DE2132911C2

DE2132911C2 - Verfahren zum Herstellen eines stark abgeschwächte Rötelviren enthaltenden Impfstoffs

Info

Publication number: DE2132911C2
Application number: DE2132911A
Authority: DE
Inventors: Hideaki Nara Yaoi
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1970-10-03
Filing date: 1971-07-02
Publication date: 1984-01-19
Also published as: FR2112249B1; NL171777B; NL171777C; NO135994B; NL7108753A; CH581195A5; GB1360838A; NO135994C; DE2132911A1; FR2112249A1; JPS4838843B1; SE377279B; DK128789B; BE769644A

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines stark abgeschwächte Rötelviren enthaltenden Impfstoffs durch Passagieren der Rötelviren In Nleren-Gewebekulturen, der weit weniger Nebenwirkungen hat als die bisher bekannten Impfstoffe. J5

Die Rötelnkrankheit Ist eine durch Infektion mit dem Rötel-Virus hervoigerufene masernartige Infektionskrankheit, die durch leichtes Fieber. Hautausschlag und Schwellungen der Lymphknoten gekennzeichnet Ist, die nach einer Inkubationszelt von einigen Wochen auftreten. Bei Säuglingen und Kindern ergeben sich keine ernsten Symptome, jedoch Ist die Krankhfl! be! Erwachsenen bedenklicher, well sie von Arthritis. Arthralgle oder dgl. begleitet Ist. Insbesondere bei Rötelnerkrankung von Schwangeren Im Frühstadium der Schwangerschaft gelangt die Infektion über die Placenta zum Fetus, wobei Kinder mit dem kongenitalen Rötel-Syndrom, z. B. Katarakten, kongenitalen Herzstörungen und hochgradiger Schwerhörigkeit, geboren werden. Ferner Ist festgestellt worden, daß die Rötelnkrankheit periodisch In größerem Umfange auftritt. Daher 1st die Entwicklung einer wirksamen Bekämpfungsmaßnahme der Röteln bei den Ärzten sehr erwünscht.

Es Ist natürlich erwünscht, die Rötelnkrankheit mit allen Mitteln zu beKämpfen, die Möglichkeit einer Rötel-Impfung wurde nach der Entdeckung des Rötel-Virus von Weller und Mitarbeitern und Parkman und Mitarbeitern im Jahre 1962 eingehend untersucht. Als Ergebnis wurde gezeigt, daß das Rötel-Virus durch eine Reihe von Passagen in Gewebekulturen von Säugetier- oder Geflügelembryonen bis zu einem solchen Virulenzgrad geschwächt werden kann, daß es möglich ist, Menschen mit einem abgeschwächten Lebendimpfstoff zu Impfen und die Geimpften ohne ernste Nebenwirkungen Immun zu machen.

Es wurde klinisch nachgewiesen, daß durch Impfung von Säuglingen und Kindern mit einem abgeschwächten Rötel-Lebendimpfstoff die entsprechende Antikörper-Reaktion ausgelost werden kann, ohne dall nachteilige klinische Reaktionen auftreten, und daß ferner Personen. In denen der Antikörper erzeugt worden lsi, gegen den BeIaII mit Röteln geschützt werden können. Das Röiel-Vlrus 'vlrd gelegentlich aus dem Hals der Geimpften In Laboratorien Isoliert, jedoch lsi die Koniaktinfektlun bekanntlich nie bei In der Nilhe befindlichen gefährdeten Kindern jnd Erwachsenen fes'gesteüi worden.

Andererseits sind jedoch bei Impfung ve η Erwachsenen, Insbesondere Frauen Im fortpflanzungsfähigen Alter, mit dem bisher bekannten abgeschwächten Rötel-Vlrus-Lebendlmpfstoff die Reaktionen von denen bei Säuglingen und Kindern verschieden, und häufig werden die für Röteln typischen Symptome wie Heber, Unwohlsein. Hautausschlag, Arthritis, Arihralgie und dgl. beobachtet. Die Impfung von gefährdeten Erwachsenen mit dem bekannten abgeschwächten Rötel-Vlrus-Lebendimpfstoff Ist somit Immer noch ein schwieriges Problem.

Ferner lit es unbekannt, ob der bekannte Impfstoff völlig ungefährlich In bezug auf die Mlßblldungsenistehung oder fötale Toxlzität für das Kind Ist, wenn Schwangere damit geimpft werden.

Es wurde nun gefunden, daß durch Weiterzüchtung des Rötel-Virus in einer Reihe von Passagen In einer Gewebekultur, die primäre Nierenzellen des Meerschweinchens enthält, das Rötel-Virus mit zunehmender Zahl der Passagen schnell abgeschwächt werden kann. Durch diese Abschwächung gelang die Herstellung eines stark abgeschwächten Rötel-Virus-Impfstoffes, der nicht zu den oben genannten unerwünschten Nebenwirkungen bei Erwachsenen führt.

Gegenstand der Erfindung Ist demgemäß ein Verfahren zum Herstellen eines stark abgeschwächte Rötulvlren enthaltenden Impfstoffs durch Passagleren der Rötelviren In Nieren-Gewebekulturen bei Temperatuten 'on 28 bis 36' C, Abbrechen der Hassagen, wenn eine ausreichende Attenuierung erreicht ist, und Konfektionieren der geernteten Rötelviren zu einem Lebendimpfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß die Röielvlren In wenigstens 10 Passagen In einer Gewebekultur, die primäre Nierenzellen des Meerschweinchens enthält, gezüchtet werden.

Für das Verfahren gemäß der Erfindung können beliebige Stämme des Rötel-Virus als Impfvfrus verwendet werden. Als Beispiel eines geeigneten Rötel-Virusstammes Ist der Stamm To-336 zu nennen Dieser Stamm ist besonders vorteilhaft beim Verfahren gemäß der Erfindung für die Herstellung eines stark abgeschwächten Retel-Vlrus-Lebendlmpfstoffes.

Der Rötel-Virusstamm To-336 wurde aus einem Halsabstrich eines Mädchens, das von Masern befallen war, In Japan isoliert. Seine Subkultur wurde bei der American Type Culture Collection, Maryland, USA, unter Zugangsnummer ATCC-VR-553 hinterlegt.

Die beim Verfahren gemäß der Erfindung zu verwendenden primären Nierenzellen des Meerschweinchens können in an sich bekannter Welse hergestellt werden. Das Rötel-Virus wird In eine Gewebekultur, die diese Zellen zusammen mit einem geeigneten Gewebekulturmedium enthält, geimpft und stationär oder unter Drehen etwa 5 bis 10 Tage (gewöhnlich etwa 1 Woche) bebrütet. Die Bebrütung erfolgt In der Praxis bei einer Temperatur von etwa 28 bis 36° C, wobei eine Temperatur von etwa 29 bis 32° C besonders vorteilhaft Ist. Das auf diese Welse vermehrte Virus wird dann In eine die Zellen enthaltende frische Gewebekultur als solche oder nach geeigneter Verdünnung für die anschließende Passage geimpft. Mit aufeinanderfolgender Wiederholung

dieser Passage verlauft die Abschwächung des Rötel-Virus schnell

Als Gewebekulturmedlen eignen sich beispielsweise Hanks-Lösung. F.urle-Lflsung. Gey-l.ösung. TC-Medlum ]99 und Eagle-Medlum Diese Medien können, falls erforderlich, mit üblichen Zusatzstoffen, z. B. Lactalbumlnhydroiysal und Inaktiviertem Kalbsserum ergän/t werden. Ferner kann man dem Medium ein oder mehrere Antibiotika wie Penicillin, Streptomycin, Dlhydrostreptomycln, Neomycin oder Kanamycin zusetzen, so daß die Vermehrung von durch zufällige Verunreinigung vorhandenen Fremdmikroorganismen In der Kultur verhindert wird

In dieser Welse wird das Rötel-Virus In einer Reihe von Passagen weitergezüchtet, bis durch Vers jchslmpfung vor» seronegativen Personen, die für das Rötel-Virus empfänglich sind, die Bestätigung erhalten worden ist. daß das Virus genügend abgeschwächt Ist. Die erforderliche Zahl de^r Passagen für die genügende Abschwächung variiert mit der Virulenz des verwendeten Rötel-Virus, der BebrUtungszelt In einer Passage und dgl., jedoch sind Im allgemeinen wenigstens IO Passagen erforderlich. Das Rötel-Virus kann somit durch Passagen In der Gewebekultur, die primäre Nierenzellen des Meerschweinchens enthält, weit schneller abgeschwächt werden als bei den bekannten Abschwächungsverfahren für das Rötel-Virus. (Dies wird durch den nachstehend beschriebenen Versuch 2 veranschaulicht.)

Die beschriebene Abschwächung des Rötel-Virus kann durch Anwendung der Grenzverdünnungsmethode bei den Passagen mit der Gewebekultur, die die primären Nierenzellen von Meerschweinchen enthält, welter erleichtert werden. (Dies wird durch den nachstehend beschriebenen Versuch 3 veranschaulicht.) Bei der Grenzverdünnungsmethode wird mit der Kulturflüsslgkelt der vorhergehenden Passage eine Verdünnungsreihe bei einem Verdünnungsfaktor von 2 bis 10 hergestellt. Jede verdünnte Flüssigkeit wird In eine Gewebekultur geimpft, die die primären Nierenzellen enthält, und bebrütet, um die stärkste Verdünnung für die Vermehrung des Virus In dieser Passage zu ermitteln. Dfe Kulturflüssigkeit, die aus dem Impfvirusmedium mit der stärksten Verdünnung erhalten wird, wird als Impfvirus für die nächste Passage verwendet. Die Grenzverdünnungsmethode kann bei jeder beliebigen Passage oder bei allen beliebigen Passagen in der Reihe von Passagen mit der die primären Nierenzellen enthaltenden Gewebekultur angewandt werden.

Falls erforderlich, kann das Rötel-Virus In der Reihe von Passagen mit der die genannten Zellen enthaltenden Gewebekultur unter Einfügung mehrerer Passagen mit einer Gewebekultur von anderen Tierzellen weitergezüchtet werden. Beispiele geeigneter anderer tierischer Zellen sind Embryozellen von Wachteln, Enten und Hühnern. Besonders vorteilhaft Ist die Einfügung von 1 bis 5 Passagen mit Embryozellen der V/achtel In die Hauptpassagen mit den primären Nierenzellen des Meerschweinchens.

Das auf diese Weise abgeschwächte Rötel-Virus wird als Impfvirus für die Herstellung der stark abgeschwächten Rötel-Virus-Lebendlmpfstoffe gemäß der Erfindung verwendet. Das abgeschwächte Virus wird In an sich bekannter Welse in eine Gewebekultur für die Impfstoffherstellung, z. B. Gewebekulturen, die primäre Nierenzellen des Meerschweinchens und Kaninchens enthalten, geimpft und darin bebrütet. Es ist zu empfehlen, daß das Virus In einem Kulturmedium vermehrt wird, das keine Substanzen enthält, die als Antigen wirksam sein können, wenn Menschen mit dem Impfstoff geimpft werden. Aus dem hierbei erhaltenen Kulturmedium werden Feststoffe wie Zellen. Zellbestandteiie und dgl. beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren entfernt. Das ^r) Fllirat oder der Überstand kann als solcher oder nach Verdünnung mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, z. B. physiologischer Kochsalzlosung oder destilliertem Wjsser. je nach dem Vlrustlter als Produkt der Erfindung verwendet werden.

κι Der In der beschriebenen Welse hergestellte stark abgeschwächte Röiel-Virub-Lebendlmplsioff Ist gebrauchsfertig, kann jedoch In eingefrorener Form mit oder ohne Zusatz eines oder mehrerer stabilisierender Mittel wie Saccharose, Lactose. Glutamate und Phos-

r> phate konserviert werden. Sie kann auch mit oder ohne Zusatz eines oder mehrerer stabilisierender Mittel, wie menschllcnem Serumalbumln, Gelatine und dgl. für die Lagerung gefriergetrocknet werden. Das gefriergetrocknete Produkt wird bei Gebrauch In einem geeigneten

2<j Verdünnungsmittel, z. B. physiologischer Kochsalzlösung oder sterilem destilliertem Wasser, gelöst.

Für eine befriedigende Impfung Ist es erforderlich, wenigstens 10²⁰ InD₁₀ (50'*,lge Interferierende Dosis) Vlrusille/ pro Person vorzugsweise subkutan In einer elnzlgen Dosis zu verabreichen. Besonders bevorzugt wird eine Dosis von 10²⁵ bis 10³·⁵ InD,,,.

Für die subkutane Impfung muß eine Dosis des notwendigen Vlrustlters In einem wäßrigen Präparat von etwa 0,1 bis 1,0 ml, zweckmäßig 0,25 bis 0,5 ml, enthal-

3') ten sein. Der Impfstoff muß daher zum Gebrauch so eingestellt werden, daß er den stark abgeschwächten Rötel-Vlrusstamm In einem Rötel-Vlrustlter von wenigstens 10²⁰ InD„,/ml, zweckmäßig etwa 10²' bis 10¹·⁵ InD,₀/ml und einen physiologisch unbedenklichen Träger für das

« Virus enthält.

Wenn Säuglinge und Kinder mit dem in dieser Welse hergestellten stark abgeschwächten Rötel-Virus-Impfstoff geimpft werden, ist anschließend eine bemerkenswerte Steigerung des Antikörpergehalts Im Serum festzustellen, der eine Infektion durch das Rötel-Virus verhindert. Wenn Erwachsene einschließlich Frauen Im fortpHanzungsfählgen Alter geimpft werden. Ist ebenfalls ein Anstieg der Antikörperkonzentration Im Blutserum festzustellen. Es ist bemerkenswert, daß hierbei keine für Röteln typischen Symptome beobachtet werden, die als une/wünschle Nebenwirkungen angesehen werden, die häufig nach einer Impfung mit den bisher bekannten Rötel-Vlrus-Impfstoffen auftreten. Der neue und stark abgeschwächte Rötel-V'rus-Impfstoff, hergestellt gemäß

⁵" der Erfindung, kann somit unbedenklich selbst für Erwachsene verwendet werden, um sie wirksam gegen eine Rötel-Vlrus-Infektlon zu Immunisieren.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele welter erläutert. Die Sicherheit des stark abgeschwächten Rötel-Virus-Impfstoffes wird durch die nachstehend beschriebenen Versuche welter veranschaulicht.

Beispiel 1

Gesunden Meerschweinchen werden die Nieren aseptisch entnommen. Die Nieren (nachstehend als »MSN« bezeichnet) werden mit ausgewogener Hanks-Salzlösung¹) gewaschen und zerkleinert. Das zerkleinerte Gewebe wird In etwa dem 50fachen Volumen einer mit 0,25% Trypsin ergänzten Hanks-Lösung suspendiert und unter Bewegung digeriert. Die erhaltenen freien Zellen werden durch Zentrifugleren für 5 Minuten bei !000 UpM abgetrennt und mit Hanks-Lactalbumlnlösung²), die mit 5% Inaktiviertem Kalbsserum ergänzt worden Ist,

In einer solchen Menge verdünnt, dali die erhaltene ZeII-suspenslon etwa 5 χ 10' Zellen pro Mllllllier enthalt. Die Suspension wird statlonür In 50-ml-Flaschen bei 36' C bebrütet Nach 7 Tagen werden die Zellen, die sich festanhaftend an der Innenwand der Flaschen vermehrt haben. 3mal mit TC-Medlum ;99 ) gewaschen, um eine Prlmürzellkultur von MSN herzustellen.

0.2 ml der lOfach verdünnten Flüssigkeit eines Rölel-Vlrusstanimes. der von einem von Röteln befallenen Patienten Isoliert und in 13 Passagen auf primären Nierenzellen des afrikanischen Grünaffen (nachstehend als »AGM.v« bezeichnet) .veliergezUchiei worden Ist. wird In die MSN-Zellkultur gelmplt und 90 Minuten bei 37 C stehengelassen Die Kulturflüsslgkelt wird dann verworfen, worauf die Zellen 5mal mit TC-Medlum 199 gewaschen werden Abschließend werden 5ml TC-Medlum 199. das durch 2% Inaktiviertes Kalbsserum ergänzt worden Ist. In die Flaschen gegeben, worauf 7 Tage bei 32 C bebrütet wird Die Kulturflüsslgkelt wird 5 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert, wobei der Überstand abgetrennt wird, der nach lOfacher Verdünnung mit TC-Medlum 199 als Impfvlius für die nächste Passage verwendet wird.

Auf diese Welse wird die Passage mit der MSN-Gewebekultur 45mal wiederholt. Die Kulturflüsslgkelt der 45. Kultur wird zentrifugiert, wobei ein stark abgeschwächtes Impfvirus für die Herstellung eines Rötei-Vlrus-Impfstoffes erhalten wird.

10 ml des !Ofach verdünnten Implvirus werden in eine Primärzellkultur von Kaninchennieren (nachstehend als »KN« bezeichnet), die In der gleichen Welse, wie vorstehend beschrieben, hergestellt worden ist, in 500-ml-Roux-Flaschen geimpft und 90 Minuten bei 37° C stehengelassen. Die Flüssigkeit wird verworfen, worauf die Zellen 5mal mit TC-Medlum 199 gewaschen werden. Dann werden 40 ml serumfreies TC-Medlum 199 in die Flaschen gegeben, worauf 7 Tage bei 32° C bebrütet wird. Die erhaltene Kühlflüssigkeit wird 5 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert, wobei ein stark abgeschwächter Rötel-Virus-Impfstoff als Überstand erhalten wird. Der Überstand zeigt einen Rötel-Vlrustiter von 10³⁵ InDso/ml, ermittelt mit dem System ECHO-Il⁴) und AGMK.

Das Produkt wird zur Lagerung bei - 70" C eingefroren. Nach einer Lagerungszelt von 100 Tagen wird es aufgetaut und mit physiologischer Kochsalzlösung auf das 3fache Volumen verdünnt. Mit dem verdünnten Impfstoff werden anschließend Erwachsene sowie Kinder und Säuglinge am Arm geimpft, wobei sich der gewünschte Immunisierungseffekt einstellt

Bedeutung der Bezugszeichen:

') Die ausgewogene Hanks-Salzlösung r-.-Λ folgende Zusammensetzung:

NaCI	8,0 g
KCI	0,4 g
CaCI₂	0.2 g
MgSO₄ · 7H₂O	0,2 g
Na₂HPO₄ 2H₂O	0,06 g
KH₂PO₄	0,06 g
NaHCO)	0,25 g
d-Glucose	1,0 g
Phenolrot	0,02 g
destilliertes Wasser Ofach destilliert)
zur Auffüllung auf I I.

²) Hanks-Lactalbumin-Lösung wird hergestellt durch Auflösen von 5 g Lactalbumlnhydrolysat In der ausgewogenen Hanks-Salzlösung bis zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml.

') Das TC-Medlum 199 Ist eine auf pll 7.2 eingestellte steril«. wllUrlgc lösung, die Aminosäuren, l'urlnbasen. Pyrimkünbuse. Vitamine, /ucker. Nucleotide, anorganische Sal/e u·.» enihült Die genaue Zusammensetzung wird beispielsweise von J F Morgan und Mitarbeitern In Proi Sou { xp lim Metl . 73. S I bis 8 (1950) genannt

⁴)»F.C"HO II« bedeutet »ECHO Virus. Typ II·· idregury-Stamm) Dieser Stamm wird hiiullg für die I-rniuilun^ der Inlektlosltül des Rötel-Virus verwende! Verwiesen wird beispielsweise auf »Ne>v F.ng. J Med «. 275. 56V V4. l%6

Beispiel 2

Der gleiche Rötel-Vlrussiamni wie ni Beispiel I wird über 10 Passagen unter Anwendung de' Grcn/verdUnnungsmethode welterge/üchtel Hierbei w;rd die Flüssigkeit des Impfvirus mit TC'-Medluni 199 In 5lacher ReI-henverdünnung von I : 5' bis I : 5* verdünnt Jc 0.2 ml der verü'lnnten Fluss gkc".en werde ι In eine auf die In Beispiel 1 best-luici/t-üe Welse hergestellte MSN-Zellkultur In 10 Flaschen von 50 ml Fassungsvermögen Inocullerl und 7 Tage unter den In Beispiel 1 genannten Bedingungen bebrütet. Die jeweiligen Kulturflüssigkelten werden 5 Minuten bei 3000 LpM zentrifugiert Der Überstand wird für die Aufbewahrung bei - 70 C eingefroren.

Die Grenzverdünnung für die Vermehrung des Virus

In der Passage wird nach der folgenden Interferierenden Methode unter Verwendung des Virus der veslcularen Stomatitis bestimmt.

Die In der beschriebenen Weise von den Flüssigkeiten abgetrennten Zellen werden nach zweimaligem Waschen mit ausgewogener Hanks-Salzlösung mit 100 TC1D<„ (50% tissue culture infectious dose = 50% der für die Gewebekultur Infektlösen Dosis) des Virus der Stomatitis veslcularls inoculiert und 2 Tage bei 36° C in 5 ml TC-Medlum 199 bebrütet, das durch 2% Inaktiviertes Kalbsserum ergänzt Ist Die jeweiligen Zellen werden dann unter dem Mikroskop auf das Auftreten von zyiopathogenen Effekten beobachtet, die durch das Virus der Stomatitls veslcularis verursacht werden, um die stärkste Verdiinnung für die Vermehrung des Virus zu bestimmen.

Von den aufbewahrten Überständen der Zentrlfugierung werden nur diejenigen aufgetaut, die aus der am

•*5 stärksten verdünnten Impfvirusflüssigkeit erhal;?n wordc "!.id Die aufgetauten Flüssigkeiten werden rr it TC-Medlum 199 durch 5fache Reihenverdünnung von 1 : 5' bis 1 : 5" verdünnt Je 0.2 ml der verdünnten Flüssigkelten werden In eine frische MSN-Zellkultur In 10 FIasehen von 50 ml Fassungsvermögen Inoculiert und unter den oben genannten Bedingungen bebrütet. Die stärkste Verdünnung für die Vermehrung des Virus wird erneut in der oben beschriebenen Welse bestimmt. Die Kulturflüsslgkelt, die von der am stärksten verdünnten Impfvirusflüsslgkelt erhalten worden Ist, wird als Impfvlrus_/ für die nächste Passage nach 5facher Reihenverdünnung verwendet.

Auf diese Welse wird die Passage mit der MSN-Zellkultur lOmal unter Anwendung der Grenzverdünnungsmethode wiederholt. Die Kühlflüssigkeit der zehnten Kultur wird zentrifugiert, wobei ein stark abgeschwächtes Impfvlrus für die Herstellung eines Rötel-Vlrus-Impfstoffes erhalten wird.

Das Impfvlrus wird In die KN-Zellkultur (Kanlnchennieren) In Roux-FIaschen Inoculiert und auf die In Beispiel 1 beschriebene Welse unter Verwendung eines serumfreien TC-Medlums 199 verarbeitet, wobei ein stark abgeschwächter Rötel-Virus-Impfstoff erhalten

IO

wird. Der Impfstoff zeigt einen Rötel-Vlrus-Tlter von IO⁴⁰ InDso/ml, ermittelt mit dem gleichen System wie in Beispiel 1.

Auf die In Beispiel 1 beschriebene Welse wird das Produkt zur Lagerung eingefroren und anschließend aufgetaut und zur Impfung verwendet, wobei gute Immunisierung bei Erwachsenen sowie bei Kindern und Säuglingen erzielt wird.

Beispiel 3

Wachtelembryonen (nachstehend als »WE« bezeichnet) werden aseptisch aus den Bruteiern am fünften Tag entnommen und nach dem Abschneiden des Kopfes auf die In Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, um eine WE-Zellkultur herzustellen. In die Zellkultur wird der In Beispiel J genannte Rötel-Virusstamm geimpft und unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen bebrütet. Die Passage mit der WE-Zellkultur wird zweimal wiederholt. Die Kühlflüssigkeit der zweiten Kultur wird zentrifugiert. Der Überstand wird In eine In Flaschen enthaltene MSN-Zellkultur (Meerschweinchen) geimpft, die auf die In Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt worden Ist. Das Inoculum wl'd unter den in Beispiel ί genannten Bedingungen bebrütet. Der durch Zentrifugieren der erhaltenen Kultur gewonnene Überstand wird auf das lOfache Volumen verdünnt und in eine frische MSN-Zellkultur inoculiert. Auf diese Weise wird die Passage mit der MSN-Zellkultur 20mal wiederholt. Anschließend werden zwei weitere Passagen mit der WE-Zellkultur und dann weitere zehn Passagen mit der MSN-Zellkultur μ durchgeführt.

Das auf diese Weise erhaltene Impfvirus wird In die KN-Zellkultur in 500-ml-Roux-Flaschen inoculiert und auf die In Beispiel 1 beschriebene Welse unter Verwendung eines serumfreien TC-Mediums 199 verarbeitet. wobei ein stark abgeschwächter Rötel-Vlrus-Impfstoff erhalten v-lrd. Der so erhaltene Impfstoff zeigt einen Rötei-Vlrus-Titer von IO^J6 InD<„/ml, ermittelt mit dem gleichen System wie In Beispiel 1.

Auf die in Beispiel I beschriebene Weise wird das Produkl zur Lagerung eingefroren und anschließend aufgetaut und für die Impfung verwendet

Die im vorstehend beschriebenen Versuch verwendeten Zellen der Wachtelembryonen müssen beim COFAL-Test negativ sein [s beispielsweise P. S. Sarma und Mitarbeiter. Virology 23. 313 ff. (1964)1.

Beispiel 4

0.2 ml lOOfach verdünnte flüssigkeit vom Rötel-Virus-Stamm To-336, der 7 Passagen auf AüMK-Zellen (afrikanischer Grünaffe) durchlaufen hat, wird in eine auf die in Beispiel I beschriebene Welse hergestellte MSN-Zellkultur in 50-ml-Flaschen Inoculiert. Das Inocu Ium wird unter den In Beispiel I genannten Bedingungen bebrütet. Diese Passage in der MSN-Zellkultur wird 19mal wiederholt. Die Kulturflüsslgkelt der neunzehnten Passage wird zentrifugiert, wobei ein stark abgeschwächtes Impfvirus für die Herstellung eines Rötel-Vlrus-Impfstoffes erhalten wird. 6"

Das Impfvirus wird In KN-Zellen (Kaninchen) In 500-ml-Roux-Flaschen geimpft und auf die in Beispiel 1 beschriebene Welse unter Verwendung von serumfreiem TC-Medlum 199 verarbeitet, wobei ein Siark abgeschwächter Rötel-Vlrus-Impfstoff erhalten wird. Der hierbei erhaltene Impfstoff zeigt einen Rötel-Vlrus-Tlter von ΙΟ⁴·³ InD₅₀/ml, ermittelt mit dem gleichen System wie In Beispiel I. Auf die In Beispiel 1 beschriebene Weise wird das Produkt zur Lagerung eingefroren, späte«- aufgetaut und für die Impfung verwendet.

Beispiel 5

0,2 ml einer IOOfach verdünnten Flüssigkeit von Rötel-Virus, Stamm To-336, eins In einer Reihe von 7 Passagen auf AGMK-Zellen weitergezüchtet worden Ist, werden in eine auf die In Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellte und In 50-ml-Flaschen enthaltene MSN-ZeIlkultur inoculiert. Das Inoculum wird unter den In Beispiel 1 genannten Bedingungen bebrütet. Die Passage auf der MSN-Zellkultur wird 20mal wiederholt, wobei die In Beispiel 2 beschriebene Grenzverdünnungsmethode bei der zweiten bis fünften Passage und bei der 18. Passage angewandt wird.

Das auf diese Welse erhaltene stark abgeschwächte Impfvirus wird an die KN-Zellkultur In 2 Passagen weller adaptiert und dann 'n die In SOO-ml-Roux-Flaschen enthaltene KN-Zellkultur inoculiert und auf die in Beispiel I beschriebene Weise verarbeitet, wobei ein stark abgeschwächter Rötel-Vlrus-Impfstoff erhalten wird. Dieser Impfstoff hat einen Rötel-Vlrus-Tlter von ΙΟ⁴·¹ Inüw/ml, ermittelt mit dem gleichen System wie In Beispiel I.

Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wird das Produkt für die Lagerung eingefroren, später aufgetaut und für die Impfung verwendet.

Versuch I

Die gemiili Beispiel 1 bis 5 hergestellten stark abgeschwächt· η Röiel-Vlrus-Impfstoffe wurden den Tests unterworfen, die in Al xhnitt 73.114 der Public Health Servxe Regulations. Title 42, Part 73, USA, für Sicherheitstests von »poliomyelitis vaccine, live, oral«, und in Abschnitt 73.73 der gleichen Vorschriften für Sterllltätstests beschrieben sind.

Als Ergebnis der Impfversuche bei verschiedenen Tieren (Kaninchen, erwachsene Mäuse, Jungmäuse und Meerschweinchen), Gewebekulturtests mit verschiedenen Primärzellen (Affennieren, menschliches Amnion, menschliche Niere und Kaninchenniere) und negativen Tests mit weiteren Mitteln wurde bestätigt, daß der untersuchte Impfstoff allen Erfordernissen der oben genannten Vorschriften entsprach

Versuch 2

Bei diesem Versuch wurde die durch Passagen In der MSN-Zellkultur erreichte Abschwächung des Rötel-Virus mit der Abschwächung verglichen, die durch Passagen in der KN-Zellkuliur erreicht wurde, wobei die letztere als Vertreter der bisher bekannten Zellen für die Abschwächung des Rötel-Virus verwendet wurde.

Der Vlrus-Starr.m To-336, der in 7 Passagen auf AüMK-Zellen weitergezüchtet worden war, wurde jeweils In 30 Passagen auf MSN-Zellen unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen weitergezüchtet. In Kontrollversuchen wurde der Stamm In 30 Passagen auf KN-Zellen unter den gleichen Bedingungen weitergezüchtet.

Die Abschwächung der Virulenz mit jeder Passage wurde für die jeweiligen Passagensysten.s wie folgt ermittelt:

Mit den jeweiligen Vlrusflüsslgkelten der 1., 5., 10., 15., 20., 25. und 30. Passage wurden Rhesus-Affen, Kaninchen und Meerschweinchen In einer Dosis von 5 χ 10^J TCIDio pro Tier geimpft. Die klinische Reaktion, der Rötel-Virus-Antlkörpertlter des tierischen Serums und die Rötel-Vlrus-Isolierung aus Halsabstrichen wurden für die geimpften Tiere ermittelt.

Klinische Reaktion: Hautausschlage und andere der impfung zugeschriebene Symptome wurden innerhalb von 3 Wochen unmittelbar anschließend an die Impfung beobachtet.

Rötel-Virus-Antlkörpertiter: Serumproben der Tiere wurden am 2ί.Τ?<? n^.ch der Impfung entnommen. Der Hämagglutlnations-Inhibitionstiter (HAI) wurde für die jeweiligen Methoden nach der Methode von Stewart und Mitarbeitern bestimmt, die in »New Eng. J. Med.«, 276,

Tabelle 1 (Stamm To-336)

554-557, 1967, beschrieben wird.

Rötel-Vlrus-Isollerung von Halsabstrichen: An 17 Tagen, beginnend am fünften Tag nach der Impfung, wurden Halsabstriche von allen Tieren gesammelt und nach der Methode von Parkman und Mitarbeitern untersucht, die in »New Eng. J. Med.«, 275, 569-574, 1966, beschrieben wird.

Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengestellt.

Geimpftes
Tier

Rhesus-Affe Kaninchen Meerschweinchen

Klinische HAI-Titer Virus-Iso- Klinische HA-Titer Virus-Iso- Klinische HAI-Titer Virus-lso-

Reaktion Iierung aus Reaktion lierung aus Reaktion lierung aus

Halsab- Halsab-

Halsabstrichen

strichen

Passage	1	512
MSN-I	1	256
MSN-5 -	1	128
MSN-10 -	1	16
MSN-15 -	<1	8
MSN-20 -	<1	8
MSN-25 -	<1	O
MSN-30 -	1	1024
PKN-I	1	256
PKN-5	1	128
PKN-IO -	1	64
PKN-15 -	1	16
PKN-20 -	1	8
PKN-25 -	¹	8
PKN-30 -		Versuch 3

Der Rötel-Virus-Siamm To-336, der über 7 Passagen auf AGMK-Zellen weltergezüchlet worden war, wurde In 20 Passagen In der MSN-Zellkultur weilergezüchtet, wobei in der dritten, sechsten und neunten Passage die

Tabelle 2

1:512 - - 1:128 1 :128 - - 1 :128 1 :64 - - 1 ; 64 · 1:16 - - 1:32 -

Grenzverdünnungsmethode auf die In Beispiel 5 beschriebene Welse angewandt wurde.

Die Abschwächung der Vliulenz des Rötel-Virus Im Laufe der Passagen wurde auf die unter Versuch 2 beschriebene Welse bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend In Tabelle 2 zusammengestellt.

256
32

Geimpltes Rhesus-Affe KanincTien

Ti" Klinische HAI-Titer Virus-Iso- Klinische HAI-Titer

Reaktion lierung aus Reaktion

Halsabstrichen

Meerschweinchen

Virus-Iso- Klinische HAI-Tiler Virus-Isolierung aus Reaktion lierung aus Halsab- Halsabstrichen strichen

Passage	1 :512
MSN-I	1 :64
MSN-5 -	<1 :8
MSN-10 -	<1 :8
MSN-15 -	<1 :8
MSN-20 -

Vergleichsversuchsbericht

Die Abschwächung von Rötel-Virus, die durch Passagen mit primären Gewebezellen von Meerschweinchen-Nieren (nachstehend als GPIi bezeichnet) erreicht wurde, 1 :256 -

1 :256
1 :8

wurde mit derjenigen verglichen, die durch Passagen mit primären Gewebezellen von Meerschweinchen-Lungen (nachstehend als GPL bezeichnet), mit primären Gewebezellen von Kaninchen-Nieren (nachstehend als RK bezeichnet), mit Gewebezellen von menschlichen Em-

bryolungen WI-37 (Dlploid-Zellen, nachstehend als WI-38 bezeichnet), mit Nierenzellen des afrikanischen Grünaffen (nachstehend als AGMK bezeichnet) und mit primären Gewebezellen von Rindernieren (nachstehend als BK bezeichnet) erhalten wurde.

Der Rötel-Virus-Stamm To-336, der 7mal mit AGMK passagiert war, wurde 30 Passagen mit GPK unter den gleichen Bedingungen unterworfen, wie sie in Beispiel I genannt werden. Als KontroMversuche wurden die beiden Stämme 30 Passagen mit GPL, PK, WI-38, AGMK und BK unter denselben Bedingungen unterworfen.

Die Verringerung der Rötel-Virulenz mit der Anzahl

der durchgeführten Passagen wurde hinsichtlich des betreffenden Passagensystems in der folgenden Welse bestimmt:

Die verschiedenen Virusflulde der 1., 5., 10.. 15.. 20.. 25. und 30. Kulturen wurden subkutan Rhesus-Affen. Kaninchen und Meerschweinchen In einer Dosis von 5 χ 10' TCID« pro Tier inokuliert. Die Rötel-Virus-Antlkörper-Titer der tierischen Sera und die Rötel-Virus-Isolierung aus dem Halsabstrich wurden an den inokulierten Tieren bestimmt. Dabei wurden die weiter oben beschriebenen Methoden durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3 (Stamm To-336)

inokuliertes Tier	Rhesus-Affe	<	1	512 +	Kaninchen	:256 -	1	32 -	Meerschweinchen	:256 -
Zellgewebe und Anzahl der Passagen	Antikörper- Virusisolie- titer (HAI) rung aus dem Hals abstrich	<	1	256 +	Antikörper- Virusisolie- titer (HAI) rung aus dem Hals abstrich		1	8	Antikörper- Virusisolie- titer (HAI) rung aus dem Hals abstrich	:32 -
GPK-I	<!	<	1	128 -			1	8	1	• Q . O
GPK-5	1		1	16 -			1	Q O	1	:8
GPK-IO	1		I	8	<		1	8	<1	:8
GPK-15	1		1	8	<		1	8	<1	:8
GPK-20		1	Q	<		1	256 -	< 1	• P -
GPK-25		1	512 +	<	1	128 -	<1	: 128 -
GPK-30		I	256 +	<	1	128 -	<1	: 128 -
GPL-I		1	256 +	1	128 -	1	: 128 -
GPL-5		1	256 +	1	64 -	1	:64 -
GPL-10		1	128 +	<1	16 -	1	:32 -
GPL-15		1	128 -	<1	8	1	:8
GPL-20		1	64 -	<1	512 -	1	:8
GPL-25	I	1028 +	1	128 -		: 128 -
GPL-30		256 +	.1	64 -		: 128 -
RK-I		128 +	1	16 -		:64 -
RK-5		64 -	1	Q _		:32 -
RK-IO		16 -	1	Q O ~~		:8
RK-15		8	1	8		:8
RK-20		8	1	512 -	<1	:8
RK-25		512 +	1	128 -	<1	:256
RK-30		512 +	1	128 -	<1	:256 - ·
WI-38-1		256 H-	1	128 -	1	: 128 -
Wl-38-5		128 H-	1	128 -		:64 -
WI-38-10		128 +		32 -		:64 -
WI-38-15		128 H-		16 -		:16 -
WI-38-20		128 -	256 -		:16 -
Wl-38-25		512 +	128 -		: 256 -
WI-38-30	256 +	128 -		: 128 -
AGMK-I	512 H-	128 -	1	: 128 -
AGMK-5	256 H-	64 -	1	: 128 -
AGMK-10	i no IZo	1	: 16 -
AGMK-15	1
AGMK-20	1

Tabelle 3 (Stamm To-336) (Fortsetzung)

inokuliertes Tier	Rhesus-AfTe	128	Virusisoüe- rung aus dem Hals abstrich	Kaninchen	16	Virusisolie rung aus dem Hals abstrich	Meerschweinchen	O O
Zellgeweb.-, und Anzahl der Passagen	Antikörper- liter (HAl)	64	-	Antikörper- titer (HAI)	16	-	Antikörper- Virusisolie- titer(HAl) rung aus dem Hals abstrich	8
AGMK-25	1	256	-	J	512	-	1	256 -
AGMK-30	1	256	+	]	.128	-	1	256 - ■"
BK-I	]	256	+	1	:256	-	1	128 -
BK-5	1	128	+	1	: 128	-	1	128 -
BK-IO	1	128	+	1	:64	-	i	:32 -,
^feBK-15	1	128	-	1	:32	-	Ί	:8
;BK-20	1	32	-	1	: 16	-	1	:8
^JBK-25	1		—	1		-	■ :i
' BK-30	1	1	1

Y *\

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Herstellen eines stark abgeschwächte Rötelv .en enthaltenden Implstoffs durch Passagleren der Röielvlren In Nieren-Gewebekulturen bei Tempeiaturen von 28 bis 36° C, Abbrechen der Passagen, wenn eine ausreichende Attenuierung erreicht Ist. und Konfektionieren der geernteten Röielvlren zu einem Lebendlmpfsiofl, dadurch gekennzeichnet, daß die Rötelviren in wenigstens IO Passagen In einer Gewebekultur, die primäre Nierenzellen des Meerschweinchens enthält, gezüchtet werden.

2 Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, dall In wenigstens einer Passage die Grenzverdünnungsmethode angewandt wird.

3. Verfahren nacli Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Weiterzüchtung in Passagen unter Einfügung von wenigstens 1 bis 5 Passagen in einer Gewebekultur erfolgt, die Embryonenzellen der Wachtel enthalt.

4. Ver^rahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm To-336 des Röteivlrus ATCC VR 553 verwendet wird.

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