DE2512903A1 - Katzen-rhinotracheitis-vakzine und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

Washington Crossing, N.J., V.St.A.

¹¹ Katzen-Rhinotracheitis-Vakzine und Verfahren zu ihrer Herstellung "

Priorität: 25. 3- 1974, V.St.A., Nr. 454 345

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Infektiöse virale Katzen-Rhinotracheitis ist eine speziell bei Katzen auftretende, verbreitete, ernsthafte Erkrankung, die durch den Katzen-Herpesvirus verursacht wird. Dieses Virus ist der Erreger der viralen Katzen-Rhinotracheitis (FVR = "feline viral rhinotracheitis". In der Literatur wird darauf hingewiesen, daß etwa die Hälfte der Infektionen der Atmungswege bei Katzen auf diese Krankheit zurückzuführen ist. Dieses Virus infiziert die Epithelzellen der Nase, des Rachens, der Luftröhre und der Augen und ruft dabei Epitheliolyse und Nekrose hervor. Die an den Augen auftretenden Symptome betreffen vor allem die Bindehaut, es kann sich jedoch auch ulzerative Keratitis entwickeln. Das Virus wird während der

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Krankheit aus Nase, Augen und Mund, ausgeschieden. Durch das FVR-Virus hervorgerufene Infektionen sind oft schwerwiegend und verlaufen insbesondere bei Jungtieren signifikant tödlich. Werden trächtige Katzen von dem Virus befallen, so

zu generalisierten

kommt es/Aborten oder/Infektionen bei den neugeborenen Tieren. Die Übertragung des FVR-Virus auf gegenüber dem Virus anfällige Katzen geschieht im allgemeinen durch intranasale Instillation, z.B. durch beim Nießen ausgestoßene Tröpfchen oder durch direkten Kontakt, im allgemeinen von Nase zu Nase. Die Resistenz bei Tieren, die sich von einer natürlichen oder experimentiellen Infektion erholt haben, ist nur von kurzer Dauer (1 bis 3 Monate.).

Das die Katzen-Rhinotracheitis hervorrufende Virus wurde zuerst von infizierten Katzen isoliert; vgl. R.A. Crandell und F. D. Maurer, Proc. Soc. E>.ptl. Biol. and Med., Bd. 97 (1958), S. 487. Die Bezeichnung Katzen-Rhinotracheitis (f line viral rhinotracheitis) wurde von R.A. Crandell und E. \I. Despeaux, Proc. Soc. Exptl. Biol. and Med., Bd. 101 (1959), S. 494, vorgeschlagen. Seit dieser Zeit sind eine Reihe von Arbeiten erschienen, die die Isolierung des FVR-Virus von Katzen bestätigen. In diesen Arbeiten wird dieses Virus als der Gruppe der ■ Herpesviren zugehörig identifiziert und ferner werden Transmission, Epidemiologie und histologische Eigenschaften dieser Krankheit beschrieben; vgl. J.L. Bittle et al., Amer. J. Vet. Res., Bd. 21 (196ο) S, 547; R.A. Crandell et al., J.A.V.M. A., Nd. 138 (1961) S. 191; J. Ditchfield und I. Grinyer, Virology, Bd. 26 (1965) S. 504; R.H. Johnson und R.G. Thomas,

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Vet Rec, Bd. 79 (1966), S. 188; R. C. Povey, Vet. Rec, Bd. 82 (1969), S. 335; T.E. Walton und I.H. Gillespie, Cornell Vet., Bd. 60 (1970), S. 232; Colloquium Report, J.A.V.M.A., Bd. 157 (1970), S. 2043; R. A. Crandell, J.A.V.M.A., Bd. 158 (1971), S. 922; und S. I. Bistner et al., J-.A.V.M.A. , Bd. 159 (1971), S. 1223. Ferner findet sich in 'Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine¹; Herausgeber C. A. Brandly und C. E. Cornelius, Academic Press, Inc., New York, 1973, Bd. 17, S. 201 bis 224, ein Übersichtsartikel von R. A. Crandel mit der Kapitelüberschrift "Feline Viral Rhinotracheitis (FVR)".

In der Literatur wird über eine Reihe von Versuchen berichtet, eine Vaccine gegen das FVR-Virus herzustellen. Keiner dieser Versuche hat jedoch zum Erfolg geführt. Povey und Johnson, J. Small Anim. Pract., Bd. 11 (1970), S. 490, berichten, daß Immunisierungsversuche durch intramuskuläre Verabfolgung einer nicht-attenuierten FVR-Virus-Vaccine fehlschlugen. Obgleich diese Autoren beobachteten, daß sich bei Versuchskatzen bei Verwendung von FVR-Virus-Vaccinen, die durch Behandlung mit Formalin und ß-Propiolacton inaktiviert waren, Erfolge erzielen ließen, mußten sie jedoch feststellen, daß mit Hilfe dieser Vaccinen kein signifikant verminderter Krankheitsbefall bei Katzenkolonien erreicht werden kann. Bisher gibt es somit keine wirksamen Vaccinen zum Schutz von Katzen gegen das FVR-Virus.

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Aufgabe der Erfindung war es daher, eine Vaccine gegen Katzen-Rhinotracheitis zur Verfügung zu stellen.

Es würde erfindungsgemäß festgestellt, daß das FVR-Virus auf Katzengewebekultüren, vorzugsweise. Nieren- und Zungengewebekulturen vermehrt werden kann und daß die Virulenz des Virus so verändert und vermindert werden kann, daß nach parenteraler Inokulation keine KrankheitsSymptome mehr auftreten.

Demzufolge wird erfindungsgemäß ein modifizierter oder attenu-

Verfügunq gestellt,/

ierter Stamm von lebenden FVR-Viren zur / der bei parenteraler, vorzugsweise intramuskulärer Verabreichung an Katzen eine Immunisierung gegen die virulente Katzen-Rhinotracheitis bewirkt.

Ferner wird erfindungsgemäß eine Vaccine zur Verfügung gestellt, die in einem solchen Ausmaß attenuiert ist, daß bei ihrer Anwendung eine Antikörperreaktion hervorgerufen wird, die zu einer Langzeitimmunisierung von Katzen ausreicht.

Die erfindungsgemäße Vaccine erlaubt eine sichere Anwendung und verursa cht bei Katzen nach parenteraler Verabfolgung keine Erkrankungen. Außerdem findet keine Übertragung des modifizierten FVR-Virus von geimpften Tieren auf andere, mit diesen in Kontakt kommende Tiere statt. Dadurch wird die Möglichkeit einer erhöhten Virulenz des Virus nach einer Tierpassage ausgeschlossen. Dies stellt einen wesentlichen Vorteil zur Bekämpfung der viralen Katzen-Rhinotracheitis dar.

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Lebende, virulente FVR-Viren lassen sich nach üblichen Verfahren von mit viraler Katzen-Rhinotracheitis befallenen Katzen isolieren und sodann auf übliche Weise identifizieren; /vgl.R. A. Crandell und F. D. Maurer, Proc. Soc. Exptl. Biol. und Med., Bd. 97 (1958), S. 487; J. L. Bittle et al., Amer. J. Vet. Res., Bd. 21 (I960), S. 547 und J.Ditchfield und I. Grinyer, Virology, Bd. 26 (1965), S. 5OkJ.Im allgemeinen wird das Virus durch Abtupfen der Nasen- und Bindehautmembranen von infizierten Katzen mit einem feuchten, sterilen, Wattetupfer gewonnen. Anschließend wird das Virus in ein geeignetes Züchtungsmedium mit Katzengewebe gebracht. Zur Replikati on und Isolation wird das Virus Standardserienpassagen unterworfen. Ein bevorzugt verwendetes Medium erhält man aus corticalem Nierengewebe von 8- bis 12-Wochen alten Kätzchen, das gemäß dem von J. Youngner (Proc* Soc. Exptl. Biol. and Med., Bd. 85 (1954), S. 202,für Affennierenzellen beschriebenen Verfahren trypsinisiert worden ist.

Bezüglich der Herstellung der Vaccinen der Erfindung wurde

sich

festgestellt, daß/die Attenuierung und Modifikation des virulenten FVR-Virus leicht erreichen läßt, indem man relativ wenige, mindestens etwa 7 Serienpassagen in Katzengewebe bei Inkubationstemperaturen von etwa 30 +_ 2⁰C, vorzugsweise etwa 32⁰C, durchführt. Die Reinigung des Viruspräparats kann mit Hilfe von Standard-Grenzverdünnungen, beispielsweise nach dem Röhrchen- oder Plaqueverfahren, während oder anschließend an die Serienpassagen durchgeführt werden.

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Das FVR-Virus kann beispielsweise in folgenden Katzengewebe-Züchtungssystemen vermehrt werden: Lungen-, Hoden-, Nieren-, Thymus-, Zungen- und embryonalem Fetusgewebe, ferner ZeIl-

Katzen-/

linien, z.B. die/nieren-Zellinie nach Crandell (CrFK), Katzenzungenzellen auf der Stufe der dritten Passage (FcjJTg) und die Katzen-Neurofibrosarkom-Zellinie (FNFS). Katzenzungen-Zelllinien werden besonders bevorzugt.

Die Dauer der Passagen wird so gewählt, daß

eine ausreichende Replikation des Virus zwischen den Passagen möglich ist. Bevorzugt werden Zeiträume von 2 bis 7 Tagen. Die optimale Dauer der Passagen läßt sich leicht

nach üblichen Verfahren bestimmen, beispielsweise durch zytopathische Beobachtungen, in dem man z.B. das Virus während einer bestimmten Passage bis zu einem Stadium wachsen läßt, nach dessen Erreichen bei andauernder Inkubation ein starker zytopathischer Effekt (CPE) beobachtet werden kann.

Die Tatsache, daß man bei den angegebenen niederen Temperaturen zu wertvollen Vaccinen gelangt ist überraschend in Hinblick auf die bekannte Tatsache, daß das Virus bzw. dessen Pathogenität bei Serienpassagen in Katzengewebe bei üblichen Inkubationstemperaturen von etwa 35 bis 37°C sich nicht ver-

auch
ändert und zwar/nach Durchführung von 100 Passagen; vgl.

R. A. Crandel, J.A.V.M.A., Bd. 158 (1971), S. 922. Wie sich beispielsweise aus nachfolgendem Beispiel 3 ergibt, läßt sich erfindungsgemäß die Modifikation des Virus durch Serienpassagen bei niedrigeren Inkubationstemperatüren erreichen.

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Das erfindungsgemäße Verfahren zum Attenuieren von virulenten Katzen-Rhinotracheitis-Viren (FVR-Viren), aus denen sich Injektionsvaccinen zur Immunisierung von Katzen gegen virale Katzen-Rhinotracheitis herstellen lassen, ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein Inokulum mit dem virulenten FVR-Virus in ein flüssiges Katzengewebe-Nährmedium, das für das Virus nicht toxisch ist, einbringt, das Virus durch 2- bis 7-tägige Inkubation bei etwa 30 +. 2°C vermehrt und anschließend ein Inokulum des Virus abtrennt und dieses weiteren Serienpassagen an anderen Katzengewebekulturen unterwirft, wobei insgesamt mindestens etwa 7 Passagen vorgenommen werden.

Die erfindungsgemäß hergestellten Viruspräparate können zur Einstellung ihrer Wirksamkeit

verdünnt werden. Außerdem können sie mit Stabilisatoren, wie Dextrose und Lactose, oder anderen nicht-toxischen Substanzen versetzt werden. Die Viruspräparate können auch in getrocknetem Zustand, beispielsweise gefriergetrocknet, gelagert und anschließend zu flüssigen Vaccinen formuliert werden. Stabilisatoren, die beim Gefriertrocknen von Viren Verwendung finden, wurden von W. A. Rightsel et al., Cryobiology,(1967), 3, S. 423, und D. Greiff et al., Advances in Freeze Drying, Herausgeber L. Rey, Hermann, Paris, I966, S. 103 bis 122, angegeben. Ferner können die Vaccinen im Gemisch mit anderen immunogenen Katzenvaccinen verwendet werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1

Eine Probe von lebenden, virulenten FVR-Viren, die gemäß dem von J. L. Bittle, Amer. J. Vet. Res., Bd. 21 (I960), S. 547, angegebenen Verfahren gezüchtet und isoliert worden ist, wird auf eine einschichtige Zellkultur einer diploiden Katzenzungen-Zellinie in Gewebekulturröhrchen der Abmessungen 16 χ 125 mm gegeben. Die Zellkulturröhrchen werden folgendermaßen vorbereitet:

Als Zungen-Zellinie wird die Fe3Tg-Linie verwendet, die von K. M. Lee et al., Cornell Veterinarian, Bd. 59 (I969), S. 539, beschrieben worden ist. Jedes Röhrchen enthält 1 bis 2 ml eines Wachstumsmediums, das aus Eagle-Minimalmedium (MEM) besteht, das mit 10 % fetalem Kälberserum, 0,1 % Lactalbuminhydrolysat, 30 Einheiten Penicillin, 30 ug Streptomycin und 2,5 pg Amphotericin versetzt ist. Pro Röhrchen wird jeweils 1 ml der Katzenzungenzellen (200 000 Zellen/ml) zugegeben. Gegebenenfalls wird der pH-Wert mit Natriumbicarbonat auf 7,2 bis 7,8 eingestellt. Man läßt die Zellen in den Röhrchen bei etwa 35 + 2⁰C solange wachsen, bis eine einschichtige Zellkultur erreicht ist. Die Flüssigkeit wird sodann abgegossen. Hierauf werden 1 bis 2 ml eines Erhaltungsmediums zugegeben, das die gleiche Zusammensetzung wie das vorgenannte Medium aufweist, mit der Ausnahme, daß 1 bis 2 % fetales Kälberserum verwendet werden. Pro Viruspassage werden etwa 4 bis 6 dieser Röhrchen eingesetzt.

Jedes Gewebekulturröhrchen wird mit dem FVR-Virus-Inokulum versetzt. Die so angeimpften Röhrchen werden bei einer Tempe-

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ratur von 30 +_ 2°C stehengelassen, bis sich unter dem Mikroskop ein cytopathischer Effekt (CPE) beobachten läßt (nach etwa 2 bis 7 Tagen). Venn der CPE etwa 75 bis 90 % der einschichtigen Zellkultur erreicht, wird der Inhalt des Röhrchens geerntet und Proben von jeweils 0,2 ml des Inokulums werden weiteren 6 identischen Serienpassagen (insgesamt 7 Passagen) unterworfen. Nach der 7. Passage wird eine Standard-Grenzverdünnungsreinigung unter Verwendung von Eagle-Minimalmedium (MEM), das mit den vorgenannten Antibiotika (kein Serum) ergänzt ist, als Verdünnungsmittel durchgeführt, wobei die Inkubationstemperatur auf 30+.2⁰C gehalten wird. Nach 7 Tagen wird das letzte Röhrchen, das mit 75 bis 90 % CPE positiv reagiert, geerntet, Dieses ganze Verfahren wird zweimal mit insgesamt 10 Passagen wiederholt. Schließlich wird eine 11. Passage mit dem Zweck der Volumenvergrößerung durchgeführt, indem man eine 0,5 ml-Probe von der 10. Passage auf Kolben überimpft, die einschichtige Zellkulturen von diploiden Katzenzungen-Zellkulturen enthalten, die durch die vorbeschriebene Vermehrung von Zungenzellen erhalten worden sind. Nach der 11. Passage wird die Gesamtmenge geerntet, identifiziert und nach üblichen Verfahren titriert.

Die so erhaltene Vaccine kann je nach ihrem Titer verdünnt v/er-, den oder mit Stabilisatoren oder anderen nicht-toxischen Substanzen versetzt werden. Gegebenenfalls kann die Vaccine getrocknet oder in flüssiger Form verwendet werden.

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Zur Vermehrung und Attenuierung des Virus können alle nichttoxischen, flüssigen Gewebekultur-Nährmedien verwendet v/erden. Außer dem vorgenannten, mit Zusätzen versehenen Eagles-Minimalmedium (MEM) können auch andere nicht-toxische, flüssige Gewebekultur-Nährmedien verwendet werden.

Beispiel 2

1 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten Vaccine, die bei 35 + 2⁰C auf einen Virus titer von 10⁴'⁵ TCID₅₀Al (50 %-Wert der "tissue culture infective dosis"; bestimmt durch den CPE) wird intramuskulär an drei empfindliche Katzen verabfolgt. Zwei weitere Katzen dienen als nicht-geimpfte Kontrolltiere. Bei sämtlichen 5 Katzen ist vorher festgestellt worden, daß sie gegenüber dem FVR-Virus seronegativ sind. Die Krankheit (FVR) läßt sich im allgemeinen etwa nach dem 4. bis 9.Tag nach dem normalen Kontakt oder der Challenge mit dem virulenten FVR-Virus beobachten. Am 4. Tag nach der Impfung wird ein Rachenabstrichtest durchgeführt, der bei allen 5 Katzen negativ verläuft, was zeigt, daß kein Virus ausgestoßen wird. Der Antikörpertiter von allen 5 Katzen ist vor der Impfung kleiner als 1:2. Ein Monat später, unmittelbar vor der Challenge, beträgt der Antikörpertiter der 3 geimpften Katzen durchschnittlich 1 : 18 im Vergleich zu weniger als 1 ί 2 bei den 2 nicht geimpften Kontrolltieren. Ein Monat nach der Impfung werden alle 5 Katzen intranasal mit virulentem FVR-Virus infiziert, wobei in jedes Nasenloch Viruströpfchen gegeben werden (etwa 10 000 bis 20 000 TCID₅₀/Katze). Die Katzen werden 2 Wochen lang beobachtet. Bei den 3 geimpften Katzen treten keine Krank-

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heit oder Krankheitssymptome auf. Im Gegensatz dazu erkranken die 2 nicht geimpften Kontrolltiere schwer an der FVR-Krankheit und zeigen die typischen Symptome, wie Fieber, tränende Augen, laufende Nasen, fehlender Appetit und allgemeines Unwohlsein. 2 Monate nach der Challenge ist der Antikörpertiter von allen 5 Tieren etwa gleich hoch (1 : 54), was anzeigt, daß die geimpften Tiere geschützt sind und die Kontrolltiere erfolgreich infiziert worden sind.

Beispiel 3

Lebende, virulente FVR-Viren werden gemäß dem von J. L. Bittle et al., a.a.O., beschriebenen Verfahren gezüchtet und isoliert. Das dabei isolierte Produkt, das von den genannten Forschern mit "F-2" bezeichnet worden ist, wird 37 aufeinanderfolgenden Serienpassagen in primären Katzennieren-Gewebekulturen in Rollröhrchen unterzogen. Die Zeiträume betragen jeweils 2 bis 7 Tage. Es v/erden die von Bittle et al. beschriebenen Züchtungsmedien verwendet. Die Inkubationstemperaturen liegen bei 35 bis 37⁰C. Nach der 37. Passage stellt sich heraus, daß das Virus einen hohen Anteil seiner Pathogenität behalten hat und daher für Immunisierungszwecke ungeeignet ist. Jedoch läßt sich eine Attenuierung des Virus unter Gewinnung einer geeigneten Vaccine durch anschließende Passagen bei niedrigeren Inkubationstemperaturen erreichen. Demzufolge werden anschließend an die 37. Passage 44 weitere Serienpassagen (insgesamt 81 Passagen) bei Inkubationstemperaturen von etwa 32°C durchgeführt.

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Ein 0,2 ml-Inokulum von der 81. Passage mit einem Titer von 10 ' TCIDp-qAiI, berechnet nach dem Reed-Muench- Verfahr en, wird anschließend auf einschichtige Zellkulturen von diploiden Katzenzungen-Zellinien in Gewebekulturröhrchen der Abmessungen 16 χ 125 mm gegeben. Gemäß Beispiel 1 werden 7 weitere Serienpassagen und anschließend 3 Grenzverdünnungen C'terminal dilutions")und eine Passage zur Volumensteigerung durchgeführt, so daß sich eine Gesamtzahl von 11 Serienpassagen ergibt. Nach der 11. Passage wird die gesamte Rohvaccine geerntet, identifiziert (durch Serum-Neutralisationstest mit spezifischem FVR-Ziegen-Antiserum) und titriert.

Beispiel 4

1 ml der gemäß Beispiel 3 hergestellten Vaccine mit einem Titer

5 Λ , bei 35OC/

von 10 ' TCID^₀/ml/(bestimmt durch den CPE), wird intramuskulär an drei empfindliche Katzen, die gegenüber dem FVR-Virus seronegativ sind, verabfolgt. Zwei weitere Katzen dienen als nicht geimpfte Kontrolltiere. Am 4.Tag nach der Impfung ergibt ein Rachenabstrich bei allen 5 Katzen ein negatives Ergebnis, was zeigt, daß keine Viren abgeschieden werden.Zwei Wochen nach der ursprünglichen Impfung erhält eine der drei geimpften Katzen auf intramuskulärem Wege eine zweite 1 ml-Injektion. Ein Monat nach der Erstimpfung v/erden alle 5 Katzen intranasal mit virulentem FVR-Virus infiziert. Dabei werden Viruströpfchen in jedes Nasenloch verabfolgt (10 000 bis 20 000 TCID₅₀/Katze). Während der nächsten zwei Beobachtungswochen zeigen die drei geimpften Katzen keine Veränderungen im Gegensatz zu den zwei nicht geimpften Katzen, bei denen die Symptome der FVR-Krank-

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heit auftreten. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß durch eine Impfung mit der Vaccine eine minimale Antikörperreaktion hervorgerufen wird, während durch zwei Impfungen eine wesentlich stärkere Reaktion erreicht wird. Folgende Antikörpertiter werden beobachtet:

	1	Vor der	Tabelle I	2 Monate nach	: 54
	2	Impfung	Antikörperreaktion	der Challenge	: 54
	A	0	1 Monat nach	1	: 54
	B	0	der Impfung	1	ί 54
Kontrolltier		0	0	1	: 162
Kontrolltier		0	0	1
Katze		0	1 : 18	1
Katze	1 : 18
Katze	1 : 54

* Die Katze C erhielt 2 Wochen nach der 1. Injektion eine 2. 1 ml-Injektion,

Beispiel 5

Größere Mengen an Vaccinematerialwerden nach der 11., in Beispiel 3 beschriebenen Passage an Katzenzungenzellen hergestellt, wobei das gleiche Verfahren in den dort beschriebenen Kolben mit insgesamt 17 aufeinanderfolgenden Serienpassagen an Katzenzungenzellen durchgeführt wird. 500 ml des nach der 7. Passage erhaltenen Virusmaterials werden zu 500 ml N-Z-Amin-Lactose-Glutamat-Stabilisator gegeben und anschließend in Standard-Vaccinampullen (Titer 10 ' TCIDc_O/ml) verteilt. Anschließend wird auf übliche Weise gefriergetrocknet. Für Impfzwecke werden die Ampullen jeweils mit 1 ml pyrogenfreiem, sterilem, destilliertem Wasser versetzt. An zwei empfindliche Katzen wird jeweils 1 ml der auf diese Weise hergestellten -I

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Vaccine auf intramuskulärem Wege verabfolgt. Eine weitere nicht geimpfte Katze dient als Kontrolltier. Eine Woche später erhalten die beiden geimpften Katzen auf intramuskulärem Wege eine identische Verstärkungsdosis. 9 Monate nach der Erstimpfung werden alle drei Katzen intranasal mit virulentem FVR-Virus infiziert. Dazu werden in jedes Nasenloch Viruströpfchen eingebracht (10 000 bis 20 000 TCID₅₀/Katze). Die Katzen werden anschließend 13 Tage beobachtet. Die beiden geimpften Katzen zeigen an 2 von den insgesamt 13 Tagen leichte Symptome, während das nicht geimpfte Kontrolltier an 6 von 13 Tagen schwere Krankheitssymptome zeigt. Ein Jahr nach der Erstimpfung werden alle 3 Katzen wieder wie beim ersten Mal mit FVR-Virus infiziert, wobei bei keiner der Katzen die Krankheitssymptome auftreten. Daraus ergibt sich, daß bei den geimpften Katzen eine Langzeitwirkung eintritt. Die Tatsache, daß bei dem nicht geimpften Kontrolltier nach der 2. Challenge die KrankheitsSymptome ausblieben, war zu erwarten, da auf Grund der durch die 1. Challenge hervorgerufenen natürlichen Infektion Immunität eintrat.

Beispiel 6

Ein weiterer Beweis für die Langzeitwirkung der Vaccinen der Erfindung ergibt sich aus der folgenden Ein-Jahres-Challenge-Untersuchung. Jeweils 1 ml der gemäß Beispiel 5 hergestellten Vaccine wird intramuskulär an 8 empfindliche Katzen verabfolgt. 4 nicht geimpfte Katzen dienen als Kontrolltiere. Alle 12 Katzen erweisen sich bei einem vorhergehenden Test als seronegativ gegenüber dem FVR-Virus. Eine Woche später erhal-

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ten die 8 geimpften Katzen eine identische Verstärkungsdosis auf intramuskulärem Wege. Ein Jahr nach der Erstimpfung erhalten 3 Katzen eine dritte identische Verstärkungsdosis auf intramuskulärem Wege. 5 Tage später werden alle 8 Katzen intranasal mit virulentem FVR-Virus infiziert. Dazu werden Viruströpfchen in jedes Nasenloch gebracht (10 000 bis 20 000 TCIDc_O/Katze). Anschließend werden die Katzen 13 Tage beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt:

Tabelle II

	Klinische Symptome	Stärke der
	am Tag Nr.	Symptome
Kontrolltier 1	9	stark
2	8	stark
3	8	stark
4	9	stark
Katze A	3	leicht
B	3	leicht
C	4	leicht
D	1	leicht
E	6	leicht
Katze F*	Q	keine
G*	0	keine
H*	3	leicht

* Die Katzen F, G und H erhielten zwei Verstärkungsimpfungen.

Neben der vorbeschriebenen Herstellung der Vaccinen aus lebenden virulenten FVR-Viren, die aus infizierten Katzen erhalten werden, betrifft die Erfindung auch die Herstellung von FVR-

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Vaccinen unter Verwendung von FVR-Viren, die nach dem vorbeschriebenen Verfahren modifiziert worden sind. Vom wirtschaftlichen Standpunkt aus ist es unzweckmäßig zur Herstellung der Vaccinen jeweils als Ausgangsmaterial das lebende, virulente, FVR-Virus, das von infizierten Katzen gewonnen wird, zu verwenden, und es anschließend der nötigen Anzahl von Serienpassagen zu unterwerfen, wodurch schließlich das zur Verwendung in Vaccinen geeignete modifizierte Virus erhalten wird. Deshalb betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von FVR-Vaccinen, bei dem als Ausgangsvirus ein bereits durch Serienpassagen modifiziertes Virus verwendet wird. Dies bedeutet, daß ein Anzuchtvirus aus bereits attenuiertem Virusmaterial eingesetzt wird.

Demgemäß betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer Vaccine gegen virale Katzen-Rhinotracheitis, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen auf die vorbeschriebene Weise attenuierten FVR-Virus durch eine ausreichende Anzahl von Serienpassagen bei Inkubationstemperatüren von etwa 32 bis 37 C in einem flüssigen Katzengewebe-Nährmedium, das für das Virus nicht toxisch ist, solange vermehrt, bis das

. ₇ (infektiöse Dosis)

Medium etwa 10 bis 10 TCID/des attenuierten Virus pro ml enthält, und anschließend die flüssige Vaccine erntet.

Nach den hier beschriebenen Verfahren kann das modifizierte FVR-Virus leicht in großen Mengen und großen Konzentrationen gezüchtet werden. Bei Verwendung des auf Katzengewebekultüren vermehrten, modifizierten FVR-Virus in Konzentrationen von min-

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4 4 7 ~~

destens etwa 10 , im allgemeinen etwa 10 Ms 10 und vorzugs-

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weise etwa 10 ' bis 10 ' TCID des Virus pro 1,0 ml der endgültigen Vaccine ergibt sich bei parenteraler Verabfolgung von jeweils 1 ml an Katzen ein Stimulation der Bildung von schützenden FVR-Antikörpern, vergleichbar mit den Antikörpern, die bei natürlichen Infektionen gebildet werden, ohne daß aber die üblichen pathologischen Symptome von viraler Katzen-Rhinotracheitis auftreten. Die geimpften Katzen erweisen sich also gegen eine Infektion (Challenge) mit dem krankheitserregenden Virus resistent.

Eine deutlich erhöhte Antikörperreaktion läßt sich bei parenteraler Verabfolgung einer zweiten und sogar einer dritten oder weiteren Verstärkungsdosis der Vaccine beobachten. Beispielsweise wurde festgestellt, daß durch eine zweite intramuskuläre Injektion, die eine Woche nach der Erstimpfung vorgenommen wird, günstige Ergebnisse erzielt werden. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, ist es zu empfehlen, die zweite Injektion nicht früher als etwa 2 bis 3 Wochen nach der ersten Injektion vorzunehmen. Ausgezeichnete Ergebnisse lassen sich bei Vornahme einer Verstärkungsdosis bis zu 12 Monaten nach der Erstimpfung erzielen.

Ferner wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß die Verstärkung der Antikörperbildung außer durch die vorerwähnte parenterale Verabfolgung von Verstärkungsdosen der Vaccinen auch dadurch erreicht werden kann, daß man Katzen, die vorher durch parenterale Verabfolgung der Vaccinen immunisiert worden sind,

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intranasal mit dem FVR-Virus infiziert, wobei entweder ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren modifiziertes FVR-Virus oder ein nicht-modifiziertes, virulentes Virus verwendet wird.

Diese intranasale Instillation anschließend an die parenterale Impfung erzeugt einen signifikant höheren Antikörperspiegel, der lange anhält. Außerdem erweist sich der Schutz der so "behandelten Tiere bei Infektion mit virulentem Virus als stärker, wie sich daraus ergibt, daß .nach. Infektion mit 250 000 TCIDc₀/ Katze des virulenten, nicht modifizierten FVR-Virus keine klinischen Krankheitssymptome auftreten. Zur Erzielung optimaler Ergebnisse wird empfohlen, eine ausreichende Zeit verstreichen zu lassen, um die Katze nach der parenteralen Erstimpfung zu sensibilisieren, damit wenigstens ein Mindestmaß an Immunität erreicht wird, wie sich durch erhöhte Antikörperbildung zeigt, bevor das Tier dem anschließenden intranasalen Kontakt mit FVR-Virus unterzogen wird. Vorzugsweise wird die internasale Instillation 2 bis 4 Wochen nach der ursprünglichen parenteralen Impfung vorgenommen, wenngleich sich auch gute Ergebnisse erzielen lassen, wenn die Instillation bis zu 12 Monaten nach der parenteralen Impfung erfolgt.

Intranasale Instillation wird leicht durch Inhalation des FVR-Virus erreicht, indem man entweder herkömmliche Aerosolpräparate in die Nasengänge sprüht oder Tröpfchen in die äußeren Nasenlöcher oder in die Nasengänge

bringt. Eine entsprechende Konzentration des FVR-Virus (entweder nach dein vorstehend beschriebenen Verfahren modifi-

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ziert, oder in seiner lebenden, virulenten, nicht attenuierten Form) zur intranasalen Instillation anschließend an die Erstimpfung durch parenterale Verabfolgung beträgt etwa 1Q bis 1O⁶ TCID/ml.

Die Erstimpfung auf parenteralem Wege unter nachfolgendem Kontakt mit FVR-Virus (modifiziert oder nicht) über die Atmungswege stellt ein neues Verfahren zur Immunisierung gegen virale Katzen-Rhinotracheitis dar. Dadurch wird beim Tier eine humorale Antikörperreaktion und eine lokale Immunität des Atmungstraktes hervorgerufen, so daß ein besserer Schutz gegen diese Krankheit erreicht wird. Es wird somit auf diese Weise ein wirksamer, langdauernder Schutz gegen die virale Katzen-Rhinotracheitis erreicht.

Beispiel 7

In diesem Beispiel wird ein Verfahren zur Herstellung von lebendem, virulentem FVR-Virus beschrieben, das sich zur Verabfolgung über die Atmungswege nach parenteraler Impfung eignet.

A. Gewebe

Primäre Katzennieren-Gewebekulturen (PFKTC) werden geerntet und bei 35⁰C unter Einsatz üblicher Gewebekulturtechniken gemäß J. L. Bittle et al., Amer. J. Vet. Res., Bd. 21 (1960), S. 547, gezüchtet.

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Die von Lee et al., Cornell Vet., Bd. 59 (1969), S. 539, beschriebene Crandell-Katzennieren-Zellinie (CrFK) wird bei etwa 37°C in stationären Röhrchen oder Flaschen unter Verwendung von Minimalmedium (MEM) das mit "Earle's Balanced Salt Solution" (BSS) und 10 % fetalem Kälberserum, 0,1 % Lactalbuminhydrolysat, 30 Einheiten Penicillin, 30 ug Streptomycin und 2,5 Mg Amphotericin versetzt ist, gezüchtet. Nachdem das Wachstum einer einschichtigen Zellkultur abgeschlossen ist, wird das flüssige Medium entfernt und ein Erhaltungsmedium (entsprechend dem vorgenannten Medium, aber mit 1 bis 2 % fetalem Kälberserum) wird bei etwa 37°C verwendet.

B. Virus-Pool

Jeweils 1,0 ml eines Mediums mit primärer Katzennieren-Gewebekultur, das aus 0,5 % Lactalbuminhydrolysat und 10 % Pferdeserum in Earle's BSS mit 200 Einheiten Penicillin und 200 ug Streptomycin pro ml besteht, wird bei etwa 35°C in stationären Röhrchen stehengelassen, bis ein gutes Zellwachstum beobachtet wird. Die Flüssigkeit wird anschließend durch ein Erhaltungsmedium (entsprechend dem vorgenannten Medium mit auf 5 % vermindertem Gehalt an Pferdeserum) ersetzt. Anschließend wird mit einer 0,2 ml-Probe von lebendem, virulentem FVR-Virus (identifiziert als "C-27"-Isolat gemäß R. A. Crandell et al., Proc. Soc. Exptl. Biöl and Med., Bd. 97 (1958) S. 487, beimpft. Das beimpfte Medium wird anschließend in einen rotierenden Zylinder gebracht und bei 35⁰C gehalten. Wenn etwa 80 bis 90 % der Zellen cytopathogene Effekte (CPE) zeigen, wird das Virus geerntet. Dieses Verfahren wird bis zum Erreichen von

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insgesamt 10 solcher Serienpassagen wiederholt. Bei der 10. Passage wird eine 0,2 ml-Probe des Materials auf stationäre Röhrchen, die die CrFK-Zellinie enthalten, überimpft. Man inkubiert bei etwa 35°C bis 80 bis 90 % CPE. Zwei ähnliche Passagen an der CrFK-Zellinie werden in Flaschen durchgeführt, um eine größere Menge an Virusmaterial zu ernten. Nach der 13. Passage wird das geerntete Material, das einen Titer von etwa 10 TCID₅₀/ml aufweist, bei -70°C gelagert. Von diesem Material werden anschließend entsprechende Verdünnungen hergestellt, die auf dem Weg über den Atmungstrakt verabfolgt v/erden.

Beispiel 8

Jeweils 1 ml der gemäß Beispiel 3 hergestellten Vaccine mit ' einem Virustiter bei 35⁰C und 1Cr* TCIÜ^/ml wird intramuskulär an drei empfindliche Katzen verabfolgt, von denen zuvor festgestellt worden war, daß sie gegenüber dem FVR-Virus seronegativ sind. Zwei weitere Katzen werden als nicht-geimpfte Kontrolltiere verwendet. 11 Tage nach der Erstimpfung wird einer der drei geimpften Katzen eine zweite 1 ml-Injektion auf intramuskulärem Wege verabfolgt. Etwa 1 Monat nach der Erstimpfung werden alle drei geimpften Katzen und die beiden nicht geimpften Kontrolltiere einer intranasalen Instillation mit dem gemäß Beispiel 7 erhaltenen, entsprechend verdünnten Viruspräparat des lebenden, virulenten FVR-Virus unterzogen. Dabei wird der Kopf der Katzen nach rückwärts gehalten und Virus tropfen mit insgesamt 250 000 TCID₁-Q werden unter Verwendung einer 26 "gauge"-Nadel und -Spritze in die Nasenlöcher einge-

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bracht. Die in Tabelle III zusammengestellten Ergebnisse zeigen eine signifikant höhere Antikörperreaktion und das Fehlen von klinischen KrankheitsSymptomen, wenn das Virus auf intranasalem Wege anschließend an eine parenterale Impfung verabfolgt wird.

Tabelle III Antikörperreaktion

Titer bei der Titer nach der Klinische Sympintranasalen intranasalen tome nach der Instillation Instillation** intranasalen

Instillation

Katze A*	1	: 54	1	ί 162	keine
B	1	: 18	1	: 54	keine
C	1	: 8	1	: 54	keine
Kontrolltier 1	f1	: 2	1	: 54	stark
Kontrolltier 2	Ί	·. 2	1	: 54	stark

*' Die Katze A erhielt zwei Injektionen. ** Die Messungen wurden 1 Monat nach der intranasalen Instillation durchgeführt.

Beispiel 9

Jeweils 1 ml-Injektionen der gemäß Beispiel 5 hergestellten Vaccine (Titer io^f' TCIDcg/ml werden auf intramuskulärem Wege an 7 empfindliche Katzen verabfolgt, von denen vorher festgestellt worden ist, daß sie gegenüber dem FVR-Virus seronegativ sind, 15 Tage danach erhalten alle 7 Katzen eine zweite ähnliche Injektion. Drei der geimpften Katzen erhielten 5 Tage vor der intranasalen Instillation mit Lebendvirus eine identische dritte Injektion. Zwei weitere Katzen werden als

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nicht geimpfte Kontrolltiere verwendet. Etwa ein Jahr nach der Erstimpfung erhalten alle sieben geimpften Katzen und die zwei nicht geimpften Kontrolltiere eine intranasale Instillation des gemäß Beispiel 7 erhaltenen und entsprechend verdünnten Viruspräparats mit lebendem, violettem PVR-Virus. Dabei werden Jeder Katze in die Nasenlöcher 250 000 TCID verabfolgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt. Man ersieht daraus, daß durch die Kombination aus parenteraler Impfung und intranasaler Verabfolgung eine Langzeitwirkung erreicht wird.

	Tabelle	IV	Titer nach der intranasalen Instillation*	: 290	Klinische Symptome nach der intrana salen Instill ation
		1	ί 417	mild
	Antikörperreaktion	1	ί 96	mild ,
Katze A	Titer bei der intranasalen Instillation	1	: 200	mild
B	1 !	1	; 200	mild
C	1 !	1	: 290	keine
D	1 :	1	·. 200	keine
E**	1 !	1	: 66	sehr mild
	1 !	1	ί 22	stark
G**	1 .	1		stark
Kontrolltier 1	1 :
Kontrolltier 2	< 1 j
<1 :
- 15
. 15
. 7
. 22
ί 22
, 46
: 32
, 2
ί 2

* Die Messungen wurden 6 Wochen nach der intranasalen

Instillation vorgenommen.
** Diese Katzen erhielten insgesamt 3 intramuskuläre Injekti- ' onen.

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Beispiel 10

Jeweils 1 ml-Injektionen der gemäß Beispiel 5 hergestellten Vaccine (Titer 10 ' TCID-q/iiiI) werden an zwei empfindliche Katzen verabfolgt, von denen vorher festgestellt worden ist, daß sie gegenüber dem FVR-Virus seronegativ sind. 15 Tage danach erhalten beide Katzen eine zweite ähnliche Injektion. Etwa 9 Monate nach der Erstimpfung wird beiden Katzen'eine intranasale Instillation mit dem gemäß Beispiel 7 hergestellten, entsprechend verdünnten Viruspräparat mit lebendem, virulentem FVR-Virus verabfolgt. Jede Katze erhält Viruströpfchen in die Nasenlöcher mit insgesamt 100 000 TCID pro Katze. 3 Monate später werden sämtliche Katzen auf intranasalem Wege mit 250 000 TCID₅₀/Katze Lebend-FVR-Virus infiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt:

Tabelle V

Antikörper- Antikörper- klinische Symp- Antikörpertiter der titer zur tome 14 Tage titer 6 Wobei intranasa- Zeit der nach der chen nach len Instil- Challenge Challenge der !ation Challenge

Katze A	1 ;	7	1	: 45	keine	1	: 138
Katze B	1 :	7	1	: 66	keine	1	: 96

Die Beispiele 8 bis 10 zeigen, daß man eine Langzeit-Immunisierung gegen FVR bei Katzen erreichen kann, wenn man zunächst parenteral eine Vaccine mit mindestens etwa 10 TCID eines attenuierten FVR-Virus verabfolgt, der durch mindestens 7 zwei- bis sieben-tägige Serienpassagen an" Katzengewebekulturen in einem flüssigen Nährmedium bei Inkubationstemperatüren von etwa 30 +_ 2⁰C abgeschwächt worden ist, und an-

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schließend über den Atmungstrakt etwa 1O^ bis 10 TCID des FVR-Virus in lebender, virulenter, nicht attenuierter Form ver abfolgt. Ähnliche Ergebnisse erhält man bei Verabfolgung von etwa 10·⁵ bis 10 TCID des EVR-Virus, der erfindungsgemäß attenuiert worden ist, über den Atmungstrakt.

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Claims (4)

- 26 Patentansprüche

1. Verfahren zum Attenuieren von virulenten Katzen-Rhinotracheitis-Virus (FVR-Virus.), dadurch gekennzeichnet, daß man den Virus durch mindestens 7 Serienpassagen Katzengewebekulturen in einer Nährflüssigkeit bei Inkubationstemperaturen von etwa 30 +_ 2°C vermehrt.

2. Verfahren zum Attenuieren von virulentem FVR-Virus nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Vaccine, die bei Injektion an Katzen zu einer Immunisierung gegen virale Katzen-Rhinotracheitis führt, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Inokulum von lebendem, infektiösem Katzen-Rhinotracheitis-Virus in ein flüssiges Nährmediurn, das für das Virus nicht toxisch ist, und lebende Katzenzungenzellen enthält, einführt, das Virus durch Inkubation bei Temperaturen von etwa 30 +. 2⁰C 2 bis 7 Tage vermehrt und anschließend davon ein Inokulum dieses Virus

an

abtrennt und dieses weiteren Serienpassagen/anderen Katzenzungenkulturen unterwirft, wobei insgesamt mindestens etwa 7 Passagen vorgenommen werden.

3. Verfahren zur Herstellung einer FVR-Vaccine, dadurch gekennzeichnet, daß man lebendes, infektiöses FVR-Virus gemäß Anspruch 1 bis zu einem Virustiter von mindestens etwa

4
10 TCID pro ml abschwächt und die flüssige Vaccine erntet.

4. Verfahren zur Herstellung einer FVR-Vaccine nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gewebekultur Katzenzungen-

■ zellen verwendet.

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5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die erhaltene, das attenuierte Virus enthaltende Flüssigkeit zur Herstellung einer FVR-Vaccine von trockener, fester Form bei niedrigen Temperaturen trocknet.

6. Vaccine zur Immunisierung von Katzen gegen virale Katzen-

Rhinotracheitis, gekennzeichnet durch einen Gehalt an min-

4
destens etwa 10 TCID eines attenuierten FVR-Virus pro ml.

7. Vaccine nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch einen Gehalt an attenuiertem Virus, der durch mindestens 7 zwei- bis sieben-tägige Serienpassagen an Katzengewebekulturen in einem flüssigen Nährmedium bei Inkubationstemperaturen von etwa

30 + 2°C erhalten worden ist.

8. Vaccine nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie

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etwa 10 bis 10' TCID des abgeschwächten FVR-Virus pro ml enthält, wobei das Virus an Katzenzungen-Zellkulturen attenuiert worden ist.

9. Vaccine nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie in trockener, fester Form vorliegt und durch Trocknen der flüssigen Vaccine bei niedrigen Temperaturen erhalten worden ist.

10. Verfahren zur Herstellung einer FVR-Vaccine, dadurch gekennzeichnet, daß man ein FVR-Virus, das gemäß Anspruch 1 attenuiert worden ist, einer ausreichenden Anzahl von Serienpassagen an Katzengewebekulturen in einer Nährflüssigkeit bei

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Inkubationstemperaturen von etwa 32 bis 37⁰C unterwirft, bis

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ein Gehalt von etwa 10 bis 10 TCID des attenuierten Virus

pro ml erreicht worden ist, und die flüssige Vaccine erntet.

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