Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionek przeciwko pryszczycy zwlaszcza dla swin..Znany jest sposób wytwarzania szczepionki prze¬ ciwko pryszczycy z wirusa, namnozonego na ko¬ mórkach BHK. Jednakze szczepionka namnozona na komórkach BHK nie wykazuje dostatecznego dzialania antygenowego.Celem wynalazku bylo wytworzenie szczepionki o lepszej odpornosci i dzialaniu antygenowym.Cel ten osiagnieto, stosujac do wytwarzania szczepionek komórki, wyizolowanej w Instytucie Biologii w Rio de Janeiro, oznaczonej poczatkowo symbolem ibr, a nastepnie symbolem ib-RS-2/w Instytucie BioloigU w Sao Paulo.Komórka iB-RS-2, wyizolowana w Instytucie Btók&ii w Sao Paulo i opisana, w pracy Marii JBeiwira 4a Castro, zostala przedstawiona na 14 do- roomym kougrsAie Tissua Culturt Association w Boston*? <2»—39 maja 1993). Powyzsza komórka zostala opisana przez autorke równiej w Arg, Inat.BioL £ao Paulo «7 (2), IW—107, 1970; a*, 223—341, 1087; W&-W4; m~m 31 (3), 63—7$, i^H; 31 (4), 155—166, 1964.Komórka IB-3S*2 zostala wyizolowana z kul¬ tury tkanki narki samicy swini normalnego kario- typu sfcariotyp 0) o 38 chromosomach, zgrupowa¬ nych, jak nattepuj*: % Q I; 2 G II, 2 G JIM, % G III-2, 14 G IV (lacznie z chromosomami plciowy- mi), 4 G V, 2 G VI, 4 G VII, 2 G VIII-1, 4, G VIII-2.Autorka szczególowo opisala (Arg. Jnst. Eiol.Sao. Paulo 37 <2), 103—127, 1970) rózne moZ»woSci przegrupowania chromosomów, mogace zajsc w trakcie ewolucji linii komórkowej IB-dJS-2.Wszystkie badane i dotychczas opisane przez autorke klony komórkowe charakteryzuja sie ufcla- dem grup 20 I, 2 O II, 4 O V, 4 G VII, 4 G VIII-2, a wiec wszystkie one przedstawiaja mody¬ fikacje w zakresie grupy 2 G III-I, która staje sie 1 G III-2.Wskutek róznych przegrupowan w badanych klp- naeh komórkowych liczba chromosomów wahala sie miedzy 97 a 38.Powyzsza charakterystyka chromosomowa odno¬ si sie do klonów opisanych i aiktualnie stosowa¬ nych. Nie wyklucza sie jednakowoz mozliwosci stosowania innych i posiadajacych inny uklad chromosomów klonów komórki IB-RS-2.Komórke IB-H3*2 mozna konserwowac w ciek¬ lym azocie w temperaturze — 8-O^C. iKomóifca roz¬ mnaza sie jednakowo na zwyklych pozywkach: na podstawowym zestawie soli Hanksa lub Earlago z dodatkiem ekstraktu drozdzowego, hydrolizatu kazainy lub albuminy mleka, na pozywce pólsyn- tetycznej Stockera lub syntetycznej typu 199. Do powyzszych pozywek dodaje sie w ilosci 8-^10^/t o- socza swini, cielecia lub konia. Poiywfce stosuje sie w ilosci '0,4 ml/cm* powierzchni hodowli. Wspól- 88 9082 czynnik namnazania komórek wynosi 3—10, zalez¬ nie od rodzaju pozywki i czasu prowadzenia ho¬ dowli.W celu utrzymania stabilnosci szczepu komór¬ kowego IB-RS-2, pozadane jest ograniczenie licz¬ by subkultur. W biezacej produkcji liczba subkul¬ tur, wyprowadzonych z pierwotnych komórek, nie powinna przekraczac 10.Komórka IB-RS-2 moze byc hodowana w za¬ wiesinie. Dostosowanie komórki do hodowli w tych warunkach uzyskano w wyniku wystawienia jej na dlugotrwale mieszanie i napowietrzanie. Z populacji wyselekcjonowano klon najlepiej przy¬ stosowany do tego rodzaju warunków hodowli.Stwierdzono, ze klony komórek, przystosowanych do hodowli w zawiesinie, zachowuja wrazliwosc na wirusa pryszczycy, a zawiesiny wirusowe z ko¬ mórek, hodowanych w zawiesinie, wykazuja te sama jakosc, co pochodzace z komórek, otrzyma¬ nych w (hodowli jednowarstwowej. Hodowle w za¬ wiesinie mozna prowadzic w jakimkolwiek fer- mentorze, dostosowanym do hodowli tkankowej, wyposazonym w uklad mieszania i napowietrza¬ nia. Stosowac mozna rózne pozywki na bazie ami¬ nokwasów i witamin, na bazie hydrolizatów bial¬ kowych i wyciagów drozdzowych takie, jak np. pozywka MEM-Spinner. We wszystkich przypad¬ kach do pozywki dodaje sie cukier i buforowany roztwór fizjologiczny. Podobnie, jak w przypadku hodowli jednowarstwowych, równiez w przypad¬ ku hodowli w zawiesinie, do pozywki klasycz¬ nej wprowadza sie 5—10°/o dodatek osocza cie¬ lecia lub swini.Komórka IB-RS-2', rozmnazana w hodowli jed¬ nowarstwowej lub zaadaptowana do hodowli w zawiesinie, nie wykazuje w stosunku do chomi¬ ka wlasnosci nowotworowych. Badania przepro¬ wadzono, jak nastepuje: Chomiki zaszczepiono w fald policzkowy zywy¬ mi komórkami, w ilosci odpowiednio 10X106, 2X10f i 1X105. W przypadku zaszczepienia ko¬ mórkami w ilosci 10Xl O8 piatego dnia pojawil sie maly guzek zapalny, który stopniowo zmniejszal sie i dziesiatego dnia calkowicie zanikl. Przy in- jekcji ilosci mniejszych, niz 2X106, nie stwier¬ dzono pojawienia sie guzka.Z literatury (S. S. Bresse; Archiv. fiir die Ge- samte Viruforsfchung 30, 401—40£, 1070) wiadomo, ze IB-RS-2, jak równiez linia komórki PK-15 swini, zawieraja czasteczki o srednicy zewnetrz¬ nej 90 m i jadrze 60 m, przypominajace wirusa.Czasteczki te przypominaja opisane dla linii ko¬ mórkowej BHK-21.Komórka IB-RS-2 moze byc stosowana do na- mnazania wirusa pryszczycy i do wytwarzania za¬ wiesin wirusowych, które po inaktywacji stano¬ wia szczepionke przeciwpryszczycowa, nadajaca zaszczepionym nia swiniom bardzo dobra odpor¬ nosc. Odpornosc ta jest wyzsza, niz uzyskiwana przy stosowaniu szczepionek, otrzymanych w dro¬ dze hodowli wirusa na innych komórkach hete- rologicznych takich, jak BHK-21. Rzeczona szcze¬ pionka nadaje dobra odpornosc równiez bydlu rogatemu.Komórka IB-RS-2 moze byc stosowana do ho- 908 4 dowli wirusa rzekomego pomoru drobiu i wiiusa pomoru swin. Powyzsza linia komórkowa jest wrazliwa równiez na wirusa grypy rzekomej; obecnosc tego wirusa zostala wykryta w drodze hemosorpcji. Na tej samej zasadzie, co inne linie komórkowe i pierwotne kultury tkankowe ner¬ ki swini, IBS-RS-2 moze stanowic substrat do namnazania wirusa i zakazania przewodu pokar¬ mowego.L0 Wirusy, mogace byc namnazane na linii komór¬ kowej IB-RS-2, wzglednie na pierwotnej hodowli tkanki nerki swinskiej, nie ograniczaja sie do wyzej wymienionych.Pochodzenie komórki IB-RS-2 sprawia, ze na- L5 daje sie ona szczególnie do namnazania wszelkich wirusów chorób swin. Uzyskane z hodowli tkan¬ kowej IB-RS-2 zawiesiny wirusów nie stwarzaja dla swin niebezpieczenstwa objawów uczulenio¬ wych, mogacych wystapic w przypadku stosowa- nia komórek heterologicznych.Komórka IB-RS-2 jest stalym nosicielem osla¬ bionego wirusa pomoru swin. Powyzszy wirus nie jest chorobotwórczy w stosunku do swini, lecz moze jej nadawac zwiekszona odpornosc na za- kazenie pomorem. Oslabiony wirus wystepuje w komórce nietknietej i moze byc uwolniony w dro¬ dze lizy komórkowej, przeprowadzonej znanymi sposobami fizyko-chemicznymi. Wirus ten wyste¬ puje równiez w plynie hodowli komórki IB-RS-2.J0 Wytwarzanie szczepionki przeciwko pryszczycy wedlug wynalazku z uzyciem wirusa, hodowane¬ go na komórkach IB-RS-2, przeprowadza sie w nastepujacy sposób: Z zamrozonych w temperaturze —180°C, zakon- serwowanych komórek pobiera sie material do hodowli jednowarstwowej — w blokach typu Roux lub w naczyniach obrotowych, na pozywce klasycznej, np. podstawowym zestawie soli Hank- sa z dodatkiem wyciagu drozdzowego lub hydro- 40 lizatu albuminy mleka z 5—10°/o dodatkiem oso¬ cza swinskiego, krowiego lub konskiego. Mozna równiez pierwotna kulture komórki IB-RS-2 pro¬ wadzic jednowarstwowo, na pozywce MEM-Spi- ner, a nastepnie kulture te stosowac jako posiew 45 hodowli w zawiesinie. W tym celu zawiesine ko¬ mórkowa o zawartosci 200 000 komórek w ml wprowadza sie do reaktora, wyposazonego w uklad mieszania i napowietrzania. Hodowle pro¬ wadzi sie w temperaturze 37°C, mieszajac z szyb- 50 koscia 300 obrotów na minute i utrzymujac pH w drodze napowietrzania na poziomie 7,0 ± 0,1.Hodowle prowadzi sie w ciagu 3 dni. W innej wersji okreslone stezenie komórek utrzymuje sie, rozcienczajac hodowle co 3 dni nowa pozywka. 55 W tych warunkach liczba komórek w ciagu 8 dni wzrasta czterokrotnie, z 200 000/ml do 800 000/ml.Substrat komórkowy zakaza sie inokulum wi¬ rusa, pochodzacego z limfy lub krwi zakazonej swini. Wirusa podaje sie kolejnym pasazom na ^ komórkach IB-RS-2. Liczba pasazy wynosic moze od 4 do 20.Badajac optimum rozmnazania i funkcji anty¬ genowej kinetyki rozmnazania i testów immuno¬ logicznych na zwierzetach laboratoryjnych lub 65 swiniach, okreslono optymalny czas prowadzenia88 908 6 hodowli jednowarstwowej. Optimum rozmnaza¬ nia okreslono, stosujac jako kryterium zdolnosc zakazania i ilosciowe reakcje serologiczne. Zdol¬ nosc zakazania okreslono na pierwotnych kultu¬ rach tkankowych nerki prosiecia, plodu krowie¬ go lub komórki IB-RS-2, sposobem okreslanym jako efekt cytopatologiczny lub sklonnosc do two¬ rzenia stref lizy na warstwie agaru. Optymalne miano infekcyjne wynosi 10«—1070,1 ml. Miano infekcyjne mozna oznaczyc równiez na swinkach morskich lub myszach.Moc serologiczna wyraza sie rozcienczeniem, przy którym osiaga sie 100% lub 50°/o aglutynacji antygenu przez 2 jednostki infekcyjne wirusa, wprowadzonego do reakcji. Antygen otrzymany w wyzej opisany sposób aglutynuje w 100e/o 2 jednostki infekcyjne wirusa przy rozcienczeniach 1:4, 1:8, a nawet 1:32. Oznaczenie mocy serolo¬ gicznej moze byc wykonane na wirusie surowym lub na wirusie uprzednio oczyszczonym freonem lub chlorowcoweglowodorami.Stwierdzono, ze optymalny czas hodowli wirusa slabo zaadaptowanego (4 lub 6 pasaz) wynosi zwykle 16 godzin, lecz moze wahac sie w grani¬ cach 10—20 godzin. W przypadku wirusów, pod¬ danych wiekszej liczbie np. 20 pasazy na hodow¬ li tkankowej, optymalny czas hodowli skraca sie do okolo 8 godzin, wahajac sie zaleznie od rodza¬ ju wirusa, miedzy 6 a 12 godzinami.Wyniki prób immunologicznych wykazuja, ze jakosc produkowanego wirusa jest funkcja licz¬ by zywych komórek w substracie kultury. Wlas¬ nosci optymalne wykazuja przy 300 000—600000 komórek na cm2 powierzchni, co uzyskuje sie po 3 luib 4 dniach hodowli zawiesiny, wykazujacej obecnosc 40 000—60 000 komórek cm2.Po zakonczeniu hodowli zawiesine wirusów oczyszcza sie z zanieczyszczen komórkowych i sterylizuje bakteriologicznie przez saczenie lub obróbke chemiczna, np. chloroformem lub trój¬ chloroetylenem.Po sterylizacji zawiesiny komórkowe inaktywuje sie formalina o 0,20—0,30 g%o zawartosci czystego formaldehydu w temperaturze 36°C. Inaktywacje mozna równiez przeprowadzic aldehydem glicydo- wym, uzytym w ilosci 0,05%o, w temperaturze °C, w ciagu 16 godzin lub acetyloetylenoimina.Technike inaktywacji opisano w artykule M. Du¬ randa (Buli. Off. Inst. Epiz. 1968, 69 (3—4), 429— 465).Inaktywowanego wirusa zawiesza sie nastepnie w podlozu oleistym, otrzymujac emulsje typu woda- -okij, olej-woda luib emulsje mieszana olej-woda- -olej. W tym ostatnim przypadku do klasycznej mieszaniny oleju wazelinowego z 10°/o dodatkiem oleinianu anhydroheksitolu, zwanej Arlacel, do¬ daje sie emulgatora typu tween lub innego, two¬ rzacego emulsje typu olej-woda. Szczególnie sku¬ tecznym emulgaltoTem jest tu eter poli&likoloalki- lowy (Emulgine). Emulsje poddaje sie badaniom odpornosci na wirowanie, oznacza opornosc elek¬ tryczna, bada mikroskopowo i charakteryzuje jej dyfuzje w wodzie i czas wyplywu przez kalibro¬ wana igle.Zjadliwosc szczepionki bada sie nastepnie na swini. Na swini oznacza sie równiez aktywnosc antygenowa szczepionki wedlug normy, wydanej przez Office International des Epizooties (J. Poul, Buli. Qff. Int. Epiz. 1964, 61, 1233 oraz M. Gi- raud, Buli. Off. Int. Epiz. 1969, 71, 285—306).Ponizsze przyklady ilustruja sposób wedlug wy¬ nalazku.Przyklad I. Wytwarzanie szczepionek do szczepienia swin przeciwko pryszczycy.Uzyskane po trypsynizacji komórki IB-RS-2 za¬ wiesza sie w glicerynie lub dwumetylosulfotlenku, w ilosci 1-2 • 108 komórek w ml. Zawiesine roz¬ lewa sie do ampulek, kóre zatapia sfe, ochladza w cieklym azocie lub w zamrazalniku, utrzymy- wanym, w temperaturze —80°C.W momencie uzycia jedna lub wieksza liczbe ampulek rozmraza sie i doprowadza do tempera¬ tury 37°C, otwiera ampulke i zawiesza komór¬ ki w pozywce hodowlanej, w ilosci 80 000 komó- rek w iml. Jako ipozywke do hodowli tkankowej stosuje sie podstawowy zestaw soli Hanksa lub Earleigo z dodatkiem 0,5Vo hydrolizatu albuminy mleka, 104% wyciagu drozdzowego, 0,la/o glukozy, —tlO% osocza swini (krowy lub zrebiecia) oraz 0,l§/« kwasnego weglanu sodu. Trypsyne, np. Difco ! 1/300, dodaje sie do pozywki w postaci 0,25°/e roz- ; tworu w buforowanym roztworze soli, pozbawio¬ nym jonów wapnia i magnezu.Zawiesine komórkowa w pozywce, o stezeniu 80 000 komórek w ml, rozlewa sie do bloków stac¬ jonarnych lub obrotowych, w ilosci 0,4 ml czyli okolo 30 000 komórek na cm2 powierzchni. Posia- i ne naczynia umieszcza sie na przeciag 3 lub 4 dni w termostatowej komorze, obracajac ja z szybkoscia 1—5 obrotów na minute, co stwarza warunki, umozliwiajace powstanie jednorodnej powloki o gestosci 500 000—600 000 komórejc na cm* powierzchni.Pozywke usuwa sie i zastepuje ja 2,5a/o roztwó- 40 rem trypsyny 1/300 w buforowanym roztworze soli. Reakcje enzymatyczna prowadzi sie w tem-r peraturze 37°C w ciagu 8 godzin. Zawiesine ko¬ mórkowa w roztworze trypsyny rozciencza sie pozywka z dodatkiem osocza w takim stosunku, 45 by ponownie otrzymac zawiesine o stezeniu 80 000 komórek w ml. W podobny sposób szczepi sie wiejksza liczbe, lecz nie przekraczajaca 10 subkul¬ tur, aby otrzymac liczbe komórek, wystarczajaca do wykonania szarzy produkcyjnej. Wówczas usu- 50 wa sie pozywke z hodowli tkankowej i zastepuje Ja pozywka identyczna, pozbawiona jedynie oso¬ cza. Powyzsza pozywke szczepi sie wirusem. Po¬ zywke stosuje sie w ilosci 0,1 ml na cm*'po¬ wierzchni komórkowej. Inokulum wirusowe roz- 55 ciencza sie tak, by liczba jednostek infekcyjnych w ml wynosila 10-5—10~6.Hodowle wirusa prowadzi sie w ciagu 12 go¬ dzin. W ciagu tego okresu czasu warstwa jedno-l komórkowa ulega zniszczeniu przez wirusa, a ko* 60 morki ulegaja lizie. Zawiesine wirusów szybko ochladza sie do temperatury +4°C, poddaje wi¬ rowaniu i przesacza, pozbawiajac pozostalosci ko¬ mórek, a nastepnie inaktywuje formalina, alde¬ hydem glicerynowym lub acetyloetylenoimina. Po 65 zbadaniu inaktywacji zawiesine wirusowa roz-88 908 8 prowadza sie w oleju mineralnym z dodatkiem emulgatora, otrzymujac szczepionke.Jedna S2czepiónka moze zawierac zawiesine kil¬ ku, np. 3 raznych Wirusów. Ponizej podano sklad kilku szCzepióttsk potrójnych.Szczepionka Nr I. Zawiesina typu woda-olej wi¬ rusa inaktywowanego aldehydem glicerynowym zawtesina wirusów typ O 100 ml Zawiesina wirusów typA 100 ml .ZaWiesirLa Wirusów typ C 100 ml Aldehyd glicerynowy 0,015 g Ma^ollne (olej wazelinowy) 270 ml dteftliAn arihytiroheksitolu (Arlacel A) 30 ml Szczepionka Nr 2. Emulsja typu woda-olej wi¬ rusa, inaktywowanego formalina Zawtesma wirusów typO 100 ml Zawiesina wirusów typ A 100 ml Zawiesina Wirusów typ C 100 ml formaltfehya 0,06 g Mayoftne (olej wazeiinowy) 2?o ml Oleinian anhydroksitohi (Arlacel A) 30 ml Szczepionka Nr 4. Emulsja typu woda-olej wi¬ rusa, inaktywowanego aldehydem glicerynowym Zawtóiina wirusów typ O 100 ml Zawieaina wirusów typ A 100 ml Zawiesina wirusów typ C 100 ml Aldehyd glicerynowy 0,015 g Mayoline (olej waaelinowy 270 ml Emulgine (mieszanina eterów poligli- koloalkilowych 30 ml W przypadku wszystkich powyzszych szczepio¬ nek normalna dawka szczepionki potrójnej, za¬ pewniajaca ochrone prosiecia wagi 30 kg wyno¬ si 3 ml. Odpowiada to 2 000 000 do 4 000 000 za¬ kazonych komórek szczepionki pojedynczej.W tabeli 1 przedstawiono fizyczna charaktery¬ styke szczepionek 1 (zawiesina typu mieszanego) i 2 (zawiesina typu woda-olej) oraz stwierdzone reakcje zaszczepionych nimi domiesniowo, badz tez podskórnie, zwierzat.Secsepion- ka 1 typ C •nuilaja miesaana Szczepion¬ ka 2 typ C emulsja woda-olej , Wyglad makroskopowy jednorodna ciecz o ma¬ lej lepkosci lediwrodfta ciecz o duzej lepkosci PH ft»18 Itf* r Opornosc 153 om • cm ¦ 12 500 om • cm rabela 1 Kropla pod woda rozmywa sie, dobrze miesza z woda nie roz¬ mywa sie, nie mie¬ sza sie 2 woda Lepkosc: wyplyw przez igle 30/16 pod obciazeniem 100 g czas wyplywu ml**32 sek. czas wyplywu ml równy lub wiekszy niz 10 sek.Tolerancja domiesniowa brak olei¬ stych ziaren po zaszcze¬ pieniu, brak objawów stanów zapalnych reakcja za¬ palna z ziar¬ nami oleisty¬ mi w I mie¬ siac po za¬ szczepieniu Tolerancja podskórna lokalny ob¬ rzek, resor- bujacy sie w ciagu kilku dni lokalny znaczny obrzek, nie¬ calkowicie re- sorbujacy sie ] Szczepionka Nr 3. Emulsja mieszana wirusa inaktywowanego aldehydem glicerynowym Zawiesina wirusów typ O Zawiesina wirusów typ A Zawiesina wirusów typ C Aldehyd glicerynowy Mayoline (olej wazelinowy) Oleinian anhydróheksitolu (Arlacel A) Enmlgine (mieszanina eterów poligli- koloalkilowych) 100 ml 100 ml 100 ml 0,015 g 262,5 ml ml ^,5g 50 55 W tabeli 2 przedstawiono wyniki badan ak¬ tywnosci antygenowej szczepionek 1, 2 (pojedyn¬ cze) i 3 (potrójna). Z danych przedstawionych w tabeli wynika, ze typ zawiesiny (woda-olej lub emulsja mieszana) ma znaczny wplyw na inten¬ sywnosc reakcji miejscowej (tolerancja na emul¬ sje mieszana jest wyzsza, niz tolerancja na emul¬ sje typu woda-olej), lecz nie wplywa w zauwa¬ zalny sposób na intensywnosc dzialania ochron¬ nego.Tabela 2 Szczepionka 1 pojedyncza typ C Objetosc 1 ml Czas trwttnia immuniza- cji 28 dni Dawka wirusa zjadliwego (+) Wirus C 000 DI 50 (swinia) Czas rozwoju infekcji 8 dni Wyniki \ Reakcja, pierwo¬ tna ; 7/9** Zakaze¬ nie ogólne 8/9*S8WS a 1* cd. tateft 2 Szczepionka 2 pojedyncza typ C Szczepionka 3 potrójna Objetosc 1 ml 3 ml Czas trwania inumanifi*- cji 28 dni 28 dni Dawka * frusa zjctftiwege {+) Wirua C 000 Dl 50 (swinia) Wirus O OOt DI 60 (swinia) Wiru* A 00t"H.M (swinia) Wirus C 000 Dl 50 (swinia) i Cza* roawaju f infekcji f— 8 dni S dni 8 dni 8 dni wyniki n Reakcja pierwo¬ tna ! 1/9 1/9 2/5 i i 2akaia-l nie 1 ogófne I i i i tr/8 o/s 0/5 1 * Stosunafc Uosfty zwWrsat, wykazujacych zakazenie ogólne do liczby Swierzat, poddanych badaniu.*• Stosunek Ucaby zwleriat, wykazujacych rotacje pttrwotna w punkcie zaszczepienia wirusa zjadliwego do liczby zwie¬ rzat, poddanych badaniu, (+) Dawka Wirusa zjadliwego wyrazona w DI 50 (swinia), tzn. dawka zakazajaca 50*/i zwierzat.Jak wynika z przedstawionych danych, komór¬ ka IB-RS-B jest subatratam, uinoifiwiajaeym bo¬ dowi* wirusa pryszczycy 1 wytwarzanie siczepio- nek pnseciwpryswaycowych, doskonale chronia¬ cych swinie przed zakazeniem ta choroba. Wy¬ kazano równiez* ze otrzymanie wy*ej przetfetawto* nym sposobem szczepionki maja lepsze wlasnosci, niz szczepionki, uzyskane przy uzyciu innych ko- morek, np. BHK, Stosujac to samo inokulum wirusowe, sporza¬ dzono dwie szczepionki, Jedna a wirusa, namno¬ zonego na hodowanej jednowarstwowo komórce IB-RS-&* Jak wynika a danych, przedstawionych w ponizszej tabeli, przy tej samej jakosci wirusa, stwierdzonej wedlug nizej opisanych kryteriów, szczepionki z wirusa, namnozonego na komór¬ kach IB-RS-2, wykazuja lepsze dzialanie antyge¬ nowe, nit szczepionki z wirusa, namnozonego na komórkach BHK. 1 Wirui aamno- i zony na BHK Rozcienczenie, przy którym na¬ stepuje 100°/o I aglutynacja 2jed- I nostek infekcyj¬ nych I Moc infekcyjnaj 50°/o efekt cyto- patologiczny w I stosunku do ko¬ mórki IB-BS-2 [ Moc antygenowa i w Stosunku do swini Dawka antygenu, [ zapewniajaca | 50*/* ochrone 1/32 107** okolo 0,5 ml i 2 sposród zwierzat j (wirus typu A) 1 Wirus 1 namnozony 1 na IB-RS-2 1 1/16 10M 1 5 na 5 zwie¬ rzat 1 1 | 1 Przyklad II. Wytwarzanie szczepionki do szczepienia bydla przeciwko pryszczycy.Komórke IB-RS-2 rozmnaza sie jednowarstwo¬ wo w kolbach obrotowych o pojemnosci 1 litra.Inokulum komórkowe moze zawierac w i ml 100 3G do 900 tysiecy komórek. Jafto pozywke, w ilosci 100-r200 ml na koibe pojemnosci 1 litra stosuje sie podstawowy zestaw soli Hanksa z dodatkiem 2,Wt hydrolizatu albuminy mleka, 0,5f/i wyciagu drozdzowego i 5V* osocza krowiego. Hodowle fco- 36 mórkowa prowadzi sfe w ciagu 4-h5 dni, po czym pozywke usuwa sie z kolby i w Jej miejsce wpro¬ wadza identyczna, zawierajaca inokulum wiruso¬ we. Inokulum sporzadza sie z wirusa, pochodza- cego z zakazonego zwierzecia, hodowanego w kil- 40 ku substratach na komórce IB-RS-2. Liczba sub¬ kultur wirusowych moze wynosic od 1 do 20.Po 16—24 godzinach namnazania wirusów war¬ stwa komórkowa ulega calkowitemu zniszczeniu.Zawiesine wirusów steryliwje sie bakteriologicz- 45 nfe droga saczenia lub metodami chemicznymi i inaktywuje, mieszajac w ciagu 16 godzin w tem¬ peraturze 25°C z uzytym w ilosci 0,05%o aldehy¬ dem glicerynowym. Zinaktywowana zawiesine wirusa miesza sie z adjuwantami: uzyta w ilosci % objetosciowych zawiesina wodorotlenku gli¬ nu o stezeniu 2*/o AljO, i saponina w ilosci 0,06°/» wagowych.Potrójne szczepionki sporzadza sie w postaci dawek o objetosci 5 ml. 15 krów zaszczepiono, 99 uzywajac jedynie pe 1,25 ml szczepionki, co ed- powiada V« dawki przewidzianej. Ponad 50•£ za¬ kazonych nastepnie zwierzat nie wykazalo obja¬ wów chorobowych. Zakazano wirusami pryszczy¬ cy europejskiej typu A, C i O, w ilosci 10 000 da- * wek, dajacych 50*/o zakazenia. i.Typ O. echrona 3 zwierzat na 5 typ A; ochrona 5 zwierzat na 5 « typ C: ochrona 5 zwierzat na 5 5088 908 ll Przyklad III. Wytwarzanie szczepionki prze¬ ciw rzekomemu pomorowi drobiu. i Stwierdzono, ze komórka IB-RS-2* wykazuje szczególna wrazliwosc na wirusa rzekomego po¬ moru drobiu.Zawiesine wirusa, pochodzacego z plynu omocz- riiowego zaplodnionego jaja, mianowano wobec zaplodnionego jaja, wobec komórki IB-RS-2 i wo- tyec komórki BHK-21. Dla kazdego rozcienczenia obecnosc wirusa- stwierdzano badaniem efektu cy- topatologicznego na komórkach i zdolnoscia do aglutynacji krwi, wykazywana przez hodowle tkankowa i ciecz omoczniowa. Miano infekcyjne pznaczano sposobem Reeda i Muncha. Wyniki przedstawiono w ponizszej tabeli. ii BHK IB-RS-2 | zaplodnione jajo Miano oznaczone na podstawie | efektu cylopa¬ tologicznego 107,83 108,5 zdolnosci do 1 aglutynacji krwi | ni Zjadliwego wirusa, zawartego w plynie omocz- niowym zakazonego zaplodnionego jaja, namna- zano na jednowarstwowej hodowli IB-RS-2, w ce¬ lu otrzymania antygenu do sporzadzania nieak¬ tywnych szczepionek. Stwierdzono, ze inokulum wirusowe (zakazony plyn omoczniowy) moze byc rozcienczane do poziomu, pozwalajacego na unik¬ niecie zjawisk autointerferencji i stwarzajacego optymalne warunki namnazania wirusa. Z da¬ nych przedstawionych w ponizszej tabeli wynika, ze rozcienczenie 10-4 stwarza korzystne warunki namnazania wirusa. 12 1 - --¦ - Zdolnosc do agluty¬ nacji krwi 50°/o efekt cytopatologiczny w sto¬ sunku dp komórki IB-RS-2 ; 50°/o efekt smiertel¬ nosci w stosunku do j zaplodnionego jaja 'Plyn omo- cz iowy 1/8000 107,5 108,5 Plyn kultu¬ ry IB-RS-2 1/500 107,5 108,6 Powyzsze wyniki wykazuja, ze komórka IB-RS-2 jest doskonalym substratem do namnazania wi¬ rusa rzekomego pomoru drobiu i ze bez uprzed¬ niej adaptacji pierwotnej kultury powyzszej linii komórkowej, mozna otrzymac zawiesine wirusa o takiej mocy infekcyjnej, jaka posiada plyn omoczniowy.Oba otrzymane wyzej opisanym sposobem pre¬ paraty wirusowe inaktywowano B-propiolaktonem, a nastepnie zmieszano z uzyta w ilosci 50f/o obje¬ tosciowych zawiesina wodorotlenku glinu o 2°/o zawartosci AltQ8. Powyzszymi szczepionkami za¬ szczepiono podskórnie kurczaki, stosujac dawki wielkosci 1 ml. Po 3 tygodniach partie po 10 zwie¬ rzat zakazono wirusem rzekomego pomoru dro¬ biu- w, rozcienczeniach 10-*—10-4. Obie szczepionki ochronily wszystkie zaszczepione zwierzeta, pod¬ czas gdy u zwierzat kontrolnych wystapily obja¬ wy chorobowe.Stwierdzono równiez, ze komórka IB-RS-2 na¬ daje sie do namnazania oslabionych wirusów rze¬ komego pomoru drobiu takich, jak wirus Bx Hit- shenera. W tym przypadku efekt cytopatologiczny jest slabszy, lecz miano, oznaczone na podstawie zdolnosci do aglutynacji krwi, jest wysokie.Rozciencze¬ nie wirusa kw inokulum -1 -2 - 10-3 1, r Inokulum Drzechowywarie w ciagu -48 godzin w 37°C 50$ efekt smiertelnosci w stosunku do zaplodnionego jaja 107.5 105.8 n.o. 103 B0% efekt smiertelnosci w stosunku do komórki BHK 21 105,5 104,2 103 lOM Zdolnosc do aglutynacji krw: 1/256 1/128 1/4 1/2 Zawiesina wirusów z- komórek IB-RS-2 po 48 godzinach hodowli 5Ó& efekt smiertelnosci w stosunku do zaplodnionego jaja 107,1 107,5 n.o. 107,9 <# efekt smiertelnosci w stosjnku do komórki BHK 21 105.1 106 n.o.Zdolnosc do aglutynacji krwi 1/256 1A28 1/128 1/128 4*0. — nie oznaczano Obrotowe naczynia z pojedyncza warstwa ko¬ mórek IB-RS-2 posiano 50 nil pozywki z zaka¬ zonym plynem oimoczniowym w rozcienczeniu 10~4 o mianie infekcyjnym w stosunku do zaplodnione¬ go jaja 104»5. Tym samym wirusem, rozcienczo¬ nym do stezenia 10-4, zakazono droga omocznio¬ wa serie jaj w 13 dni po zaplodnieniu. Po 46 go¬ dzinach zawiesine wirusów poddano wyzej opisa¬ nym badaniom. Wyniki przedstawiono w poniz¬ szej tabeli. 55 Na komórce IB-RS-2 miano infekcyjne=104»83 na komórce BHK-21 miano infekcyjne=101.Przyklad IV, Zastosowanie cieczy z komór¬ ki IB-RS-2 jako zywej szczepionki przeciwko po¬ morowi swin. swiniom zaszczepiono po 5 ml cieczy z opi¬ sanej w przykladzie I jednowarstwowej hodowli komórki IB-RS-2. W ciagu 25 dni obserwacji u zadnego ze zwierzat nie wystapily objawy. pod¬ wyzszenia temperatury. Po uplywie tego okresu88 968 13 14 czasu kazda ze swin zakazono 1 ml rozcienczonej w stosunku 1:10 krwi chorej swini. W ciagu 15 dni u zadnego ze zwierzat nie wystapilo podwyz¬ szenie temperatury, ani tez zadne symptomy po¬ moru.Przyklad V. Zastosowanie zywych komórek IB-RS-2 jako zywych szczepionek przeciwko po¬ morowi swin. zwierzat zaszczepiono w warunkach iden¬ tycznych, jak w przykladzie IV, zywymi komórka¬ mi IB-RS-2 w ilosci 10-106 na zwierze. Stwier¬ dzono znakomita tolerancje. Zadne ze zwierzat w ciagu 24 dni po zaszczepieniu, nie wykazalo znaczniejszego podwyzszenia temperatury, a och¬ rona przeciwko wirusowi byla podobnie, jak w przykladzie IV, calkowita.Przyklad VI. Zastosowanie uleglych lizie ko¬ mórek IB-RS-2 jako zywych szczepionek prze¬ ciwko pomorowi swin.Lizat otrzymany przez zamrozenie i rozmrozenie komórek IB-RS-2 zmieszano z ciecza z hodowli i poddano liofilizacji, otrzymujac zywa szczepion¬ ke przeciwko pomorowi swin. W celu oznaczenia miana ochronnego i tolerancji na powyzsza szcze¬ pionke wykonano rozcienczenia 10-1—10-5 i za¬ szczepiono je partiom po 5 swin. W czasie trwa¬ nia immunizacji u zadnego ze zwierzat nie za¬ obserwowano znaczniejszego podwyzszenia tem¬ peratury. Nastepnie zwierzetom zaszczepiono po 1 ml krwi chorego zwierzecia. Na podstawie wy¬ ników badan obliczono miano ochronne, znajdu¬ jac wartosc 10"4. Tak wiec szczepionka zawiera 104 jednostek ochronnych. PL