JPS58406B2 - コウドジヤクドクカサイトメガロウイルスワクチント ソノセイホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 子宮のサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）感染は新生児の
中枢神経系損傷の重要な原因である。

このウィルスは人々の間に広く分布しているが、約４０
％の女性は抗体無しで姐娠する。

従って、このウィルスに感染し易い。

これらの女性のうち約１％は子宮に一次感染する。

古典的なサイトメガリック封入病は稀であるが、感染幼
児（症状のないものも含む）の一部は後に知能遅れにな
ることがわかっている（Ｌａｎｃｅｔ Ｊａｎ、 ５
ｙ １９７４ 。

ｐＩ）、１〜５）。

幾つかの地域からの約４０００人の新生児の調査に基づ
く予備的な概算によると、このウィルスは中枢神経系の
重大な損傷をひき起こし、感染幼児の１０係以上、恐ら
くは２５係程度が精神薄弱児になっている。

毎年約１係の新生児がＣＭＶを排出し且つその↓が精神
薄弱児になると仮定するき、米国では毎年約１０，００
０人の脳傷害児が生まれることになる。

この数は特にこれら脳傷害児が生存能力があるという点
で恐ろしい数である（Ｊ、 ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄ
ｉｓ １２３．Ａ５ ｙ ５５５（Ｍａｙ、１９７１）
）。

問題の深刻さのために、最近、有効なＣＭＶワクチンの
開発に関する研究が盛んになって来た。

ワクチン接種の問題はワクチン接種を受けた人の身体全
体にウィルスを蔓延させることなく且つ障害を起こさず
に細胞媒介免疫および体液性免疫を与えることである。

ワクチンは女性が娘娠中感染しないよう有効でなければ
ならない。

未成年女子のワクチン接種は娘娠時における一次ＣＭＶ
感染の発生を少なくし且つこの原因による胎児の脳障害
をなくすものでなければならない。

本発明はＣＭＶに対する免疫性を与え、従って女性が娘
娠中に感染しないようにするのに有用であり、この結果
新生児の知能遅れを含む中枢神経系の障害を非常に少な
くすることができる。

本発明のワクチンは接触者にウィルスの蔓延を示さない
点で有利である。

その上１本発明のワクチンはその製法から見てワクチン
接種を受けた人に潜在的な動物ウィルスを伝染させる可
能性がない。

本発明はまた新規のワクチン製造法にも関する。

本発明のワクチンはその製造法により上記の利点を有し
ている。

本発明のワクチンの製造法の本質的な特徴はＣＭＶをヒ
トのディプロイド肺繊維芽細胞（ｄｉｐｌｏｉｄ ｌｕ
ｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、特にＷＩ−３８およ
びＭＲＣ−５繊維芽細胞（前者が好ましい）中を連続通
過（５ｅｒｉａｌ ｐａｓｓａｇｉｎｇ）させることで
ある。

ＷＩ−３８繊維芽細胞は初め単一のヒトの肺から由来す
るものであり、広く生物学的、生化学的、ウィルス学的
および遺伝学的に特徴づけられているという意味で純系
である。

ＭＲＣ−５も同様に単一のヒトの肺から由来したもので
あるが、異なる個体のものであり、同様に純系である。

これら２つの細胞系は通常用いられている一次動物細胞
と異って標準化されている。

ＷＩ−３８はＥｘｐｅｒ、ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、 ２５，
５８５（１９６１）、に記載されており、アメリカンタ
イプカルチャーコレクションに寄託され、ＡＴＣＣＣＣ
Ｌ−７５という名称が与えられている。

ＭＲＣ−５はＮａ−ｔｕｒｅ ２２７，１６８（１９７
０年、７月１１日）に記載されている。

ＷＩ−３８は研究所で入手可能であり、上記コレクショ
ンから得ることができる。

ウィルスの繁殖用にこれらの細胞系を用いると、得られ
たワクチンの接種を受けた人に潜在的動物ウィルスが伝
染する可能性が最少になる。

その広域抗原スペクトルのためにワクチン製造。

に用いるのに好ましいＣＭＶのタウネ株（Ｔ ｏｗｎ
ｅｓｔｒａｉｎ）をサイトメガリック封入病の生後２ケ
月の男の乳児（症状−中枢神経系障害および肝牌肥大）
の尿から分離した。

このＣＭＶの株はウィスターの解剖学および生物学研究
所（ＷｉｓｔａｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎａｔ
ｏｍｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ペンシルバニア
州フィラデルフィア市）のスタンレーＡ、プロトキン博
士が分離１ 、 Ｊ、ｖｉｒｏｌ。

１１、Ａ６，９９１（１９７３，６月）に記載されてい
る。

しかし、他のＣＭＶの株も使用することができる。

ヒトのディプロイド肺繊維芽細胞の増殖は文献に記載さ
れている標準方法で行うこきができる。

かかる増殖方法の特別な例はＥｘｐｅｒ ｃｅｌｌ Ｒ
ｅｓ。

２５．５８５（１９６１）およびワイルス学（Ｖｉ’ｒ
ｏｌｏｇｙ）１６．１４７（１９６２）に記載されでい
る。

この組織１培養系は通常、ペニシリン、ストレプトマイ
シン。

クロルテトラサイクリンまたは他の抗生物質あるいはこ
れらの混合物のような抗生物質の殺菌量を含み、予めス
クリーニングした子牛血精で補光しであるイーグルの緩
衝塩類溶液中のイーグル基本。

培地（ＢＭＥ） またはイーグル最小必須培地（ＭＥ
Ｍ）から成り、系はアルカリ金属の炭酸水素塩、炭酸塩
または燐酸水素塩のような通常の生物学的緩衝剤でｐＨ
約６．８−８．５で緩衝されている。

ＣＭＶはヒトのディプロイド肺繊維芽細胞にＣＭＶを接
種することによりワクチン用に培養される。

繊維芽細胞接種用の出発物質としてはＣＭＶ含有尿が特
に有用である。

トリプシン処理した感染細胞を集め、これをヒトのディ
プロイド肺繊維芽細胞中を連続通過させる。

各培養は７日間、温度約３７°Ｃで行う。

通過回数はまず多量の無細胞（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ）
ウィルスを放出するＣＭＶの株をつくり、この無細胞ウ
ィルスを弱毒化する。

少なくとも約５０回、好ましくは約１２５〜１５０回の
全通過を行う。

次に弱毒化ウィルスを集め（ｈａｒｖｅｓ ｔｅｄ）、
標準無菌性試験を行って細菌。

真菌、マイコプラズマおよびその他の汚染物質の存在を
試験する。

本明細書中で使用する゛弱毒化ウィルス゛とはウィルス
をヒトに接種したとき抗原性すなわち抗体産生刺激能力
は保持しでいるが重い症状を起こすことがないようにピ
ルレンスを培養方法で変化させであるウィルスのことを
いう。

弱毒化ウィルスは集めた（ｈａｒｖｅｓ ｔｅｄ）ウィ
ルスを濾過して細胞および細菌を除いてワクチンとして
用いるが、濾液はそくまま用いるか、あるいは凍結させ
て後で用いるか、あるいは凍結乾燥した後、使用時に水
のような溶媒で再生して用いる。

濾液を凍結乾燥する場合には卵白のような安定剤を用い
ることが好ましい。

このワクチンは皮下投与することができる。

投与量は弱毒化ＣＭＶの１００ＴＣＩＤ５０以上を使用
することができ。

１０．０００ ＴＣＩＤ５調度の量も使用できる。

本発明の弱毒化ウィルスはヒトのディプロイド肺繊維芽
細胞をこのウィルスで接種し、その中で弱毒化ウィルス
を増殖させることによって多量に製造することができる
。

弱毒化ウィルスは最大力価（ｔｉｔｅｒ）の時期（例え
ば約１週間後）に集めることができる。

次に本発明のＣＭＶワクチンの製法および試験について
の実施例を示すが、これらの実施例は本発明の範囲を限
定するためのものではない。

ウィルスの取得方法 使用したＣＭＶはサイトメガリック封入病の生後２ケ月
のヒトの男の乳児の尿から得たものである。

この株はタウネ株で、上述した株である。この尿をＷＩ
−３８ヒトディプロイド肺繊維芽細胞上に接種する。

このウィルスの組織培養用の栄養培地は予めスクリーニ
ングした子牛血清２％が加えであるイーグル最小必須培
地（ＭＥＭ）である。

培地１ｍｌ中の抗生物質の濃度はペニシリン１００μｇ
、ゲンタミシン１０μｇ、アンホテリシンーＢ２μｇで
ある。

これら特に挙げた抗生物質以外の抗生物質も使用できる
。

弱毒化ＣＭＶの製造方法 上澄液および容器の表面から０．２５％のトリプシン生
理的食塩水溶液を用いて取ったウィルス感染細胞からな
る収穫物を固定ＷＩ−３８ヒトディプロイド肺繊維芽細
胞上に接種し、これら細胞の感染が開始した後通過を行
う。

細胞感染開始のためおよびその後の全通過に使用する栄
養培地は上記のウィルスの組織培養に用いたものと同じ
である。

各通過に用いた温度は３７℃である。しかし。この温度
よりやや低い温度、例えば約３０〜３７℃の範囲の温度
も使用できる。

各通過の期間は７日であるが、これよりやや短期間また
は長期間１例えば５日または１０日を用いることができ
る。

初期通過（回数約１０回）においては、毎回その前の通
過から得たウィルス感染細胞を含む上澄液を新しいＷＩ
−３８ヒトデイブロイド肺繊維芽細胞上を通過させる。

前回の通過からの細胞含有液の約２５％を毎回の通過に
用いる。

通過回数は相当量の無細胞ウィルスを生成する株を得る
ような回数を選ぶ（ＣＭＶは通常細胞付随ウィルスであ
る）。

従って、いくらか少ない通過回数または多い通過回数を
用いることができる。

１０回目の通過からの上澄液をデカンテーションで得、
これを１２０ Ｏｒｐｍで遠心分離して無細胞ウィルス
含有液を得る。

この無細胞ウィルス含有無細胞液を次に新しいＷＩ−３
８ヒトデイプロイド肺繊維芽細胞上に２８回連続通過さ
せる。

この場合、おのおのが７５ｃｍの表面積を持つ容器に１
ｍｌの液を用いて接種した。

ここでは２８回の通過を用いたが９通過回数は所望量の
無細胞ＣＭＶをつくるのに十分な回数であればよい。

従って、２８回より多いかまたは少ない無細胞液の通過
回数も使用できる。

音波処理によって細胞から放出されたウィルスをも含む
上澄液を集め１次に新しいＷＩ−３８上に十分な回数（
例えば約１１５回）連続通過させてウィルスを弱毒化す
る。

上記の全工程に用いた全通過回数は通常約５０〜１５０
回、好ましくは１２５〜１５０回である。

末端希釈（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ） Ｉ
こよる弱毒化ウィルスのクローニングは５０．６０おヨ
ヒ７０回の通過で行う。

ワクチンプール用のウィルスは最大ウィルス力価時（一
般に約１週間）の感染Ｗ■−３８培養の上澄液から集め
る。

この方法で、最初に製造したＣＭＶから多量の弱毒化Ｃ
ＭＶが得られる。

ＣＭＶワクチンの特徴 ＣＭＶワクチンはＷＩ−３８細胞のようなヒト繊維芽細
胞上で増殖する。

その細胞変性効果（ＣＰＥ） は文献中に記載されてい
るヒトＣＭＶの特徴である。

このＣＭＶは感染培地の上澄液を濾過し且つ新しいＷＩ
−３８細胞上に接種するこ七により無細胞形で容易に繁
殖させることができる。

ＣＰＥは感染多重度によって４〜１０日以内に起こる。

封入体が文献の記載通りに形成され。ヘマトキシリン−
エオシンまたはギームザで染色することができる。

この弱毒化ウィルスは栄養アガローズ被覆層（ｎｕｔｒ
ｉｅｎｔ ａｇａｒｏｓｅ ｏｖｅｒ−１ａｙ）でプラ
グを形成する。

このワクチンは一７０℃で７０％ソルビット蒸留水溶液
（ソルビット溶液１容に対してウィルス１容）中に貯蔵
しなければならない。

無細胞弱毒化ウィルスは市販のヒト抗血清（Ｆｌｏｗ
Ｌａｂｓ、、メリーランド州ベテスグ）。

ＣＦ力価１：１６（希釈比１：１０）で血清中和（ｓｅ
ｒｏｎｅｕｔｒａｌ １ｓｅ）するこきができる。

０．１ ｒｎｌの希釈血清が２５０ＴＣＩＤ５ｏを中和
する。

ＡＤ１６９株に対して高度免疫性のモルモット血清も使
用することができる。

次表には、単独および補体の存在下における血清中和（
ＳＮ）力価を示す。

ＳＮはミクロプラグ〔リンプロ（Ｌ １ｎｂｒｏ））す
なわち６０ＴＣＩＤ５゜タウネ１２５の懸濁液０．０２
５ｍ１＋希釈血清０°０２５ｍ１中で行なった。

１時間後、１０％の未加熱子牛血清を含むイーグルの変
形基本培地中に１０４個のＷＩ−３８細胞を含む０．２
５０７７１７を加える。

３７°Ｃで５〜７日間培養後、ミクロプラクを読む。

１希釈当り８個の井戸（Ｗｅｌｌｓ）を用いた。

ワクチンの試験方法 接種に用いる各プールは細菌、真菌、マイコプラズマの
存在を試験す兆ため適当な人造培地に接種した。

動物における安全性試験としては、プールの一部を成体
二十日ねずみ（腹膜腔内および大脳内）、二十日ねずみ
乳児（腹膜腔内および大脳内）１モルモット（腹膜腔内
）およびウサギ（皮肉）に注射を行なった。

接種後種々の時間（すべて数時間）の動物実験ではすべ
ての動物が良好な健康状態であった。

２０匹のサーコピテカス（ｃｅｒｃｏｐｉ ｔｈｅｃｕ
ｓ）猿にワクチン０．５ ｍｌをそれぞれを髄内、大脳
内（こ接種し、また１ ｍｌを筋肉内に接種した。

これらの猿は全て新しいモルモット補体の存在する場合
も不在の場合も共に１００ＴＣＩＤ、ｏＣＭＶ 中和に
対して血清陰性であった。

この猿を３週間後再度試験した。

この観察期間中、臨床または病理学的試験でこれらの同
じ猿は何らの血清変化（ｓｅｒｏ−ｃｏｎｖｅｒｓｉｏ
ｎ）も示さなかった。

組織培養液中で、同定および汚染物質の不在を示すため
の試験をさらに行なった。

第一次アフリカグリーン猿の腎臓、ヒトの胎児の腎臓、
第一次ウサギの腎臓およびＷＩ−３８細胞のすべてをウ
ィルスの一定量で、直接、あるいは３７°Ｃで１時間中
和後つサギＣＭＶ血清と共に接種した。

ＣＭＶウィルスの定量のためのプールの滴定はＷＩ−３
８細胞についで終点希釈試験によって行なった。

人体におけるワクチンの試験結果 このワクチンを成人について試験り、ＣＭＶに対する抗
体に対して予備試験し、試験には血清陰性者のみが含ま
れた。

１０人の血清陰性の成人に１０３、ＯＴＣＩ Ｄ５０を
鼻内に投与した。

何らの血清変化も起こらなかった。

これは本発明のウィルスがもはや通常の投与方法では感
染性でないことを示している。

他の９人の成人には同量を皮下投与したが、すべての場
合に血清変化があった。

症状は何ら見られなかったし、尿、咽喉または血液から
ウィルスは回収されなかった。

上記結果を得るのに、１ｍｌ容量のウィルスを皮下投与
した。

綿が先に付いたアプリケータ棒で咽頭綿棒をつくり、後
咽頭部上を動かした。

両方の型の綿棒を、直ちに１ｍｌ中にゼラチン０．１％
、ストレプトマイシン１０００μｓ、マイコスタチン４
００μｇを含むバンク培地が入っているねじ込み栓付き
管中に入れた。

試料は回出と組織培養液に接種するまで４℃で貯蔵する
か、あるいは２週間以内に試験を行なうまで一２０℃で
貯蔵した。

尿を直接ＷＩ−３８細胞に接種した。

ヘパリン添加血液を集め、白血球に富むプラズマが得ら
れるまで４°Ｃで重力によって沈降させることによって
ウィルス血症の試験を行なった。

２分間音波処理後、このプラズマを組織培養液に接種す
る。

凝固した血液試料からの血清について補体結合試験およ
び蛍光抗体試験を用いて抗体研究を行なった。

次の試験で、９人の新規の血清陰性の成人に同量（１０
３，ＯＴＣＩ Ｄ５ｏ）を皮下投与した。

何らの全身症状も見られず、９人全員がＣＭＶに対する
抗体を生成した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ビルレントサイトメガロウイルスを十分な回数ヒト
   のディプロイド肺繊維芽細胞中を通過させることにより
   、ヒトに投与するときこのウィルスが接触者に重い症状
   を起さずすなわちウィルス排出および蔓延を最少以下に
   止めて免疫を与えることから成るサイトメガロウィルス
   の弱毒化方法。