DE2516274A1 - Stark abgeschaechter megalozytenvirusimpfstoff und dessen herstellung - Google Patents

Stark abgeschaechter megalozytenvirusimpfstoff und dessen herstellung

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DE2516274A1 DE19752516274 DE2516274A DE2516274A1 DE 2516274 A1 DE2516274 A1 DE 2516274A1 DE 19752516274 DE19752516274 DE 19752516274 DE 2516274 A DE2516274 A DE 2516274A DE 2516274 A1 DE2516274 A1 DE 2516274A1
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Description

Diving. E. BERKENFELD ■ Gi.4l.-lng. rl. bE*KENFELD, Patentanwalt«, Kiln Anlog· Aktenzeichen
zur Eingab· vom Nam· d. Anm.
The Wistar Institute of Anatomy and Biology 36th St, and Spruce St0 Philadelphia, PA 19 104
Stark abgeschwächter Hesalozytenviru3impfstoff und dessen Herstellung
Die Infektion mit Megalozytenvirus (CMV) in der GeNährmutter ist ein wichtiger Anlaß der Schädigung des Zentralnervensystems "bei neugeborenen. Obgleich der Virus unter der Bevölkerung weit verbreitet ist, treten etwa 40$ der Frauen ohne Antikörper in die Schwangerschaft ein und sind so für die Infektion empfänglich. Etwa 1$ dieser Frauen unterliegen der Primärinfektion in der Gebärmutter. Die klassische megalozytäre Einschlußkrankheit ist selten; jedoch ein Teil der infizierten Säuglinge, einschließlich derjenigen, welche symtomfrei waren, findet man später geistig zurückgeblieben (lancet, 5. Januar 1974» S. 1-5).
Vorläufige Schätzungen, welche sich auf die Überwachung von etwa 4 000 Neugeborenen aus einigen geographischen Bezirken gründen, zeigen, daß der Virus bedeutende Schädigung des Zentralnervensystems verursacht, was zu geistiger Unzulänglichkeit in mindestens 10$, und vielleicht so hoch wie 25$, der infizierten Säuglinge führt. Unter der Annahme, daß etwa 1$ der pro Jahr neugeborenen Säuglinge OMV absondern und daß etwa ein Viertel von diesen geistige Mangel zeigen, bedeutet dies in den Vereinigten Staaten etwa 10 000 hirngeschädigte Kinder, welche im Jahr geboren v/erden. Dies ist eine erschreckende Anzahl, insbesondere im Hinblick auf die Fähigkeit dieser Kinder, zu überleben (J. of Infect. Dis. J^23_, Nr. 5, 555; Mai 1971)»
Angesichts der Ernsthaftigkeit des Problems wurden in jüngeren Jahren Forschungen angeregt, welche auf die Entwicklung eines wirksamen GMV-Impf stoff es gerichtet waren. Das Broblem zur Impfung besteht darin, durch Zellen vermittelte und humorale Immunität herbeizuführen, ohne Ausbreitung des Virus über den ganzen Körper des Geimpften und ohne Herbeiführung von Krankheitswirkungen.
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Der Impfstoff sollte "brauchbar seih, um Frauen gegen Infektion während der Schwangerschaft zu schützen. Die Impfung junger Mädchen sollte den Zwischenfall der primären CMV-Infektion in der Schwangerschaft herabsetzen und fötale Hirnschädigung in.-folge dieses Anlasses abwenden.
Die Erfindung schafft einen Impfstoff, welcher Immunität gegen CMY herbeiführen kann und daher brauchbar ist, Frauen gegen Infektion während der Schwangerschaft zu schützen, wodurch Schädigung des Zentralnervensystems einschließlich geistigen Zurückbleibens von Neugeborenen stark herabgesetzt werden kann Der erfindungsgemäße Impfstoff zeigt vorteilhafterweise kein Ausbreiten des Virus auf Kontaktpersonen. Ferner besitzt der Impfstoff wegen der Art seiner Herstellung nicht die Fähigkeit latenten tierischen Virus atif Geimpfte zu übertragen. Die Erfindung besteht auch in einem neuartigen Verfahren zur Herstellung des Impfstoffes ο
Die Erfindung beinhaltet einen Impfstoff gegen Megalozytenvirus (OMV), welcher beim Menschen Immunität gegen megalozytäre Einschlußkrankheit (CID) herbeiführen kann und zwar ohne Ausbreitung auf Kontaktpersonen und mit minimaler Absonderung des Virus, wobei der Impfstoff hergestellt wird durch reihenweisen Gang von bösartigem CMV in diploide Fibroblaste der menschlichen Lunge0
Der erfindungsgemäße Impfstoff besitzt die oben beschriebenen Vorteile kraft seiner Herstellungsart0 Ein wesentliches Merkmal des Herstellungsverfahrens des Impfstoffes ist der laufend' Gang von Megalozytenvirus in diploide Fibroblaste der menschlichen Lunge, insbesondere τ,'ΠΓ-38- und MßC-5-Fibroblaste, vorzugsweise die ersteren.
Die WI-38-Fibroblaste wurden ursprünglich von einem einzigen menschlichen Lungenflügel abgeleitet; sie sind Stammbaummäßig erfasst in dem Sinne, daß sie umfassend biologisch, biochemisch, virologisch und genetisch gekennzeichnet worden sind, Die MRC-5-Fibroblaste wurden in ähnlicher Weise von einem einzigen menschlichen Lungenflügel abgeleitet, jedoch eines 87/1 " ~~50 9~8437Ö84 2
unterschiedlichen Individuums, und sind in ähnlicher Weise stammbaummäßig erfaßt. Diese beiden Zellenlinien sind standardisiert im Gegensatz zu üblicherweise verwendeten primären tierischen Zellen. WI-38 ist beschrieben in Exper« Cell Res. 25 t 585; 1961 und wurde hinterlegt bei der American Type Culture Collection und trägt die Bezeichnung AiECC CCL-75. MRC-5 ist beschrieben in Hature 227, 168; 11. Juli 1970. WI-38 ist den Laboratorien zugänglich gemacht worden und kann von der Collection erhalten werden» Die Verwendung dieser Zellenlinien zur Portpflanzung des Virus setzt die Wahrscheinlichkeit auf ein Mindestmaß herab, daß latente tierische Viren auf einen Geimpften mittels des Impfstoffes übertragen werden.
Der Tovme-Stamm von CMV, ein bevorzugter Stamm zur Verwendung bei der Herstellung des Impfstoffes wegen seines breiten antigenen Spektrums, wurde isoliert aus dem Urin eines zwei Monate alten männlichen Sä.uglings mit megalozytärer Einschlußkrankheil: (Symptome: Schädigung des Zentralnervensystems und Hepatosplenomegalie)„ Dieser CMV-Stamm wurde isoliert von Stanley Α« Plotkin, Wistar Institute of Anatomy and Biology, Philadelphia, Pennsylvanien, und ist in J0 Virol. JM_, Hrβ 6, 991; Juni 1973 beschrieben. Jedoch können a\ich andere Stämme von CMV verwendet werden.
Die Portpflanzung der diploiden Pibroblaste der menschlichen Lunge kann nach irgendeiner der in der Literatur beschriebenen Standardmethoden durchgeführt werden. Spezifische Beispiele solcher Portpflanzungstechniken sind in Exper„ Cell Res» 25» 585; 1961 und in Virology 1_6, 147; 1962 beschrieben. Das Gewebekultursystem weist gewöhnlich Eagle's Grundmedium (BME) oder Eagle's Minimal-Sssential-Iiedium (KLiM) in Eagle's Restsalzlösung auf, ergänzt mit vorgesichtetem Kalbserum, welches eine sterilisierende Menge eines Antibiotikums wie Penicillin, Streptomycin, Chlortetracyclin oder eines anderen Antibiotikums oder Gemische solcher enthält, wobei das System bei einem pH-Wert von etwa 6,8 bis 8,5 mit einem herkömmlichen biologischen Puffermittel wie Alkalibicarbonat, -carbonat oder -hydrogenphoaphat gepuffert ist.
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Der CM? wird sram Impf staff gs "breach lailtiTiert, indem man diploide Fibrofolaste der menschlichen Lunge mit GW inolosliert» (MF-haltiger Urin ist ein besonders brauchbares Anasgaiagsnaterial zum Inokulieren der Filbroblaste«, Die trypsinierten infizierten Zellen werden gewonnen imd laufend in diploide ^übrotolaste der menschlichen IiTinge eingebeben„ Jede Inkubation währt sielben Tage und wird sei einer Temperatur von etwa 37°G durchgeführt. Die Anzahl an Iterehgäns/eji A ~t -^ine solche, dal Eunachsib ein CHlf-Stamm erzeugt wirdj welcher große Mengen an zellfreiea Yirus freisetzt, wonacli die AbSchwächung des zellfreien Yinas folgt* Mindestens etwa 50 und vorzugsweise etwa 125 Ms 150 ■Gesamtdurengänge weräen angewandt. Der abgesßJawaclit'Q Tinas dann gewonnen umd genormten Sterilitätste:sta auf Anwesenheit von Bakterien, 5ilzenf Myfcoplasma und anderen 'Stoffen
Der Ausdruck mato.geselhwächter Virus", wie er hier geTsraoiiekib wird bezieht sieh auf einen Yirus, dessen Bösartigkeit diarcii die Methode der Kultivierung abgeändert worden ist, so dai der Yirus keine seliw©rwie/ge.ü.ueii Symptome herv©jrär-!aft, wenn er Mensehen eingeimpft wird, obgleich der Yiru/s seine Antigenaiaslösung, de3i„ seine 3?ahigkeit? die Erzeugung von ,Antikörpern anzuregen, TbeilbeMLlt.
Der abgeschwaeMte Tirus wird als Impfstoff -verwendet,, indem man das gewonnene Material filtriert, mim fellen hzw* Bakterien zu entfernen, und das Piltrat verwendet man entweder so9 me es: ist, für spateren 'ßsbrauch gefroren, ©der Ijopiiilisiei-t wmü anschließend mit einem lösungsmittel wie Wasser ified Wenn das 3?iltrat lyophilisiert wird, verwendet man einen Stabiliisator wie Albumine Der Impfstoff kann verabrei«eib.t werden» Die Dosis, welche angewandt werden kann, ist mindestens *■:;■? TClD50 an abgeschwächtem GMY und kann s<© hoch sein wie 10 000 TOID500
Der abgeschwächte Yirus kann in größeren Mengen hergestellt werden, indem man diploide Pibroiblaste der menschlichen Lunge mit dem Yirus inokuliert und den abgeschwächten Yirus darin
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wachsen läßt. Der abgeschwächte Virus kann zur Zeit des maximalen Titers, beispielsweise in etwa einer Woche, gewonnen werden*
Die folgende Beschreibung der Herstellung und des Testens des CMV-Impfstoffes soll lediglich der Veranschaulichung der Erfindung dienen, jedoch über den Rahmen der Erfindung nichts aus s age η β
Gewinnen des_ Virus
Den verwendeten CMV gewinnt man aus dem Urin eines zwei Monate alten männlichen menschlichen Säuglings mit megalozytärer Einschlußkrankheit. Dieser Stamm wird als Towne-Stamm bezeichnet und ist weiter oben beschriebene Den Urin inokuliert man auf diploide Fibroblaste wi-38 der menschlichen Lunge. Das zur Gewebekultur des Virtis verwendete l\Tährmedium ist Eagle's Minimal-Ess ential-Medium (MEM) mit 2°ß> zugesetztem vorgesichtetem Kalbserum. Die Konzentration an Antibiotika je ml Medium beträgt 100 ug Penicillin, 10 ug Gentamicin und 2 ug Amphotericin-B. Anstelle dieser oben speziell aufgezählten Antibiotika können auch andere verwendet werdeno
Herstellen des abgeschwächten CMV
Die Ernte, bestehend aus überstehender Flüssigkeit und virusinfizierten Zellen, welch letztere von der Oberfläche der Gefäße unter Verwendung von 0,25$ Trypsin in physiologischer Kochsalzlösung entfernt werden, inokuliert man auf stationären diploiden Pibroblasten ¥1-38 der menschlichen Lunge zum Ingangsetzen der Infektion dieser Zellen und dann wird sie anschließend hindurchgegeben. Das Nährmedium, welches zum Einleiten der Zellinfektion und in allen darauffolgenden Durchgängen verwendet wird, ist das gleiche wie dasjenige, welches, wie oben beschrieben, für die Gewebekultur des Virus verwendet wird» Die in jedem Durchgang angewandte Temperatur beträgt 37%. Jedoch können auch Temperaturen etwas unterhalb dieser Temperatur, beispielsweise Temperaturen im Bereich von etwa 30 bis 37 C, angewandt werden,» Die Dauer jedes Durchganges beträgt
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7 Tage, doch, können auoh Gänge etwas kürzerer oder längerer Dauer, beispielsweise 5 oder 10 Tage, angewandt werden»
Bei den anfänglichen Durchgängen, welche zahlenmäßig etwa sind, läßt man überstehende Flüssigkeit, welche virusinfizierte Zellen enthält, die von jedem vorherigen Durchgang gewonnen wurden, auf frischen diploiden Fibroblasten 1/71-38 der menschlichen Lunge durchgehen,, Bei jedem Durchgang verwendet man etwa 25$ zellhaltiger Flüssigkeit aus einem vorhergehenden Durchgänge Die gewählte Anzahl an Durchgängen ist eine solche, daß ein Stamm erhalten wird, welcher eine wesentliche Menge an zellfreiem Virus erzeugt, wobei der CMY gewöhnlich mit Zellen assoziiert ist» Eine etwas kleinere oder größere Anzahl an Durchgängen kann daher angewandt werden.
Die überstehende Flüssigkeit vom zehnten Durchgang erhält man durch Abdekantieren und Zentrifugieren bei 1 200 U/min, wobei man eine Flüssigkeit gewinnt, welche zellfreien Virus enthält. Die zellfreie Flüssigkeit, welche zellfreien Virus enthält, läßt man dann nacheinander 28 mal auf frischen diploiden Fibroblasten V/I-38 der menschlichen lunge passieren, wobei man 1 ml der Flüssigkeit benutzt, um Gefäße zu inokulieren, von denen
2 ein jedes einen Oberflächenbereich von 75 cm besitzt« Wenn auch 28 Durchgänge angewandt werden, so braucht doch die Anzahl Durchgänge bloß ausreichend zu sein, um die gewünschte Menge an zellfreiem CMV hervorzubringen» Eine größere oder geringere Anzahl an Durchgängen der zellfreien Flüssigkeit könnte daher angewandt werden.
Die überstehende Flüssigkeit, welche auch Virus enthalten kann, der durch Beschallung^aus zellen freigesetzt ist, wird gewonnen und dann reihenmäßig auf frische WI-38 gegeben und zwar eine hinreichende Anzahl Male, beispielsweise 115 mal, um den Virus abzuschwächen. Die Gesamtanzahl der Durchgänge, welche in oben beschriebenem Gesamtverfahren angewandt werden, beträgt gewöhnlich zwischen etwa 50 tinä. 150, vorzugsweise etwa 125 bis 150.
*) "sonication"
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"" " _7: " "251627*
Das Ansammeln {cloning) des abgeschwächten Virus durch Emtverdünnung vollzieht man "bei 50, 60 und 70 Durchgängen»
Der Virus für -Impfeinsätae röLrä gewonnen aus überstehend«!! Flüssigkeiten von infizierten T»'JI-3-8-Kulturen zur Zeit des maximalen Virustiters, im allgemeinen in etv/a einer Woche,. Durch diese Arbeitsweise geidnai; man eine größere Menge an abgeschwächtem ClI? aus der anfangs Bereiteten«
Sig-enschaften dea SITy-Impfjgtoff es
Der CMV-Impf stoff wächst auf menschlichen Fibroblasten wie ΐΓΙ-38-Zelleiu Seine 2ellpathogene Wirkung ist charakteristisch für menschliches CMY und in der Literatur beschrieben,, Er kann. leicht in zellfreier Form fortgepflanzt werden, indem man die Überstehende Flüssigkeit der infizierten Kultur filtriert (3-Mikron-Filter) und atif frischen ¥1-38-Zellen inokuliert. CZB erfolgt innerhalb 4 bis 10 Tagen, je nach der Vielfältigkeit der Infektion, Es bilden sich Einschlußkörper, wie dies in der Literatur beschrieben ist und diese können mit Hämatoxylin-Sosin oder nach ßiemsa angefärbt werden. Der abgeschwächte Virus bildet Plättchen mil; einer Oberschicht an ITähragaro se·
Der Impfstoff sollte bei -70°0 gelagert werden und zwar im einer lösung von 7Ofo Sorbit in destilliertem Wasser (ein Volumen Virus auf ein Volumen Sorbitlösung);
Der zellfreie abgeschwächte Virus kann seroneutralisiert -werden mit im Handel erhältlichem menschlichem Antiserum (Flow laboratories, Bethesda, Maryland, USA), CF-Titer 1:16 (verdünnt I3IO)* 0,1 ml verdünntes Serum neutralisiert 250 TCID5Q* Hyperimmunes Meerschweinchenserum gegen Stamm AD 169 kann ebenfalls verwendet werden*
Die folgende Tabelle stellt die Titer der Serumneutralisation (SN) allein und in Anwesenheit von Komplement zusammen. Die S erfolgte in Mixoplättchen (linbro); 0,025 ml Suspension von 60 TCIDt-Λ Towne 125 plus 0,025 ml verdünntes Serum» lach
-?υ 4.
Stunde werden 0,250 ml, welche 1O^ ¥I-38-Zellen in Eagle's
'„«/ι ~~ '60 9 843-
~e"'_ " 25162T4
modifiziertem Grundmedium enthalten, mit 10$ nicht erwärmtem Kalbserum hinzugegeben«. Die Mikroplatten werden naoh einer 5-bis 7-tägigen Inkubation bei 370C abgelesen« Man verwendet acht Stufen (wells) je "Verdünnung.
leutrali s ati on Serum, Probe
Kaninchen, ITr0 1 Nr. 2
Meerschweinchen . Menschliches Antiserum
allein mit
Komplement
8 8
8 64
8 22
8 64
20-100 100
40 40
Testen des Impfstoffes
Jeden zum Inokulieren verwendeten Einsatz unterwirft man Tests auf Anwesenheit von Bakterien, Pilzen und Mykoplasma durch Inokulieren auf passende künstliche Medien» Tests auf Sicherheit in Tieren umfassen Injektion von Bruchteilen des Einsatzes in ausgewachsene Mäuse, (intraperitoneal und intracerebral), in säugende Mäuse (Intraperitoneal und intracerebral), Meerschweinchen (intraperitoneal), und Kaninchen (intradermal)β Die Prüfung der Tiere zu verschiedenen Zeiten (sämtlich einige Wochen) nach der Inokulierung zeigt, daß alle Tiere gesund blieben.
Zwanzig Cercepithecusaffen werden mit dem Impfstoff inokuliert und zwar mit 0,5 ml intraspinal bzw. intracerebral, und mit 1 ml intramuskulär. Sie waren sämtlich seronegativ bis 100 TCIDcq CMV-Neutralisation, sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit frischen Meerschweinchenkomplements.. Die Affen wurden drei Wochen später erneut getestet. Es zeigte sich während dieser Beobachtungsdauer bei klinischer und pathologischer Prüfung bei den gleichen Affen keine Serumumwandlung.
Weitere Tests auf Identität und auf Abwesenheit verunreinigender Mittel werden in den Gewebekulturen durchgeführt» W 87/1 ™~ 5Ö98A3/08T2
Prinäre niere des afrikanischen grünen Affen, niere des menschlichen Embryos, primäre niere des Kaninchens und IfI-38-Zellen werden sämtlich mit Bruchteilen des Virus inokuliert und zwar entweder direkt oder nach einstündiger neutralisation bei 37° mit Kaninchen- CMV-Serum« Es wurde im Einsatz kein anderer Stoff offenbar als CMV-Impfstoff« Die 1Pitrat!on der Einsätze auf Menge an CMV-Virus vollzieht man durch E^unktverdünnungsprobe an WI-38-Zellen«
Ergebnisse der Impfstofftests am Menschen
Der Impfstoff wurde an Erwachsenen getestet, welche vorher auf Antikörper gegen CMV geprüft wurden und nur seronegative Personen in die Tests mit einbezogen. Zehn seronegativen Erwachse-
"5 0
neu wurden 10 * TCIDe-q intranasal gegeben. Es erfolgten keine Serumumwandlungen, was seigt, daß der Virus über den üblichen Weg nicht mehr infektiös vrax. neun anderen Erwachsenen wurde die gleiche Dosis subkutan gegeben und in allen Fällen trat Serumumwandlung ein« Es wurden weder Symptome beobachtet noch wurde der Virus aus Urin, Kehle oder Blut gewonnen.
Zur Erzielung der vorgenannten Ergebnisse wurden die Viren in einem Volumen ύοώ. 1 ml subkutan inokuliert. Kehlenabstriche wurden mit Anwendungsstäbchen mit Baumwallspitze genommen, wobei die Stäbchen über die hintere Pharynx bewegt wurden. Beide Abstricharten wurden sofort in Schraubstöpselröhrchen gebracht, welche Hanks■» Medium mit 0,1$ Gelatine, 1 000 pg Streptomycin und 400 ug Mykostatin je ml enthielten. Die Proben wurden entweder bei 4 G gelagert, bis sie am gleichen lag in Gewebekulturen inokuliert wurden, oder sie wurden bei -200G gelagert, bis sie innerhalb von zwei Wochen getestet wurden. Urin wurde direkt auf ¥I-38-Zellen inokuliert« Blu.tpräsenztest3 vurcLen. durchgeführt durch Sammeln heparinisierten Blutes und durch Absötzenlassen des Blutes dureh Schwerkraft bei 4 0, bis ein leukozytenreiehes Plasma erhalten wird, nach zwei Minuten dauernder Beschallung wird das Plasma in Gewebekultur inokuliert. Antikörperstudien wurden durchgeführt an Serum von proben geronnenen Blutes unter Anwendung von Komplementfixie— rungs— und yiuoreszenzarrtilcorpertests« "V 87/1 50984 3/0842
- ίο -
In einem nacitfolgenden rest warden, neun neuen seronegativen Irwaciisenen die gleiciie Bosis (10 f ÜECIBi-q} subkutan gegeben. Es wiirdeiL Iceine systemisclien Spuptome beobachtet miä alle neun personen entwickelten Antikörper gegen GMF.
— Patentansprüchie —
W 87/t 8088

Claims (13)

  1. Dr.-lng. E. BERKENFELD . DIpI-Ug, H, BERKENFELD, Patentanwalt·, Kiln
    Anlog· Akt»ni»ich»n
    zur Eingab· yam Nam· d. Ann.
    The Wistar Institute of Anatomy and Biology 36th St. and Spruce St« Philadelphia, ΡΛ 19 104
    Tatentansprüche
    1!Verfahren zum Abschwächen von Megalozytenvirus, dadurch gekennzeichnet, daß man bösartigen Megalozytenvirus nacheinander bzw, laufend in diploide Fibroblaste der menschlichen Lunge durchlaufen läßt und zwar hinreichend oftmals, daß der Virus, wenn er dem Menschen verabreicht wird, Immunität herbeiführt ohne Hervorrufung schwerwiegender Symptome oder mehr als minimaler Virusabsonderung und Ausbreitung auf Kontaktpersonen«
  2. 2)Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die diploiden Fibroblaste der menschlichen Lunge aus einer Zellenlinie bestehen, welche mit ATGC CCL-75 bezeichnet ist*
  3. 3)Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtanzahl der Durchgänge etwa 50 bis 150 beträgt.
  4. 4)Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Durchgänge bei einer Temperatu
    Tage lang durchgeführt werden»
    Durchgänge bei einer Temperatur von 30 bis 370O fünf bis zehn
  5. 5)Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtanzahl der Durchgänge etwa 125 bis 150 beträgt.
  6. 6)Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man trypsinierte Zellen, welche mit Megalozytenvirus infiziert sind, zehnmal auf frischen diploiden Fibroblastzellen der menschlichen Lunge hindurchgehen läßt, woraufhin man viralen Durchgang des zellfreien Virus auf frischen diploiden Fibroblastzellen der menschlichen Lunge folgen lässt.
  7. 7)Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man diploide Fibroblaste der menschlichen Lunge mit menschlichem Urin inokuliert, welcher mit Megälozytenf virus infiziert ist, daß man die überstehende Flüssigkeit, welche mit Megalozytenvirus infizierte, trypsinierte Zellen
    W 87/1 509843/0842
    enthält, gewinnt'; daß man reihenweise bzw. nacheinander diese Flüssigkeit in diploide Fibroblaste der menschlichen Lunge laufen läßt, um einen Stamm von Megalozytenvims zu erhalten, welcher einen zellfreien Megalozytenvirus ergibt; und daß man diesen zellfreien Kegalozytenvirus nacheinander in diploide Fibroblaste der menschlichen Lunge gehen läßt und zwar hinreichend oft, so'daß der Virus, wenn er dem Menschen verabreicht wird, Immunität herbeiführt ohne Hervorrufung schwerwiegender Symptome oder mehr als minimaler Virusabsonderung und Ausbreitung auf Kontaktpersonen«
  8. 8)Verfahren nach Anspruch 7> dadurch gekennzeichnet, daß die diploiden Fibroblaste der menschlichen Lunge aus einer Zellenlinie bestehen, welche mit ATCC CCL-75 bezeichnet ist.
  9. 9)Verfahren r.ach Anspruch ?«> dadurch gekennzeichnet, daß man die überstehende Flüssigkeit, welche trypsinisierte infizierte Zellen enthält, sehnmal hindurchgehen lä,ßte
  10. 10)Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die überstehende Flüssigkeit, welche den zellfreien Stamm des Virus enthält, etwa 115 mal hindurchgehen läßt, um den Virus abzuschwächenο
  11. 11)Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man jeden dieser Durchgänge bei
    eine Woche lang durchführt.
    jeden dieser Durchgänge bei einer Temperatur von etwa 37 0
  12. 12)Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung eines Impfstoffes von abgeschwächtem Megalozytenvirus, dadurch gekennzeichnet, daß man einen abgeschwächten Megalozytenvirus in diploiden Fibroblasten der menschlichen Lunge eine hinreichende Zeitdauer wachsen läßt, um eine größere Menge des abgeschwächten Virus zu erzeugen, und daß man den sich ergebenden abgeschwächten Virus gewinnt,,
  13. 13)Megalozytenvirusimpfstoff, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 12„
    w 87/1 509843/0842
DE2516274A 1974-04-15 1975-04-14 Verfahren zum Herstellen eines abgeschwächten Zytomegalie-Virus-Impfstoffes Expired DE2516274C2 (de)

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