DE2121237C3

DE2121237C3 - Verwendung einer Zellinie zur Züchtung von Viren

Info

Publication number: DE2121237C3
Application number: DE2121237A
Authority: DE
Inventors: Paul Tours Prunet (Frankreich)
Original assignee: Laboratoire Roger Bellon Sa Neuilly-Sur-Seine (frankreich)
Current assignee: Laboratoire Roger Bellon Sa Neuilly-Sur-Seine (frankreich)
Priority date: 1970-05-11
Filing date: 1971-04-30
Publication date: 1980-03-06
Also published as: DE2121237A1; RO62179A; BE766442A; CH532659A; FR2088038B1; NL7106379A; CS178080B2; DK129468C; GB1338043A; FR2088038A1; DE2121237B2; ES390873A1; DK129468B; HU165705B; PL88908B1

Description

Die Zelle IB-RS-2 wurde im Institut für Biologie in Sao Paulo isoliert Maria Pereira de C a s t r ο berichtete darüber dem 14. Jahreskongreß der »Tissue Culture Association« in Boston vom 28. bis 30. Mai 1963. Sie wurde von der Verfasserin in Arq. Inst Biol. Sao Paulo (37[2], 103-127,1970:34,223-241,1967;285-294,-; 295-299, -;31 [3J 63-78,1964;31 [4J 155-166,1964) beschrieben.

Diese Zellinie stammt von einer Primärkultur von Schweinenieren ab, die einen normalen weiblichen Karyotyp (Karyotvp 0) aufweisen, das aus 38 Chromosomen besteht, die wie folgt angeordnet sind: 2 G I; 2 G II; 2 G HI-I; 2 G II1-2; 14 G IV (einschließlich des Geschlecktschromosoms); 4GV; 2GVI; 4GVU; 2GyiH-l;4GyiU-2.

Die Verfasserin beschreibt ausführlich (Arq. Inst Biol. Sao Paulo 37 [2], 103-127, 1970) die verschiedenen Möglichkeiten der Neuordnung der Chromosomen, die im Laufe der Evolution der Zellinie IB-RS-2 stattfinden konnten. Es ist zu bemerken, daß alle bisher von der Verfasserin untersuchten und beschriebenen Zeüklonen durch unveränderte Gruppen 2 G I, 2 G II, 4 G V, 4 G VlI, 4 G Vlll-2 gekennzeichnet sind, während alle eine Modifikation in der Gruppe 2 G 111-2 aufweisen, die zu IG 111-2 wird.

Die Zelle IB-RS-2 kann in flüssigem Stickstoff oder im Tiefkühlschrank bei minus 80⁰C konserviert werden. Sie vermehrt sich in der Monoschicht auf üblichen Kulturmedien: Basische Hanks- oder Earle-Salzlösung, die mit Hefeextrakt, Kaseinhydrolysat oder mit La<ctalbumin angereichert ist, halbsynthetisches Vorratsmedium oder synthetisches Medium des Typs 199. Diesen üblichen Medien werden gewöhnlich 5 bis 10% Schweine-, Kalbs- oder Pferdeserum zugesetzt Die Menge der ZelHculturflüssigkeit wird auf etwa 0,4 ml/cm² Monoschichtoberfläche eingestellt

Der Zellvermehrungskoeffizient zwischen jeder Subkultur beträgt 3 bis 10, je nach Art des Kulturmediums und der Kultivierungsdauer. Es wird empfohlen, die Zahl der Subkulturen zu begrenzen, um gute Stabilität der Zellinie IB-RS-2 zu garantieren. Bei der laufenden Erzeugung werden zehn aufeinanderfolgende Subkulturen aus dem ursprünglichen Zellmaterial nicht überschritten.

Die Zelle IB-RS-2 kann in Suspension kultiviert werden. Die Zelle IB-RS-2 wurde an die Kultur in Suspension angepaßt, indem sie für lange Zeit unter den Bedingungen der bewegten und belüfteten Kultur gehalten wurde. Die Zelle hat auf diese Weise die Fähigkeit erworben, sich in Suspension zu vermehren.

Eine Clonage wurde an dieser Population vorgenommen, um die Zellen auszuwählen, die am besten an diesen Kulturtyp adaptiert waren. Es wurde festgestellt daß die an die Vermehrung in Suspension adaptierten Zellen ihre Empfindlichkeit gegenüber dem Maul- und Klauenseuche-Virus bewahrten und die Virussuspensionen, die aus den in Suspension vermehrten Zellen stammten, die gleiche Qualität wie die Virussuspensionen hatten, die aus in Monoschichten kultivierten Zellen

ίο stammten. Die Kultur in Suspension kann in jedem Fermenter durchgeführt werden, der für die Zellkultivierung verwendet wird und mit Vorrichtungen zum Rühren und zur Belüftung versehen ist Geeignet sind verschiedene Medien, die auf Aminosäuren und Vitaminen, auf Proteinhydrolysaten und Hefeextrakten basieren, z.B. das MEM-Spinner-Medium. In allen Fällen gibt man einen Zucker und ein gepuffertes physiologisches Medium zu. Bei den Kulturen in Suspension gibt man den klassierten Kulturmedien ebenso wie bei Kulturen in Monoschichten 5 bis 10% Kalbs- oder Schweineserum zu.

Von der Anmelderin wurde ferner nachgewiesen, daß die in Monoschichten vermehrte oder an die Kultur in Suspension adaptierte Zelle IB-RS-2 nicht mehr die

Fähigkeit hatTumore beim Hamster zu erzeugen:

Hamster wurden in der Jochbeintasche jeweils mit 10 χ 106,2 χ 10⁶J χ 10* und 1 χ 10⁵ lebenden Zellen geimpft Ein kleiner Knoten entwickelt sich vom fünften Tag ab nach Inoculation von 10 χ ΙΟ⁶ Zellen und

ίο verschwindet allmählich vom zehnten Tag ab. Dieser Knoten ist nach einem Monat nicht wahrnehmbar und nach zwei Monaten vollständig verschwunden. Bei Konzentrationen unter 2XlO⁶ und darunter tritt selbst nach fünf Tagen kein Knoten auf.

Andererseits wurde berichtet (S. S. B r e e s e; Archiv für die gesamte Virusforschung, 30,401 -404,1970), daß die Zelle IB-RS-2 ebenso wie die Schweinezellinie PK 15 Partikeln enthält, die Viren ähnein und einen mittleren Außendurchmesser von SO mn und einen zentralen Kern von 60 ιημ haben. Diese Partikeln ähneln den Zellen, die für die Zellinie BHK 21 beschrieben wurden.

Die Erfindung ist auf die Verwendung der Zelle IB-RS-2 für die Vermehrung bestimmter Viren gerichtet

4^r> (vgl. hierzu den Patentanspruch).

Die Forscher des Instituts für Biologie von Sao Paulo, die die Zellinie IB-RS-2 isolierten, beschrieben bereits die Empfindlichkeit der verschiedenen Klonen dieser Zellinie gegenüber dem Maul- und Klauenseuche-Virus

w (Arq. Inst Biol. Sao Paulo, 31 [3], 63-78, 1964; 31 [4], 155- 156,1964;37[2], 103-127,1970).

Es wurde gefunden, daß die Zelle für die Vermehrung des Maul- und Klauenseuche-Virus (nachstehend als MKS-Virus bezeichnet) und für die Herstellung von

v-, Virussuspensionen verwendet werden kann, die nach Inaktivierung eine Vakzine gegen den M KS-Virus darstellen, die Schweinen eine sehr gute Immunität verleiht wobei die immunogene Wirkung dieser Vakzine für das Schwein höher ist als diejenige der

t>o Vakzinen, die durch Vermehrung des Virus auf anderen heterologischen Zellen, z.B. auf der Zelle BHK21, erhalten worden sind. Außerdem verleiht diese Vakzine der Rinderspezies eine gute Immunität

Es wurde ferner gefunden, daß die Zelle IB-RS-2 für

b5 die Vermehrung des Newcastle Disease-Virus und des Schweinepest-Virus verwendet werden kann.

Der Ursprung der Zelle IB-RS-2 vom Schwein hat zur Folge, daß sie sich besonders gut für die Vermehrung

der im Patentanspruch genannten Viren eignet, die Krankheiten bei dieser Tierspezies hervorrufen. Die erhaltenen Suspensionen ermöglichen die Herstellung von Vakzinen, die für die Gattung Schwein keinerlei Gefahren einer Sensibilisierung anschließend an die Verwendung von heterologen Zellen mit sich bringen.

Es wurde nun gefunden, daß die Zelle 1B-RS-2 Träger eines abgeschwächten Schweinepestvirus im permanenten Zustand ist und daß dieses Virus kein Pathogen für das Schwein ist, sondern ihm eine hohe spezifische Immunität verleihen kann und es gegen eine virulente Probe der Schweinepest vollständig schützt Dieses abgeschwächte Virus ist in den nicht geschädigten Zellen vorhanden (intrazellulärer Virus) und kann durch Lyse der Zellen nach bekannten physikalisch-chemisehen Methoden gewonnen werden. Das Virus ist auch in der Kulturflessigkert der Zelle 1B-RS-2 vorhanden.

Zur Erfindungshöhe wird geltend gemacht: Dadurch, daß es dem Fachmann bekannt war, daß die Zellinie IB-RS-2 gegenüber dem Maul- und Klauenseuche-Virus empfindlich ist, wird dem Fachmann noch nicht nahegelegt, diese Zellinie zur Vermehrung des Maul- und Klauenseuche-Virus zu verwenden, um daraus eine Vakzine herzustellen. Es war lediglich bekannt, daß der Virus der Maul- und Klauenseuche einen cytophatischen Effekt auf die Zellinie IB-RS-2 ausübt Dies erlaubt noch keine Rückschlüsse darauf, ob der Virus gegebenenfalls auf diese Zellinie kultiviert werden könnte, insbesondere nicht in einer Monoschicht- oder Suspensionskultur. Es ist auch überraschend, daß das erhaltene Virus eine erhöhte antigene Wirkung aufweist Andererseits ist auch darauf hinzuweisen, daß der auf der aus Schweinenieren stammenden Zellinie IB-RS-2 kultivierte Virus sowohl zur Herstellung einer Vakzine für Rinder (Beispiel 2) als auch für Schweine (Beispiel 1) verwendet werden kann. Auch eine solche weitere Verwendungsmöglichkeit ist allein aufgrund des cytopathischen Effekts des Maul- und Klauenseuche-Virus für den Fachmann nicht vorhersehbar.

Das Verfahren zur Herstellung einer Vakzine gegen Maul- und Klauenseuche aus dem auf Zellen IB-RS-2 vermehrten Virus wird wie folgt durchgeführt:

Man entnimmt IB-RS-2-Zellen einem Vorrat, der durch Gefrieren auf -180° C konserviert ist, und kultiviert sie in Monoschichten in stationären Roux-Kolben oder in rollenden Kolben unter Verwendung eines klassischen Mediums, z. B. einer Hanks-Lösung, der Hefeextrakt oder Lactalbuminhydrolysat zugesetzt worden ist und die mit 5 bis 10% Schweine-, Rinderoder Pferdeserum ergänzt worden ist.

Es ist auch möglich, eine erste Kultivierung der IB-RS-2-Zellen in Monoschicht in MEM-Sprinner-Medium durchzuführen und anschließend eine Kultur in Suspension zu beimpfen. Zu diesem Zweck wird eine Zellsuspension, die 200 000 Zellen/ml enthält, in einen mit Rührer und Belüftung versehenen Reaktor gegeben. Die Kultur wird bei 37°C gehalten, während mit 300 U/min gerührt wird. Der pH-Wert wird durch Belüftung bei 7,0±0,1 gehalten. Das Kulturmedium wird alle 3 Tage gewechselt Nach einer anderen Ausführungsform wird eine bestimmte Zellkonzentration aufrechterhalten, indem alle 3 Tage mit frischem Medium verdünnt wird. Unter diesen Bedingungen ist die Zahl der Zellen, die zu Beginn 200 000/ml betrug, nach 8 Tagen auf 800 000 Zellen/ml gestiegen. Dies entspricht einer Vermehrung auf das Vierfache in 8 Tagen.

Man imDft anschließend das erhaltene Zellsubstrat

mit einem Impfvirus, der aus verunreinigter Schweinelymphe oder virulentem Blut des gleichen Tieres stammt und mehrere aufeinanderfolgende Passagen auf IB-RS-2-Zellen oder beliebigen anderen Zellen, z. B. Primärzellen der Schweineniere, in kontinuierlicher Linie gehaltenen Schweinezellen oder beliebigen heterologen Zellen, die gegenüber dem MKS-Virus empfindlich sind, z.B. BHK-Zellen und Primärkultur von Kalbsnieren, durchlaufen: hat Die Zahl der Passagen kann 4 bis 20

ι ο betragen,' jedoch werden zweckmäßig Viren nach 4 oder 5 Passagen in der Zellkultur verwendet, um die Empfehlungen des Office Internationa] des Epizooties (1969) zu beachten.

Die optimale Kultivierungsdauer des Virus in

Monoschichten wurde nach optimaler Vermehrung und Antigenität in Abhängigkeit einerseits von der Kinetik der Vermehrung und andererseits von den Ergebnissen von immunologischen Tests an Versuchstieren oder Schweinen bestimmt Die Bestimmung der optimalen Vermehrung erfolgt unter Verwendung der Infektiosität und der quantitativen serologischen Reaktionen als Kriterien. Die Infektiosität wird an Primärkulturen von Nieren des jungen Schweins oder des Rinderfötus oder der der Zelle IB-RS-2 nach der sogenannten Methode des zytopaithogenen Effekts oder durch die Fähigkeit zur Bildung: von Lysenplaques unter einer A.garschicht bestimmt Der optimale infektiöse Titer beträgt hierbei 10⁶ bis 10⁷ pro 0,1 ml. Der infektiöse Titer kann auch durch Titrierung an Meerschweinchen oder Mäusen

jo bestimmt werden.

Die serologischen Eigenschaften werden durch die sogenannte Komplimentbindungsreaktion bestimmt Die Ergebnisse werden durch die Antigenverdünnung, die 100% von zwei Komplimenteinheiten bindet, oder

ii durch die Antigenverdünnung ausgedrückt, die 50% von zwei in die Reaktion eingeführten Komplimenteinheiten bindet Die auf diese Weise gebildeten Antigene binden 100% von zwei Komplimenteinheiten bis zu einer Verdünnung von ¹A oder '/β, wobei die Verdünnung bis zu </32 betragen kann. Diese serologischen Komplimentbindungsreaktionen können am rohen Virus oder am Virus, der vorher mit aliphatischen Chlorfluorkohlenwasserstoffen oder mit halogenierten Kohlenwasserstoffen gereinigt worden ist, durchgeführt werden.

So wurde gefunden, daß die optimale Kulturdauer für die wenig adaptierten Viren (4. bis 6. Passage) gewöhnlich 16 Stunden beträgt, aber je nach den Viren zwischen 10 und 20 Stunden variieren kann. Bei Viren, die eine größere Zahl von Passagen in der Zellkultur,

z. B. 20 Passagen, durchlaufen haben, ist die Kulturdauer gewöhnlich verkürzt. Sie beträgt hierbei etwa 8 Stunden und kann je nach den Viren 6 bis 12 Stunden betragen.

Nach den Ergebnissen von immunologischen Tests wurde ferner gefunden, daß die Qualität des gebildeten Virus von der Zahl der lebenden Zellen im Kultursubstrat abhängt. Das Optimum beträgt 300 000 bis 600 000 Zellen/cm² Monoschicht. Dies wird nach 3 oder 4 Kultivicrungstagen bei einer Ausgangssuspension erreicht die 40 000 bis 60 000 Zellen/cm² enthält.

w) Nach der Gewinnung werden die Virussuspensionen von Zelliriimmern befreit und bakteriologisch nach Filtrationsverfahren oder durch chemische Behandlungen, z. B. Behandlung mit Chloroform oder Trichlorethylen, sterilisiert.

h^r> Nach der Sterilisation werden die Zellsuspensionen mit 0,02 bis 0,03 Gew.-% reinem Formaldehyd bei einer Temperatur von 36°C inaktiviert. Die Inaktivierung kann auch mit Glycidaldehyd in einer Menge von

0,005% bei einer Temperatur von 25° C für 16 Stunden oder mit Acetyläthylenimin erfolgen. Die Inaktivierungsverfahren werden in der Veröffentlichung von M. D u ra ηd (BuILOff. Int Epiz, 1968,6Ü[3-4J429-465) beschrieben.

Der inaktivierte Virus wird anschließend in einem Öl als Hilfsstoff emulgiert, um eine Wasser-in-öl-Emulsion oder eine Öl-in-Wasser-Emulsion oder eine gemischte öl-in-Wasser-in-öl-Emulsion zu bilden.

Die Emulsionen werden auf ihre Beständigkeit gegen Zentrifugierung, ihren spezifischen Widerstand, durch mikroskopische Beobachtung, ihre Diffusionseigenschaften in Wasser und ihre Fließzeit über eine Nadel von bestimmtem Durchmesser geprüft

Die Unschädlichkeit der Vakzine wird anschließend an der Schweinespezies überprüft.

Außerdem wird die Antigenität der Vakzine an der gleichen Spezies nach Normen bestimmt, die vom Office International des Epizooties veröffentlicht worden sind (J. Poul. Bull. Off. Int Epiz. 1964, 61, 1233, und M. Giraud, Bull. Off. Int Epiz. 1969,71,285 -306).

25

Beispiel 1

Herstellung einer Vakzine gegen Maul- und Klauenseuche,

die der Schweinespezies ausgezeichnete Immunität verleiht

Nach Trypsinbehandlung gewonnene IB-RS-2-Zellen werden in einem Glyzerinmedium oder einem Medium, dem Dimethylsulfoxyd zugesetzt worden ist in einer Menge von 1 bis 2 χ 10⁶ Zellen/ml suspendiert Nach Verteilung auf verschlossene Ampullen werden diese Zellen mit Hilfe einer Tiefkühlvorrichtung, die eine gleichmäßige Temperatursenkung gewährleistet eingefroren und dann in flüssigem Stickstoff oder im Tiefkühlschrank bei - 40° C gelagert

Zur Verwendung werden eine oder mehrere Ampullen auf dem Wasserbad bei 37° C aufgetaut. Die Zellen werden im Kulturmedium in einer Menge von 80 000/ml suspendiert Das verwendete Kulturmedium besteht aus einer Hanks-Lösung (oder Earle-Lösung), der 0,5% Lactalbuminhydrolysat 0,1% Hefeextrakt 0,1% Glucose, 5 bis 10% Schweineserum (oder Kalbs- oder Pferdeserum) und 0,1% Natriumdicarbonat zugesetzt worden ist Trypsin wird diesem Medium nach Verdünnung auf 0,25% in einer gepuffe^rten Kochsalzlösung, die frei von Calcium- und Magnesiumsalzen ist zugesetzt

Die Zellsuspension mit 80 000 Zellen/ml im Nährmedium wird auf feststehende Kolben oder auf rollende Kolben in einer Menge von 0,4 ml/cm² Oberfläche verteilt. Die Menge der Zellen, die pro cm² verfügbarer Oberfläche inoculiert worden sind, beträgt somit etwa 30 000. Die auf diese Weise geimpften Oberflächen werden 3 bis 4 Tage im Wärmeschrank gehalten, wobei die Kolben einmal in 5 Minuten gedreht werden, um die Ausbildung eines geschlossenen und dichten Fellrasens zu ermöglichen. Die Zahl der Zellen erreicht hierbei t>o 500 000 bis 600 OOO/cro* Oberfläche.

Das Nährmedium der Zellkultur wird entfernt und durch eine 2,5%ige Lösung von Trypsin in einer gepufferten Salzlösung ersetzt. Die enzymatische Behandlung wird 8 Stunden bei 37° C vorgenommen. Die Zellsuspension im trypsinhaltigen Medium wird mit dem Nährmedium, deni Serum zugesetzt worden ist, in einer solchen Menge verdünnt, daß erneut eine Zellsuspension mit 80 000 lebensfähigen Zellen pro ml erhalten wird.

In der gleichen Weise werden mehrere Subkulturen in einer solchen Zahl durchgeführt, daß die Vennehrung der Zellmasse genügt, um eine Produktionsmenge zu gewährleisten. Die maximale Zahl der Subkulturen beträgt hierbei 10.

Sobald die erhaltene Zelloberfläcne genügend ausgebildet ist, wird mit der Viruskultur begonnen. Das Nährmedium wird entfernt und durch ein gleiches Medium ersetzt das jedoch kein Serum enthält und mit dem Impfvirus versetzt worden ist Die für die Vermehrung des Virus verwendete Menge des Kulturmediums beträgt 0,1 ml/cm* Oberfläche. Das Virusinoculum wird so verdünnt, daß die Zahl der infektiösen Einheiten pro ml 10-⁵bis 10~⁶ beträgt

Die Züchtung des Virus wird 12 Stunden durchgeführt Nach dieser Zeit ist der gesamte Zellrasen durch das Virus zerstört, und die Zellen sind lysiert Die Virussuspension wird unmittelbar auf +4"C gekühlt Diese Virussuspension wird zentrifugiert und filtriert, um Zellreste zu entfernen, und dann mit Formaldehyd, Glycidaldehyd oder Acetyläthylenimin inaktiviert

Nach Oberprüfung der Inaktivierung wird diese Virussuspension in einem aus Mineralöl und Emulgatoren bestehenden Gemisch emulgiert, um die Vakzine zu bilden.

Es ist selbstverständlich auch möglich, in einer gleichen Vakzine mehrere Virussuspensionen von verschiedenem Typ zu vereinigen und beispielsweise eine dreiwertige Vakzine zu bilden. Einige Beispiele der Zusammensetzung von dreiwertiger Vakzine sind nachstehend genannt:

Präparat Nr. 1

Wasser-in-ÖI-Emulsion von mit Glycidaldehyd inaktivierten Viren

Virussuspension Typ 0	100 ml
Virussuspension Typ A	100 ml
Virussuspension Typ C	100 ml
Glycidaldehyd	0,015 g
Vaselinöl	270 ml
Anhydrohexitoleat	30 ml
Präparat Nr. 2
Wasser-in-öl-Suspension von mit
Formaldehyd inaktivierten Viren
Virussuspension Typ 0	100 ml
Virussuspension Typ A	100 ml
Virussuspension Typ C	100 ml
Formaldehyd	0,06 g
Vaselinöl	270 ml
Anhydrohexitoleat	30 ml

Präparat Nr. 3

Gemischte Emulsion von mit Glycidaldehyd inaktivierten Viren

Virussuspension Typ 0 100 ml Virussuspension Typ A 100 ml Virussuspension Ty ρ C 100 ml Glycidaldehyd 0,015 g Vaselinöl 262,5 ml

Anhydrohexitoleat 30 ml Spezialgemisch von

Polyglykolether und Fettalkohol 74 g

Präparat Nr.

Öl-in-Wasser-Emulsion von mit Glycidaldehyd inaktivierten Viren Virussuspension Typ Virussuspension Typ A Virussuspension Typ C Glycidaldehyd Vaselinöl Spezialgemisch von Polyglykolether und Fettalkohol

100 ml 100 ml 100 ml 0,015 g 270 m!

30 ml

Bei allen diesen Präparaten beträgt die übliche Dosierung zur Gewährleistung der Immunisierung eines Jungschweins von 30 kg 3 m! dreiwertige Vakzine. Diese Dosierung entspricht 2 000 000 bis 4 000 infizierten Zellen pro Dosis des monovalenten Impfstoffes.

In Tabelle I sind die physikalischen Eigenschaften von zwei Vakzinen 1 und 2, nämlich erstens einer gemischten Emulsion und zweitens einer Wasser-in-öl-Emulsion, und die bei den mit diesen Vakzinen intramuskulär oder subkutan behandelten Tieren festgestellten Reaktionen genannt.

In Tabelle II sind die Ergebnisse von Antigen-Aktivitätstests dreier Vakzinen 1 und 2 (monovalent) und 3 (trivalent) angegeben.

ίο Die Ergebnisse in diesen Tabellen zeigen, daß die verwendete Emuisionsart (Wasser-in-Öl- oder gemischte Emulsion) einen großen Einfluß auf die Intensität der örtlichen Reaktionen (die Verträglichkeit der gemischten Emulsion ist größer als die der Wasser-in-Öl-Emulsion), aber keinen nennenswerten Einfluß auf die Intensität der Immunität hat.

Tabelle I

Makrosko	ρ H-Wert	Spezifi	Tropfen	Viskosität in	Verträglichkeit	Verträglichkeit
pisches		scher	auf	der Injektions	bei Intra	bei subkutaner
Aussehen		Wider	Wasser	spritze mit	muskulärer	Injektion
		stand		Nadel 30/15	Injektion
				Gewicht 100 g

Vakzine 1 Typ C gemischte Emulsion

Vakzine 2 Typ C Wasser-in-ÖI-Ernulsion

Tabelle II

homogene Flüssigkeit

8,18

homogen, viskos

7,78

Durchflußzeit kein öliges lokalisiertes
für 10 ml: Granulat Ödem, wird
32 Sekunden 1 Monat nach in den folgender Impfung den Tagen
keine Ent- resorbiert
zündungserscheinungen

breitet sich Durchflußzeit Entzündungs- lokalisiertes,

nicht aus, für 10ml: reaktionen mit jedoch starkes

nicht 15 Minuten »huilome« Ödem, das

mischbar oder langer 1 Monat nach unvollständig

der Impfung resorbiert wird

153 Ohm breitet cm sich aus,

sehr leicht
mischbar

12.500 Ohm cm

Volumen Immunisierungs- Versuchs

dauer dosis(⁺)

Versuchsdauer Ergebnisse

primäre Generalisie-

Lesionen rungen

Vakzine 1 monovalent

Vakzine 2 monovalent

Vakzine 3 trivalent

1 ml

ml

3 ml

28 Tage	Virus C 10.000 ID 50 (Schwein)
28 Tage	Virus C 10.000 ID 50 (Schwein)
28 Tage	Virus 0 10.000 ID 50 (Schwein)
	Virus A 10.000 ID 50 (Schwein)
	Virus C 10.000 ID 50 (Schwein)

8 Tage

7/9**)

2/9

1/5

2/5

5/9

0/9*)

0/9

0/5

0/5

0/9

*) Verhältnis der Zahl der Tiere mit generalisierten Lesionen zur Zahl der Versuchstiere.

**) Verhältnis der Zahl der Tiere mit primären Lesionen an der Impfstelle des Versuchsvirus zur Zahl der Versuchstiere. (⁺) Die Versuchsdosis ist in ID50 (Schwein), d.h. in infektiösen 50%-Dosen für das Schwein ausgedrückt

Die Zelle IB-RS-2 stellt somit ein Substrat dar, das die Züchtung des Virus der Maul- und Klauenseuche und die Gewinnung von Vakzinen gegen Maul- und Klauenseuche mit ausgezeichnetem Immunsierungsvermögen für Schweine ermöglicht. Ferner wurde gezeigt, daß die in dieser Weise hergestellten Vakzinen den mit anderen Zellen, z. B. der BHK-ZeIIe, erhaltenen Vakzinen überlegen sind. Zwei Vakzinen wurden aus einem gleichen Virus-Inokulum hergestellt, und zwar eine Vakzine aus dem auf der BHK-ZeIIe in Monoschicht vermehrten Virus und die andere aus dem auf der IB-RS-2-Zelle in Monoschicht vermehrten Virus. Bei gleicher viraler Qualität, bestimmt nach den oben beschriebenen Kriterien, hat die Vakzine, die aus dem Virus hergestellt wurde, der auf IB-RS-2-Zellen gezüchtet wurde, eine höhere Antigenität als die Vakzine, die aus dem auf BHK-Zellen gezüchteten Virus hergestellt worden war, wie die Ergebnisse in der folgenden Tabelle zeigen.

nen, bakteriologisch durch Filtration oder auf chemischem Weg sterilisiert und mit 0,005% Glycidaldehyd, das bei 25° C 16 Stunden zur Einwirkung gebracht wird, inaktiviert. Das auf diese Weise inaktivierte Virus wird mit Immunitätsadjuvantien gemischt, nämlich 2%igem Aluminiumhydroxyd (ausgedrückt in AI2O3) in einer Menge von 25 Vol.-°/o und Saponin(0,06 g/100 ml).

Die Vakzine, die mit einem Volumen von 5 ml pro trivalente Dosis zusammengestellt wird, wird 15 Rindern mit einem Volumen von 1,25 ml entsprechend ¹A der von der Anmelderin empfohlenen Dosis für Rinder verabreicht. Mehr als 50% der Rinder werden gegen Genralisierung geschützt, die durch den Virulenzversuch mit Hilfe von 10 000 infektiösen 50%-Dosen jedes der drei europäischen MKS-Viren 0. A und C hervorgerufen wird:

Typ 0: 3 von 5 Tieren geschützt
Typ A: 5 von 5 Tieren geschützt
Typ C: 5 von 5 Tieren geschützt

Auf BHK ge- Auf IB-RS-2
züchtetes gezüchtetes
Virus Virus

1/16

Komplimentbindungs- 1/32
vermögen (100% von 2
Komplimenteinheiten)

Infektiösität, 50%iger 10^7li
zytopathogener Effekt
für die IB-RS-2-Zelle

Antigenität beim Schwein etwa 0,5 ml <0,17ml

10"'

Antigene Dosis, die
50%igen gewährleistet
(Virus Typ A)

2 Tiere von
5 mit 0,5 ml
Antigen
geschützt

5 Tiere von
5 mit 0,17 ml Antigen
geschützt

Beispiel 2 Beispiel 3

Herstellung einer Vakzine
gegen das Newcastle Disease-Virus

Von der Anmelderin wurde nachgewiesen, daß die Zelle IB-RS-2 besonders empfindlich gegenüber dem Newcastle Disease-Virus ist. Eine Stammhaltung des Virus, die von der Allantoisflüssigkeit des bebrüteten Hühnereies herrührte, wird auf ein Brutei, auf die Zelle IB-RS-2 und auf die Zelle BHK 21 übertragen. Für jede Verdünnung wurde die Anwesenheit des Virus durch Ermittlung des zytopathogenen Effekts für die Zellen und durch das Hämagglutinationsvermögen der Flüssigkeiten der Zellkultur und der Allantoisflüssigkeit bestimmt Die Infektiösität wurde nach der Methode der kumolierten Summen gemäß Reed und Munch berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt

Titer bestimmt durch

Herstellung einer Vakzine

gegen Maul- und Klauenseuche,

die gute Immunität bei Rindern verleiht

Die Zelle IB-RS-2 wird in Monoschicht in gerollten 1-1-Ko'ben kultiviert. Das Zeilinokulum kann aus 100 000 bis 300 000 Zellen/ml bestehen. Das in einer Menge von 100 bis 200 ml/Kolben verwendete Kulturmedium besteht aus einer Hanks-Salzlösung, der Z$% Lactalbuminhydrolysat, 0,5% Hefeextrakt und 5% Kalbsserum zugesetzt worden sind Die Zellkultur entwickelt sich innerhalb von 4 bis 5 Tagen.

Die Kulturflüssigkeit wird entfernt und durch 50 ml Kulturflüssigkeit ersetzt, die die gleiche Zusammensetzung hat, jedoA das gleiche Impfvirus enthält Das Impfvirus wird aus dem von Rindern stammenden Virus der Maul- und Klauenseuche durch Züchtung in mehreren Subkulturen auf der Zelle IB-RS-2 hergestellt Die Zahl der Virus-Subkulturen kann 2 bis 20 betragen.

Nach 16- bis 24stündiger Züchtung des Virus ist der Zellrasen vollständig zerstört Das Virus wird gewonzytopathogenen
Effekt

Hämagglutinationsvermögen

BHK

IB-RS-2

Brutei

_!07.«3 _1O8.S

ίο⁷-⁸³

ίο⁸·⁵ ίο⁸·⁶

Ein virulenter Virus in Form der Allantoisflüssigkeit des infizierten bebrüteten Hühnereies wurde auf Monoschichten von IB-RS-2-Zellen gezüchtet, um das

bo für die Herstellung der inaktivierten Vakzine bestimmte Antigen zu gewinnen. Von der Anmelderin wurde zunächst gefunden, daß das Virus-Inokulum (infektiöse Allantoisflüssigkeit) in geeigneter Weise verdünnt werden mußte, um die Autointerferenzerscheinungen zu vermeiden und eine optimale Vermehrung des Virus zu erzielen. Die Werte in der folgenden Tabelle zeigen, daß die Verdünnung von ΙΟ-⁴ sehr günstig für die Erzielung einer hohen Vermehrungsgeschwindigkeit des Virus ist

Verdünnung des Virus im Inokulum

Inokulum 48 Stunden bei 37"C gehalten

50%-LetalefTekt beim Brutei

50%iger zytopathogener Effekt bei der Zelle BHK 21

Hämagglutinationsvermögen

Nach 48 Stunden gewonnene virulente Flüssigkeit IB-RS-2

50% LetalelTekt beim Brutei

50%iger zytopathogener Effekt bei der Zelle BHK 21

Hämaggl uti nationsvermögen

	10"²	12	ΙΟ'⁴
ΙΟ"'	IO⁵·⁸	ΙΟ"³	IO³
ίο⁷·⁵	ίο⁴·²	nicht bestimmt	IO'·⁸
ίο⁵·⁵	1/128	IO³	<l/2
1/256	10^7S	1/4	IO⁷·⁹
IO⁷¹	IO⁶	nicht bestimmt	ίο⁶·⁵
ίο⁵·¹	1/128	nicht bestimmt	1/128
1/256	1/128

Rotierende Kolben, die eine Monoschicht der Zellen IB-RS-2 trugen, wurden mit 50 ml Kulturmedium geimpft, das als Impfvirus eine auf IO-⁴ verdünnte virulente Allantoisflüssigkeit trug, die einen infektiösen Titer von IO⁴·⁵ für das Brutei hatte.

Mit dem gleichen Virus, der auf IO-⁴ in einer Kulturflüssigkeit verdünnt war, wurde ferner eine Reihe von 13 Tage bebrüteten Eiern über die Allantoishöhle infiziert. Nach 48 Stunden wurden die beiden virulenten Flüssigkeiten gewonnen und in den oben beschriebenen Tests verglichen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt

	Allantois	Kulturflüssig-
	flüssigkeit	keit IB-RS-2
Hämaggl uti nations	1/8000	1/500
vermögen
50%iger zytopathogener	10^7S	ίο⁷·⁵
Effekt für die Zellen
IB-RS-2
50%-Letaleffekt für das	IO⁸·⁵
Brutei

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Zelle IB-RS-2 ein ausgezeichnetes Substrat für die Vermehrung des Newcastle Disease-Virus darstellt und daß ohne vorherige Adaption bei der ersten Kultur mit dieser Linie eine virulente Flüssigkeit erhalten werden kann, die die gleiche Infektiosität wie eine Allantoisflüssigkeit hat

Die in dieser WeUe erhaltenen beiden Viruspräparate wurden mit Ji-Propiolacton inaktiviert, worauf 2%iges Aluminiumhydroxyd (ausgedrückt als Al₂O₃) in einer Menge von 50 VoL-% zugesetzt wurde. Hierbei wurden zwei Vakzinen erhalten, mit denen Gruppen von jungen Hühnern geimpft wurden, denen jeweils 1 ml subkutan injiziert wurde. 3 Wochen später wurden die Tiere in Gruppen zu zehn mit verschiedenen Verdünnungen des Newcastle Disease-Virus (von 10-' bis IO-⁴) infiziert In beiden Fällen, d.h. bei beiden Vakzinen, wurden sämtliche Tiere geschützt, während die Vergleichstiere durch die Infektion eingingen.

Es wurde ferner festgestellt, daß es möglich ist, die Zelle IB-RS-2 für die Züchtung von abgeschwächten Newcastle Disease-Viren, ζ. B. des Virus Hitchner Bi, zu verwenden. In diesem Fall war der zytopathogene Effekt geringer, aber der durch Ermittlung des

Hämagglutinationsvermögens berechnete Titer erheblich:

Zelle IB-RS-2 = Infektiosität 10⁴»
Zelle BHK 21 = Infektiosität 10·

Beispiel 4

Verwendung der Kühlflüssigkeit

der Zelle IB-RS-2 als
Lebendvakzine gegen die Schweinepest

Eine Gruppe von 10 Schweben erhält 5 ml der in Beispiel 1 beschriebenen Flüssigkeit, die zur Züchtung der Zelle IB-RS-2 in Monoschicht diente. Während einer Beobachtungszeit von 25 Tagen zeigte keines der Tiere einen Temperaturanstieg. Nach dieser Zeit erhielten die Schweine 1 ml virulentes Schweineblut, das während der Virämie entnommen und auf Vio verdünnt

J5 worden war. Nach der Infizierung wurden die Tiere 15 Tage unter Beobachtung gehalten. Keines der Tiere zeigte eine wesentliche Temperaturerhöhung oder ein Anzeichen der Schweinepest.

B e i s ρ i e 1 5

Verwendung von lebenden lB-RS-2-ZeIlen
als Lebendvakzine gegen Schweinepest

10 Tiere werden unter den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen mit 10 χ 10* lebenden IB-RS-2-Zellen pro Tier geimpft. Die Verträglichkeit war vollkommen.

Während der 24 Tage der Immunisierung trat kein wesentlicher Temperaturanstieg auf. Der Schutz gegen eine auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise

so vorgenommene Virusinfektion war vollständig.

Beispiel 6

Verwendung von lysierten lB-RS-2-Zellen
als Lebendvakzine gegen Schweinepest

Ein durch Gefrieren und Auftauen von IB-RS-2-ZeI-len erhaltenes Lysat in Mischung mit Kulturflüssigkeit wird gefriergetrocknet Das erhaltene Produkt stellt eine Lebendvakzine gegen Schweinepest dar. Zur Bestimmung des Schutztiters und der Verträglichkeit dieser Vakzine werden Gruppen von je 5 Schweinen mit dieser Vakzine in Verdünnungen von 10-' bis 10~^s geimpft Während der Immunisierungsdauer zeigt keines der Tiere einen wesentlichen Temperaturanstieg.

Anschließend wurde den Tieren 1 ml virulentes Blut injiziert Das Schutzvermögen wird mit 10~⁴ berechnet Die Vakzine enthält somit IO⁴ immunisierende Partikel.

Claims

Patentanspruch:

Verwendung der in Arq. Inst BioL Sao Paulo (37 [2], 103-127,1970;3*.223-241,1967;285-294, -; 295-299, -; 31 [3], 63-78, 1964; 31 [4], 155-166, 1964) beschriebenen IB-RS-2-ZeUinie zur Züchtung von Viren, die für die Herstellung einer inaktivierten Vakzine gegen Maul- und Klauenseuche, einer inaktivierten Vakzine gegen den Newcastle-Desease-Virus, einer abgeschwächten Lebendvakzine gegen die Newcastle Desease und einer abgeschwächten Lebendvakzine gegen die Schweinepest bestimmt sind.