmal I.M.vakziniert
P166 BC NS |
I | + | I I | I I I I |
P167 BC NS |
I I | |||
PI69 BC NS |
I I | |||
P170 BC NS |
||||
PI7I BC NS |
||||
C168 BC NS |
||||
I.D. | Infektion O Tapre +3 + |
I
I |
4 +5 | +7 | + 9 | + 12 | + 14 | +21 +28 |
C119 BC NS |
. xx | I |
I
I |
I | ||||
CM174BC NS |
I | I | I | I | I | I | ||
NS | I | + | I | I | ||||
CM175BC NS |
I | I | I | ..- | I | |||
CC175BC NS |
I I |
I I |
I ' I |
I | I I |
CM = infizierte Stute CC = infiziertes Füllen BC = Buffy Coat
NS = Nasenausstrich
P = Versuchstier(behandelt)
C = Kontrolltier
I = Pferde-Herpes-I-Virus
II a Pferde-Herpes-II-Virus + = nicht identifiziertes Virus
10.4.77.
Studierung der erwähnten Daten für die Gruppen 1 bis 5 der Tabelle D ergibt folgendes:
1. ERP-Vakzin war sicher, wenn es bei trächtigen Tieren in verschiedenen Phasen der Tracht verwendet wurde.
2. Vakzinierte trächtige Stuten wurden vor Abort und ERP-Symptomen geschützt, nachdem sie infiziert waren.
Drei Abkömmlinge behandelter Versuchstiere starben. Es fand ein Abort einen Tag vor der Vakzination und dem
Anfang des Versuches statt. Ein Füllen starb zwei Tage nach der Geburt infolge der Tatsache, dass die Mutter das Füllen
nicht pflegte, und ein Füllen starb während der Geburt aus einem Muttertier, das zum ersten Mal warf. Aus keinem dieser
drei Abkömmlinge wurde Pferde-Herpes-I-Virus wiedergewonnen.
Die zwei Sterbefälle während des Versuches waren einem Zufall zuzuschreiben und standen in keinem Zusammenhang
mit ERP; es wurden keine Pferde-Herpes-I-Isolate aus den
Blutleukocyten oder Nasenmuschelausscheidungen dieser Füllen
wiedergewonnen.
3. Zwölf infizierte Kontrolltiere wiesen charakteristische ERP-Symptome auf: Depression, Fieberreaktion, Anorexie
und Leukopenie. Fünf annahmeweise trächtige Kontrolltiere ergaben einen Abort und ein totes Füllen im Alter von 1 Tag.
Infektionsvirus wurde aus beiden Abkömmlingen wiedergewonnen. Zwei Stuten warfen lebendige normale Füllen, und zwar
eine 15 Tage und die andere 5 Tage nach der Infektion.
Aus diesen beiden Füllen wurde kein Infektionsvirus wieder-
709844/0960
PILA. 20755-
10.^.77-
gewonnen. Es ist zweifelhaft, ob die verbleibende infizierte Stute überhaupt trächtig war.
4. Erhebliche ERP-passive Immunität wurde über das
Colostrum auf die Abkömmlinge übertragen, vorausgesetzt, dass der Zeitraum zwischen der Infektion und der Entbindung
genügend war.
5· Aus der Tatsache, dass keine Zunahme von neutralisierenden
Antikörpertitern und negativer Virusisolation auftrat, geht hervor, dass das Vakzin nicht auf die zwei
Kontakt-Kontrollstuten oder auf die zwei in demselben Raum gehaltenen Hengste übertragen war.
Versuch III
Versuch III
Der folgende Versuch wurde entworfen, um Information zu erhalten über
a)die Sicherheit des Vakzins bei Füllen, wie aus klinischen Symptomen und klinischen Pathologieuntersuchungen hervorgellt;
b) das Bestimmen, wenn ein Füllen mit Rücksicht auf die
von der Mutter stammenden Antikörper vakziniert werden darf;
c) welchen Typ Virusisolationsmuster bei einem vakzinierten
Füllen im Alter von zwei Wochen erhalten wird, und
d) die Wirksamkeit der ERP-passiven Antikörper.
Die folgenden Parameter wurden im Versuch III gemessen; Gruppen 1 bis k: Körpertemperatur, vollständige
Blutzellzählungen, Virusisolationen aus den Nasenmuschel·"
ausscheidungen und Blutleukocyten, ERP-neutralisierende
Antikörpertiter und tägliche Prüfungen auf klinische Symptome der Krankheit.
7098U/0968
PHA. :>-')';5?
> 10.it.77-
Gruppe 1 - ERP-Vakzinationsreaktion von Füllen;
Diese Gruppe von acht Füllen stammte von Stuten mit einer gut dokumentierten Vorgeschichte in bezug auf
ihren ERP-Zustand. Die Füllen wurden intramuskulär mit einer einzigen gefriergetrockneten Dosis von 1 ml des
A183 V26 P55-ERP-Vakzins mit 105>8Logs des Virus pro
0,2 ml vakziniert, wobei diese Menge mit Hilfe sterilen Wassers vor dem Gebrauch auf 2 ml aufgefüllt wurde.
Gruppe 2 - ERP-Vakzinationsreaktion von Füllen:
a) Füllen Nr.6 war ein Waise. Von der Mutter dieser Waise
war keine ERP-Vorgeschichte verfügbar.
b) Füllen Nr. 7^ stammte von einer infizierten Kontrollstute,
die 5 Tage nach einer intranasalen Infektion mit virulentem ERP-Virus ein Füllen warf. Das Infektionsvirus wurde aus der
Stute isoliert, aber nach der Entbindung wurde kein ERP-Virus aus dem Füllen isoliert. Es war klar, dass keine Zunahme
von ERP-Colostrum-Antikörpern im kurzen Zeitintervall vor der Geburt und nach der Infektion stattfand.
Gruppe 2 - Füllen die intranasal mit virulentem ERP-Virus infiziert sind:
Diese Gruppe von Füllen bestand aus vier Füllen, die intranasal mit Hilfe eines Katheters mit 10 ml virulentem
2 7 ERP-Virus infiziert waren, das 10 ''Logs Virus pro 0,2 ml enthielt. Die ERP-Vorgeschichte der betreffenden Stuten
war gut dokumentiert.
709844/0968
PtLA.
10.4.77.
Gruppe h :
Diese Gruppe bestand aus zwei Füllen, die von Müttern
mit einer unbekannten ERP-Vorgeschichte stammten.
Die Füllen wurden auf gleiche Weise wie die Füllen der Gruppe 3 infiziert.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in den nachstehenden Tabellen E und F erwähnt.
- TABELLE E und F
709844/0968
Daten von Stute und Füllen
Gruppe 1: vakzinierte Füllen (von Stute vakziniert und/oder infiziert vor dem Werfen),
denen eine Dosis A183 V26 P55-Virus verabreicht wurde.
•Zustand der Stute
,bei der Entbindung
,bei der Entbindung
ERP-neutralisierende Antikörper-Titer des Füllens
O CO OO
CO 09 OO
I | ,keine Inf. | Tage | Tage | ERP- | Inform. | Stunden oder | 3-IO Tage | Alter und | neutrali- | I | - 64 | |
Stute und | ,keine Inf. | nach | nach | neu tr . | nicht | , Tage nach | 256 | sierender | Ab-Titer | |||
Füllen | , infiziert | 1.Vakz. | Infekt | . Titer | verfüpb. | der Entbindung | 256 | bei Vakz. | und/oder | |||
Nr. | , infiziert | 59 ■ | NA | 512 | 0-16 Stunden | 128 | Infektion | |||||
48 | Gruppenbezeichnung | , infiziert | 47 | NA | 512 | 0 | 16 | 11 Tage | ||||
65 | 1 χ vakz. | , infiziert | 94 | 41 | 256 | 1024 | 64 | 23 Tage | - 512 | |||
151 | 2 χ vakz. | ,infiziert | 73 | 20 | 128 | 0 | 512. | 9 Tage | - 128 | |||
152 | 2 χ vakz. | , infiziert | 61 | 21 | 256 | 4 | 64 | 10 Tage | - 16 | |||
162 | 2 χ vakz. | vakzinierte | 55 | 15 | ' 512 | 32 | 1024 | 10 Tage | - 64 | |||
163 | 1 χ vakz. | Teilgruppe | 84 | 44 | 128 | 4 | 22 Tage | - · 64 | ||||
165 | 1 χ vakz. | keine Vakz.,keine Inf | 06 | 56 | 256 | 32 | 7 Tage | - 64 | ||||
171 | 1 χ vakz. | Füllen | 512 | 128 | 9 Tage | -1024 | ||||||
1 χ vakz. | A (keine | Daten der Stuten | ||||||||||
Gruppe 2: | NA | NA | ||||||||||
6 | Inform. | 22 Tage | ||||||||||
nicht | ||||||||||||
verfÜKb. | ||||||||||||
Teilgruppe B (ungenügende Zeit für Uebertragung von passivem Ab von Stute auf Füller:
keine Vakz.,infiziert
NA
31 Tage - 4
TABELLE E (Fortsetzung)
Gruppe 3: infizierte Füllen (von Stuten vakziniert und/oder infiziert vor deip Werfen),
denen ein wilder Typ Ai83-Virus I.N. verabreicht wurde.
denen ein wilder Typ Ai83-Virus I.N. verabreicht wurde.
Zustand der Stute bei der Entbindung ERP-neutralisierende Antikörper-Titer
des Füllens
Stute und
Füllen
Nr. Gruppenbezeichnung
Tage Tage ERP-nach nach neutr. I.Vakz. Infekt. Titer
68 1 χ vakz.,infiziert
70 2 χ vakz.,infiziert
1^5 2 χ vakz.,infiziert
157 2 χ vakz.,infiziert
78 | 483 | 512 |
85 | 32 | O |
101 | 48 | 512 |
72 | 19 | 128 |
Stunden oder
Tage nach
der Entbindung
0-16 Stunden 3--10 Tage
Alter und neutralisierender Ab-Titer bei Vakz. und/oder Infektion
1024
1024
32
512
13 Tage
11 Tage
16 Tage
11 Tage
256
512
64
512
Gruppe 4: infizierte KontrollfUllen (nicht vakzinierter und nicht infizierter Stuten),
denen ein wilder Typ Ai83-Virus I.N. verabreicht wurde.
denen ein wilder Typ Ai83-Virus I.N. verabreicht wurde.
174
175
NA
NA
NA
NA
NA Inform, nicht verfügb.
NA " Inform.
nicht
verfügb.
Inform.
nicht
verfügbar
14 Tage -
20 Tage -
CO
CD
ΡΗΛ. 20755.
10.4.77.
Versuch III - Teil B Füllen-Virus-Isolation, Identifikation und/oder Infektion
Gruppe 1 - vakzinierte Tiere
BC NS |
'+3 +5 | +7 | + 9 +10 +12 +13 +1'» +21 +27 | |
BC NS |
I | + | ||
65 | BC NS |
I | ||
151 | BC NS |
I | + | |
152 | BC NS |
I I I |
I I |
I |
162 | BC NS |
I | I | |
163 | BC NS |
III | ||
165 | BC NS |
I | I | I |
171 * |
I | I | ||
BC NS |
Gruppe | + | - vakzinierte | Tiere | II II |
II I | |
6 | BC NS |
I | + | ||||
7h | I | I II | II II | ||||
BC NS |
Gruppe 3 | - Füllen | mit | I I |
passivem | ERP- | -Ab infiziert | |
68 | BC NS |
I | I | I | ||||
70 | BC NS |
I | I | I | ||||
155 | BS | I I |
I I |
I I |
I | |||
157 | I | I | ||||||
BC NS |
Gruppe | I | infizierte | Kontrollfüllen | I | |
BC NS |
I I |
+ | I | I I |
||
174 | I I |
I I I I |
I | |||
175 | I | |||||
NA = trifft nicht zu I= Pferde-Herpes-I-Virus
Ab = Antikörper II= Pf erde-IIerpes-II-Virus
+ = nicht identifiziertes Virus
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10.4.77.
Kein einziges der vakzinierten Füllen wies
einige ungünstige klinische Symptome auf. Dann und wann wurde Streptococcus Zooepidemicus-Bakterie aus nasalen Durchgängen
während seltener Nasenausflüsse isoliert, deren Muster in keinem Zusammenhang mit dem ERP-Vakzin stand.
Keines der vier infizierten Füllen (Gruppe 3), die ERP-Colostrum—Antikörper enthielten, wurde krank oder
deprimiert, wie die infizierten Füllen ohne ERP-Golostrum— Antikörper. Es wurde gefunden, dass die normale Körpertemperatur
der Füllen höher als die der entsprechenden erwachsenen Tiere war. Auch Stress infolge der Umgebung,
wie das Verkehren mit den Füllen und das Liegen in der warmen Sonne, schien einen grösseren Einfluss auf die
Temperaturschwankungen auszuüben. Eine Neigung zur Leuko— penie kommt, wie gefunden wurde, im allgemeinen bei den
vakzinierten Füllen zwischen dem dritten und dem siebenten Tag vor. Die Leukopenie ist ernster in den infizierten
Kontrolltieren als in den vakzinierten Füllen.
Bei den infizierten Füllen ohne ERP-Antikörper wurde eine auffällige Fieberreaktion zwischen dem zweiten
und dem sechsten Tag nach der Infektion festgestellt.
Es stellte sich heraus, dass keine konsequente Temperaturzunahme nach ERP-Vakzination oder bei mit ERP infizierten
Füllen mit vielen ERP-passiven Antikörpern auftrat. Ein Füllen (155) mit der geringsten Anzahl von ERP-Antikörpern
( 1 : 6h) wies eine Temperaturerhöhung gleich der
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PHA. 20755-10.it. 77.
der infizierten Kontrollfüllen auf, aber es wurde keine Depression oder Anorexie gefunden.
Die folgenden auffälligen Punkte ergeben sich aus den experimentell erhaltenen Daten:
1. Das kalt angepasste (26°C) Vero-Zell-Virus vervielfacht sich in vivo , wenn es intramuskulär verabreicht
wird, und erzeugt eine schützende (humorale und zellgebundene) Immunität gegen virulentes ERP-Infektionsvirus, das intranasal
verabreicht wird.
2. Das Vakzinvirus ist nichtpathogen, wenn es trächtigen" Stuten und Füllen mit verschiedenen ERP-immunologischen
Hintergründen verabreicht wird.
3· Das Vakzinvirus kann aus Pferden, die vorher ERP ausgesetzt worden sind (durch ERP-neutralisierende Antikörper
gemessen), oder aus Tieren ohne neutralisierende Antikörper isoliert werden. Das Virus kann häufig aus
gewaschenen Blutleukocyten oder manchmal aus den Nasenmuschelausscher.dungen
wiedergewonnen werden. k. Das ERP-Vakzinvirus wird nicht mittels Kontaktinfektion
übertragen, was aus dem Fehlen von Serokonversion bei Kontakt-Kontrolltieren und aus negativen Virusisolationsdaten
von Kontrolltieren hervorgeht.
5. Neutralisierende Antikörpertiter vakzinierter Tiere sind günstig in bezug auf diejenigen, die durch
virulentes ERP—Infektionsvirus induziert werden.
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FHA. 20755.
lt 10.4.77.
6. Passiv auf Füllen übertragener hoher ERP-Antikörpertiter,
der vom Colostrom herrührt, schützt offenbar (keine sichtbaren Symptome) die Füllen vor virulentem Infektions—
ERP-Virus.
7· Zellgebundene Immunität spielt, wie gefunden wurde,
eine wichtige Rolle beim Schützen von Pferden vor ERP-Abort und klinischen Symptomen von ERP, aber bisher wurde kein
geeignetes Verfahren gefunden, um ERP-zellulare Immunität anders als durch direkte Infektionsexperimente zu bestimmen.
Die Anzahl von Virusisolaten, die nach Vakzinationen
mit einem sich vervielfachenden ERP-Vakzin oder Infektion
mit ERP-virulentem Virus wiedergewonnen wird, ist grösstenteils von dem Typ und dem Ausmass der Immunität abhängig,
die der Wirt aufweist. Virusisolationen von Füllen mit vielen vom Colostrom herrührenden ERP-neutralisierenden
Antikörpern kommen am meisten vor. Diese Füllen weisen annahmeweise humorale Immunität auf, die, je nach dem
Ausmass derselben, bei Infektion mit virulentem Virus die Symptomatologie verbessert. Humorale Immunität ist
aber nahezu nicht oder gar nicht von Bedeutung für das Blockieren eines Virusträgerzustandes. Dagegen induziert
durch Virusinfektion induzierte aktive Immunität, sowohl wenn es sich um ein sich vervielfachendes Vakzinvirus als
auch wenn es sich um ein virulentes Virus handelt, sowohl zellgebundene als auch humorale Immunität. Aus den Daten
geht hervor, dass nach einer Wiederinfektion mit sich
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PHA. 2C755. 10.4.77.
vervielfachendem Vakzinvirus oder virulentem Virus der
Virusträgerzustand praktisch eliminiert ist; dies ist jedoch nicht absolut. Es ergibt sich, dass dieser Zustand
in nicht-ERP-empfindlich gemachten Tieren und in zuvor mit ERP empfindlich gemachten Tieren, basierend auf
Antikörpertitern, besteht. Es ist klar, dass zellulare Immunität sowie humorale Immunität mit der Zeit abnehmen.
Die Zeitperiode, die für die Erschöpfung von ERP-zellularer Immunität benötigt wird, ist zur Zeit nicht bekannt.
8. Das ERP—Vakzinvirus passiert die plazentare
Barriere nicht, was sich aus den negativen neutralisierenden Precolostrum—Serumproben von acht neugeborenen Füllen
ergibt. Auch wurde kein positives Pferde-Herpes-I-Vakzinvirus
aus 18 neugeborenen Füllen isoliert, die von vakzinierten und infizierten Stuten stammten. Veiter stellt sich heraus,
dass Kurven für die Erschöpfung passiv erzeugter ERP-neutralisierende Antikörper von fünf isolierten Füllen
in bezug auf ihren Abfall keine Unterbrechung aufweisen, was auf das Fehlen von Infektion in utero mit Herpes—I-Virus
hindeutet, weil sich zeigt, dass keine aktive Induktion von Herpes-I-Antikörpern auftritt.
9. ERP Vakzinvirusisolationen wurden häufiger aus Blutleukocyten als aus den Nasenmuschelausscheidungen
wiedergewonnen. Dies trifft auch für intranasal verab» reichtes Vakzinvirus zu. Obgleich nur zwei der vier
behandelten Versuchstiere Isolate erzeugten, rühren diese
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PRA. 20753.
10.4.77.
beide von Blutleukocyten her. Viele der Virus(Vakzin)—Isolationen,
die bei den Versuchen wiedergewonnen wurden, können von kleinen Mengen Blut herrühren, das aus Haargefässen
absorbiert wird, die beim Entnehmen von Proben mit einem Nasenwischer mit einer Länge von 15 cm bei sich bewegenden
Tieren beschädigt sind. Selbstverständlich gingen einige Nasenausstrichproben infolge der Infektion mit Bakterien
und Schimmeln verloren.
10. Drei deutliche Fälle klinischer Unterdrückungen ergaben sich und viele Isolationen von Streptococcus zooepidemicus,
Streptococcus equisimilis, Strep-Gruppe E.Staph Aureus, traten auf, während ein Füllen, wie gefunden
wurde, Streptococcus Equi aufwies. Diese Bakterien wurden periodisch aus den Versuchstieren isoliert. All diese
Bakterien können klinische Symptome von Fieber und/oder Nasenausfluss herbeiführen, so dass sie vielfach kontrolliert
wurden, um dazu beizutragen, die Ursache jeder klinischen Abnormalität zu bestimmen, die die Neigung haben kann,,
die erzielten Ergebnisse bei den Versuchtieren zu verwirren. In vielen Fällen waren die bakteriellen Ausbrüche sehr
deutlich, wenn die Temperaturtabellen des Pferdes und die Gesamtleukocytentabelle betrachtet wurden.
Streptococcus zooepidemicus ist häufig ein Agens, das von dem Pferde-Rhinopneumonievirus begleitet wird,
was wegen des allgegenwärtigen Charakters desselben in der Pferdepopulation nicht überraschend ist. Es scheint,
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PHA. 20 755.
dass jede ernste Stress-Erscheinung im Pferde zur Folge haben kann, dass Streptococcus zooepidemicus erzeugt wird.
Kurz zusammenfassend bezieht sich die Erfindung
auf ein Vakzin und auf das Verfahren zur Herstellung dieses Vakzins. Ein virulentes Ai83-Isolat eines Pferde-Herpes-I-Virus
wurde in einer Monoschicht einer dauernden Vero-Zellinie eingeführt, die 3 bis 5 Tage lang bei 37°C inkubiert
wurde, und die Cytopathologie der Zellen wurde vervollständigt. Eine frisch hergestellte stabile Monoschicht
von Vero-Zellen wurde mit einem Teil des erzeugten geernteten Virus inokuliert. Die Kultur wurde aufs neue
inkubiert, um Cytopathologie wenigstens eines Teiles der Gewebezellen herbeizuführen. Dann wurde ein Teil des erzeugten
Virus wenigstens 30 Reihendurchgängen bei einer Inkubationstemperatur von 260C unterworfen und das immunologisch
wirksame lebendige avirulente Virus wurde gewonnen.
Es wird dem Fachmann klar sein, dass verschiedene Abwandlungen im Rahmen der Erfindung möglich sind.
709844/0968 /
* m
Claims (1)
- Verfahren zur Herstellung eines immunologisch wirksamen attenuierten lebendigen Pferde-Rhinopneumonie-Herpesvirus, dadurch gekennzeichnet, dassa) ein lebendiges virulentes Pferde-Rhinopneumonievirus in eine Gewebezellkultur eingeführt wird;b) die Kultur inkubiert wird, bis die zellulare Cytopathologie deutlich wird;c) ein Teil des auf diese Weise erzeugten Virus geerntet und das geerntete Virus aufs neue in frische Gewebekulturen eingeführt wird;d) das Virus in Gewebekulturen Reihendurchgangen während einer genügenden Anzahl Male bei einer Temperatur unterworfen wird, die genügt, um ein immunologisch wirksames lebendiges avirulentes Virus zu erzeugen,unde) dieses Virus aus dem Gewebekulturmedium wiedergwonnen wird.2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Gewebezellkultur die·Vero-Zellkultur verwendet wird, 3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationstemperatur bei den Seriendurchgängen auf einer Temperatur im Bereich von etwa 23 bis etwa 33°C gehalten wird.h. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationstemperatur bei jedem Seriendurchgang auf etwa 260C gehalten wird.709844/0968PHA.20755. 10.4.77.5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Seriendurchgang mindestens 30 Male durchgeführt wird.6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 50 Seriendurchgänge bei einer Inkubationstemperatur von etwa 23 bis etwa 330C durchgeführt werden. 7· Verfahren zur Herstellung eines immunologisch wirksamen attenuierten lebendigen Pferde-Rhinopneumonievirus, dadurch gekennzeichnet, dassa) ein lebendiges virulentes Pferde-Rhinopneumonievirus in eine Monoschicht einer dauernden Vero-Zellinie eingeführt wird;b) die Kultur etwa 3 bis etwa 5 Tage lang bei einer Temperatur von 37°C inkubiert wird, bis die Cytopathologie der Zellen nahezu vollständig ist;c) ein Teil des auf diese Veise erzeugten Virus geerntet und das geerntete Virus in eine frisch hergestellte stabile Monoschicht von Vero-Zellen eingeführt wird;d) diese Kultur bei einer Temperatur von etwa 26°C während einer Zeitspanne inkubiert wird, die genügt, um Cytopathologie wenigstens eines Teiles der Gewebezellenzu erhalten;e) fein Teil des auf diese Weise erzeugten Virus wenigstens *»5 Seriendurchgängen über stabile Vero-Zellen bei einer Inkubationstemperatur von etwa 26°C unterworfen wird, um ein immunologisch wirksames lebendiges avirulentes Virus zu erzeugen, und _709844/0968PHA.2O751. ο 10.4.77.f) dieses Virus aus dem letzten Seriendurchgang wiedergewonnen wird.8. Attenuiertes lebendiges Pferde-Herpes-I-Virusvakzln, das eine wirksame Menge immunologisch wirksamen avirulenten lebendigen Pferde-Herpes-I-Virus enthält, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus dadurch hergestellt wird, dass:a) ein lebendiges virulentes Pferde-Herpes-I-Virus in eine Gewebezellkultur eingeführt wird;b) die Kultur inkubiert wird, bis die zellulare 6ytopatho— logie deutlich wird;c) ein Teil des auf diese Weise erzeugten Virus geerntet und das geerntete Virus aufs neue in eine frische Gewebekultur eingeführt wird;d) Seriendurchgang des Virus in einer Gewebekultur während einer genügenden Anzahl Male bei einer Temperatur wiederholt wird, die genügt, um ein immunologisch wirksames lebendiges avirulentes Virus zu erzeugen;e) das Virus aus dem Gewebekulturmedium wiedergewonnen wird, undf) das wiedergewonnene Virus einer stabilisierenden Lösung zugegeben wird, um aus dieser ein Vakzin zu erhalten.9. Vakzin nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Gewebezellkultur die Vero-Zellkultur verwendet wird.10. Vakzin nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,7098U/0968PHA. £0 735-10.4.77.dass die Inkubationstemperatur der Seriendurchgängeauf einem Wert im Bereich von etwa 23 bis etwa 330C gehalten11. Vakzin nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationstemperatur bei jedem Seriendurchgang auf-etwa 26°C gehalten wird.12. Vakzin nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Seriendurchgang mindestens dreissigmal durchgeführt wird.13· Vakzin nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens $0 Seriendurchgänge bei einer Inkubations-temperatur von etwa 23 bis etwa 33°C durchgeführt werden. Ak. Attenuiertes lebendiges Pferde-Rhinopneumonievirusvakzin, das eine wirksame Menge immunogen wirksamen avirulenten lebendigen Pferde-Rhinopneumonievirus enthält, das durch ein Verfahren erhalten ist, das dadurch gekennzeichnet ist, dass:a) ein lebendiges virulentes Pferde-Rhiinopneuraonievirue in iü -ein-e MaBastXi±>dh± aäiüner dauernden Vero-Zellinie eingeführt wird;b) die Kultur etwa 3 bis 5 Tage lang bei einer Temperatur von 37°C inkubiert wird, bis die Cytopathologie der Zellen nahezu vollständig ist;c) ein Teil des auf diese Weise erhaltenen Virus geerntet und das geerntete Virus in eine frisch hergestellte stabile Monoschicht von Vero-Zellen eingeführt wird;709844/0968PHA. 20755. 10.4.77.d) diese Kultur bei einer Temperatur von etwa 26°C während einer genügend langen Zeit inkubiert wird, um wenigstens in einem Teil der Gewebezellen Cytopathologie zu erhalten;e) ein Teil des auf diese Weise erhaltenen Virus wenigstens 45 Seriendurchgängen über stabile Vero-Zellen bei einer Inkubationstemperatur von etwa 26°C unterworfen wird, um ein immunogenes wirksames lebendiges avirulentes Virus zu erzeugen, undf) dieses Virus aus dem letzten Seriendurchgang wiederge-. wonnen wird.15· Verfahren zum Schützen der Familie von Einhufern vor Pferde-Rhinopneumonievirusinfektion, bei dem den Tieren eine wirksame Dosis eines lebendigen attenuierten ERP-Virusvakzins verabreicht wird, das durch ein Verfahren hergestellt ist, das dadurch gekennzeichnet ist, dass:a) ein lebendiges virulentes ERP-Virus in eine Gewebezellkultur eingeführt wird;b) die Kultur inkubiert wird, bis die zellulare Cyto- ;pa±hologie deutlich wird;c) ein Teil des auf diese Weise erzeugten Virus geerntet und das geerntete Virus aufs neue in eine frische Gewebekultur eingeführt wird;d) Seriendurchgang des Virus in Gewebekultur während einer genügenden Anzahl Male bei einer derartigen Inkubationstemperatur wiederholt wird, dass ein immunogen wirksames avirulentes Virus erhalten' wird, und709844/0968PHA. 20755 10.4.77.e) dieses Virus aus dem Gewebekulturinedium wiedergewonnenwird.16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Gewebezellkultur eine Vero-Zellkultur verwendet wird.17· Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationstemperatur bei den Seriendurchgängen auf einem Wert im Bereich von etwa 23 bis etwa 33°C gehalten wird.18. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationstemperatur bei jedem Seriendurchgang auf etwa 26°C gehalten wird.19· Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 30 Seriendurchgänge durchgeführt werden.20. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 50 Seriendurchgänge bei einer Temperaturvon etwa 23 bis etwa 350C durchgeführt werden.21. Verfahren zum Schützen von Pferden vor ERP-Virusinfektion,· bei dem den Pferden eine wirksame Dosis eines lebendigen attenuierten ERP-Virusvakzins verabreicht wird, das durch ein Verfahren hergestellt ist, das dadurch gekennzeichnet ist, dass:a) ein lebendiges virulentes ERP-Virus in eine Monoschicht einer Gewebezellkultur, die von Vero-Zellen abgeleitet ist, eingeführt wird;b) die Kultur etwa 3 bis 5 Tage lang bei einer Temperatur709844/0968PHA.20755-7 1von etwa 35°C inkubiert wird, bis Cytopathologie der Zellen nahezu vollständig ist;c) ein Teil des auf diese Weise erzeugten Virus geerntet und das geerntete Virus aufs neue in eine frisch hergestellte Monoschicht von Vero-Zellen eingeführt wird;d) diese Kultur bei einer Temperatur von etwa 260C während einer genügend langen Zeitspanne inkubiert wird, um wenigstens bei einem Teil der Zellen Cytopathologiezu erhalten;e) ein Teil des auf diese Weise erzeugten Virus mindestens 5O Seriendurchgängen über Vero-Zellen bei einer Inkubationstemperatur von etwa 26°C unterworfen wird, um ein iramunogen wirksames lebendiges avirulentes Viruszu erzeugen, undf) dieses Virus aus dem letzten Seriendurchgang wiedergewonnen wird.709844/0968
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