DE2121237A1 - Verfahren zur Züchtung von Viren und zur Herstellung von Lebendvakzinen aus diesen Viren - Google Patents

Verfahren zur Züchtung von Viren und zur Herstellung von Lebendvakzinen aus diesen Viren

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DE2121237A1 DE19712121237 DE2121237A DE2121237A1 DE 2121237 A1 DE2121237 A1 DE 2121237A1 DE 19712121237 DE19712121237 DE 19712121237 DE 2121237 A DE2121237 A DE 2121237A DE 2121237 A1 DE2121237 A1 DE 2121237A1
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Description

Die Erfindung betrifft die Möglichkeit der Verwendung der sogenannten IB-RS-2-Zellinie für die Herstellung von Viren, die für die Herstellung von Vakzinen bestimmt sind.
Die Zelle IB-RS-2 wurde im Institut für Biologie in Sao Paulo isoliert. Maria Pereira de Castro berichtete darüber dem 14. Jahreskongress der "Tissue Culture Association" in Boston vom 28, bis 30. Mai I963, Sie wurde von der Verfasserin in ARQ.INST.BIOL,SAO PAULO (JJX (2), I03-I27, I970J ^4, 223-241, 1967J 285-294, -,-295-299, -;21 O), 63-78, 1964; 21 (4) 155-166, 1964) beschrieben.
Diese Zellinle stammt von einer Primärkultur von Schweinenieren ab, die einen normalen weiblichen Karyotyp (Karyotyp 0) aufweisen, das aus 38 Chromosomen besteht, die wie folgt angeordnet sind: 2 0 Ij 2 G II, 2 G IH-I, 2 G III-2, 14 G IV (einschließlich des Geschlechtschromosoms), 4 G V, 2 G VI, 4 G VII, 2 G VIII-I, 4 G VIII-2.
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Die Verfasserin beschreibt ausführlich (ARQ.INST,BIOL. SAO PAULO 22 (2) I05-127, 1970) die verschiedenen Möglichkeiten der Neuordnung der Chromosomen, die im Laufe der Evolution der Zellinie IB-RS-2 stattfinden konnten. Es ist zu bemerken, daß alle bisher von der Verfasserin untersuchten und beschriebenen Zellklonen (clones cellulaires) durch unveränderte Gruppen 2 G I, 2 G II, 4 G V, 4 G VII, 4 G VIII-2 gekennzeichnet sind, während alle eine Modifikation in der Gruppe 2 G III-2 aufweisen, die zu 1 G III-2 wird.
Durch verschiedene Neuordnungen kann die Gesamtzahl der Chromosomen nach den untersuchten Zellklonen zwischen und 58 variieren. Diese Merkmale der Chromosomen entsprechen den bereits beschriebenen und tatsächlich verwendeten Klonen, aber die Möglichkeit der Verwendung anderer Klonen, die der Linie IB-RS-2 entstammen und verschiedene Neuordnungen der Chromosomen aufweisen, ist dennoch nicht ausgeschlossen.
Die Zelle IB-RS-2 kann in flüssigem Stickstoff oder im Tiefkühlschrank bei minus 800C konserviert weiden. Sie vermehrt sich in der Monoschicht auf üblichen Kulturmedien: basische Hanks - oder Earle - Salzlösung, die mit Hefeextrakt, Kaseinhydrolysat oder mit Lactalbumin angereichert ist, halbsynthetisches Vorratsmedium oder synthetisches Medium des Typs I99. Diesen üblichen Medien werden gewöhnlich 5 bis Io % Schweine-, Kalbs- oder Pferdeserum zugesetzt. Die Menge der Zellkulturflüssigkeit wird auf etwa o,4 ml/cm Monoscnichtoberfläche eingestellt.
Der Zellvermehrungskoeffisient zwischen jeder Subkultur 109849/1862
beträgt 3 bis Io je nach Art des Kulturmediums und der Kultivierungsdauer. Es wird empfohlen, die Zahl der Subkulturen zu begrenzen, um gute Stabilität der Zellinie IB-RS-2 zu garantieren. Bei der laufenden Erzeugung werden zehn aufeinanderfolgende Subkulturen aus dem ursprünglichen Zellmaterial nicht überschritten.
Es wurde gefunden, daß die Zelle IB-RS-2 in Suspension kultiviert werden kann. Die Zelle IB-RS-2 wurde an die Kultur in Suspension angepasst, indem sie für lange Zeit unter den Bedingungen der bewegten und belüfteten Kultur gehalten wurde. Die Zelle hat auf diese Weise die Fähigkeit erworben, sich in Suspension zu vermehren. Eine "clonage" wurde an dieser Population vorgenommen, um die Zellen auszuwählen, die am besten an diesen Kulturtyp adaptiert waren. Es wurde festgestellt, daß die an die Vermehrung in Suspension adaptierten Zellen ihre Empfindlichkeit gegenüber dem Maul- und Klauenseuche-Virus bewahrten und die Virussuspensionen, die aus den in Suspension vermehrten Zellen stammten, die gleiche Qualität wie die Virussuspensionen hatten, die aus in Monoschichten kultivierten Zellen stammten. Die Kultur in Suspension kann in jedem Permenter durchgeführt werden, der für die Zellkultivierung verwendet wird und mit Vorrichtungen zum Rühren und zur Belüftung versehen ist. Geeignet sind verschiedene Medien, die auf Aminosäuren und Vitaminen, auf Proteinhydrolysaten und Hefeextrakten basieren, z.B. das MEM-Spinner-Medium. In allen Fällen gibt man einen Zucker und ein gepuffertes physiologisches Medium zu. Bei den Kulturen in Suspension gibt man den klassischen Kulturmedien ebenso wie bei Kulturen in Monoschichten 5 bis Io % Kalbs- oder Schweineserum zu.
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Von der Anmelderin wurde ferner nachgewiesen, daß die in Monoschiehten vermehrte oder an die Kultur in Suspension adaptierte Zelle IB-RS-2 nicht mehr die Fähigkeit hat, Tumore beim Hamster zu erzeugen:
Hamster wurden in der Jochbeintasche (poche jugale) jeweils mit Io χ Io , 2 x Io , 1 χ lo^ und 1 χ lo^ lebenden Zellen geimpft. Ein kleiner Knoten entwickelt sich vom fünften Tag ab nach!Inoculation von Io χ Io Zellen und verschwindet allmählich vom zehnten Tag ab. Dieser Knoten ist nach einem Monat nicht wahrnehmbar und nach zwei Monaten vollständig verschwunden. Bei Konzentrationen unter 2 χ Io und darunter tritt selbst nach fünf Tagen kein Knoten auf.
Andererseits wurde berichtet (S.S. Breese; Archiv für die gesamte ,Virusforschung ^Jo, 4öl-4o4, I970), das die Zelle IB-RS-2 ebenso wie die Schweinezellinie PK I5 Partikel enthält, die Viren ähneln und einen mittleren Außendurchmesser von 9° ^ und einen zentralen Kern von 60 mu haben.
Diese Partikel ähneln den Zellen, die für die Zellinie BHK 21 beschrieben wurden.
Die Erfindung ist in erster Linie auf die Verwendung der Zelle IB-RS-2 für die Vermehrung verschiedener Viren und die Herstellung von Virussuspensionen gerichtet, die ent weder für Diagnosezwecke oder für die Herstellung von Vakzinen bestimmt sind.
Die Forscher des Instituts für Biologie von Sao Paulo, die die Zellinie IB-RS-2 isolierten, beschrieben bereits die Empfindlichkeit der verschiedenen Klonen dieser Zell linie gegenüber dem Maul- und Klauenseuche-Virus (ARQ.
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212123? -, 5 -
INST.BIOL.SAO PAULO, 2i O)» 63-78, 1964; jjl (4) 155-156, 1964; 21 (2) lo>127, (197©).
Es wurde gefunden, daß die Zelle für die Vermehrung des Maul- und Klauenseuche-Virus (nachstehend als MKS-Virus bezeichnet) und für die Herstellung von Virussuspensionen verwendet werden kann, die nach Inaktivierung eine Vakzine gegen den MKS-Virus darstellen, die Schweinen eine sehr gute Immunität verleiht, wobei die immunogene Wirkung dieser Vakzine für das Schwein höher ist als diejenige der Vakzinen, die durch Vermehrung des Virus auf anderen heterologischen Zellen, z.B. auf der Zelle BHK erhalten worden sind. Außerdem verleiht diese Vakzine der Rinderspezies eine gute Immunität.
Es wurde ferner gefunden, daß die Zelle IB-RS-2 für die Vermehrung verschiedener Viren, z.B. des Newcastle Disease-Virus und des Schweinepest-Virus Verwendet werden kann. Diese Zellinie ist auch gegenüber dem Para-Influenz^· Virus empfindlich. Hierbei wird die Anwesenheit des Virus durch Hemadsorption nachgewiesen.
Außerdem kann die Zellinie IB-RS-2 ebenso wie andere Zellinien oder Primärkulturen von Schweinenieren als Substrat für die Vermehrung des Virus der infektiösen Gastroenteritis dienen. Diese Liste von Viren, die sich auf Zellen der Linie IB-RS-2 vermehren können, ist nicht erschöpfend.
Der Ursprung der Zelle IB-RS-2 vom Schwein'hat zur Folger daß sie sich besonders gut für die Vermehrung aller Viren eignet, die Krankheiten bei dieser Tierspezies hervorrufen. Die erhaltenen Suspensionen ermöglichen die Her-
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stellung von Vakzinen, die für die Gattung Schwein keinerlei Gefahren einer Sensibilisierung anschließend an die Verwendung von heterologen Zellen mit sich bringen.
Es wurde nun gefunden, daß die Zelle IB-RS-2 Träger eines abgeschwächten Schweinepestvirus im permanenten Zustand ist und daß dieses Virus kein Pathogen für das Schwein ist, sondern .ihm eine hohe spezifische Immunität verleihen kann und es gegen eine virulente Probe der Schweinepest vollständig schützt. Dieses abgeschwächte Virus ist in den nicht geschädigten Zellen vorhanden (intra-r zellulärer Virus) und kann durch Lyse der Zellen nach bekannten physikalisch-chemischen Methoden gewonnen werden. Das Virus ist auch in der KuI tür flüssigkeit der Zelle IB-RS-2 vorhanden. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung dieses Virus als Stamm für die Herstellung von Vakzinen (abgeschwächte Lebendvakzine).
Das Verfahren zur Herstellung einer Vakzine gegen Maul- und Klauenseuche aus dem auf Zellen IB-RS-2 vermehrten Virus wird wie folgt durchgeführt:
Man entnimmt IB-RS-2-Zellen einem Vorrat, der durch Gefrieren auf -l8o°C konserviert ist, und kultiviert sie in Monoschichten in stationären Roux-Kolben oder in rollenden Kolben unter Verwendung eines klassischen Mediums, z.B. einer Hanks-Lösung, der Hefeextrakt oder Lactalbuminhydrolysat zugesetzt worden ist, und die mit 5 bis Io % Schweine-, Rinder- oder Pferdeserum ergänzt worden ist.
Es ist auch möglich, eine erste Kultivierung der IB-RS-2 Stellen in Monosohicht in MEM-Sprinner-Medium durchzufüh-
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ren und anschließend eine Kultur in Suspension zu beimpfen. Zu diesem Zweck wird eine Zellsuspension, die 2OO.OOO Zellen/ml enthält, in einen mit Rührer und Belüftung versehenen Reaktor gegeben. Die Kultur wird bei 37°C gehalten, während mit J5oo u/min, gerührt wird. Der pH-Wert wird durcn Belüftung bei 7,ο + o,l gehalten. Das Kulturmedium wird alle 3 Tage gewechselt. Nach einer anderen Ausführungsform wird eine bestimmte Zellkonzentration aufrecht erhalten, indem alle 3 Tage mit/irischem Medium verdünnt wird. Unter diesen Bedingungen ist die Zahl der Zellen, die zu Beginn 2oo.ooo/ml betrug, nach 8 Tagen auf 800.000 Zellen/ml gestiegen. Dies entspricht einer Vermehrung auf das vierfache in 8 Tagen.
Man impft anschließend das erhaltene Zellsubstrat mit einem Impfvirus, der aus verunreinigter Schweinelymphe oder virulentem Blut des gleichen Tieres stammt und mehrere aufeinanderfolgende Passagen auf IB-RS-2-Zellen oder beliebigen anderen Zellen, z.B. Primärzellen der Schweineniere, in kontinuierlicher Linie gehaltenen Schweinezellen oder beliebigen heterologen Zellen, die gegenüber dem MKS-Virus empfindlich sind, z.B. BHK-Zellen und Primärkultur von Kalbsnieren, durchlaufen hat. Die Zahl der Passagen kann 4 bis 2o betragen, jedoch werden vorzugsweise Viren nach 4 oder 5 Passagen in der Zellkultur verwendet, um die Empfehlungen des Office International des Epizooties (I969) zu beachten.
Die optimale Kultivierungsdauer des Virus in Monoschichten wurde nach optimaler Vermehrung und Antigenität in Abhängigkeit einerseits von der Kinetik der Vermehrung und andererseits von den Ergebnissen von immunologischen Tests an Versuchstieren oder Schweinen bestimmt. Die Be-
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Stimmung de^bptimalen Vermehrung erfolgt unter Verwendung der Infektiösität und der quantitativen serologischen Reaktionen als Kriterien. Die Infektiösität wird an Primärkulturen von Nieren des jungen Schweins oder des Rinderfötus oder der der Zelle IB-RS-2 nach der sogenannten Methode des zytopathogenen Effekts oder durch die Fähigkeit zur Bildung von Lysenplaques unter einer Agarschicht bestimmt. Der optimale infektiöse Titer beträgt hierbei Io bis Io' pro ο,Ι-ml. Der infektiöse Titer kann auch durch Titrierung an Meerschweinchen oder Mäusen bestimmt werden.
Die serologischen Eigenschaften werden durch die sogenannte Komplimentbindungsreaktion bestimmt. Die Ergebnisse werden durch die Antigenverdünnung, die loo % von zwei Komplimenteinheiten bindet, oder durch die Antigenverdünnung ausgedrückt, die 5° % von zwei in die Reaktion eingeführten Komplimenteinheiten bindet. Die auf diese Weise gebildeten Antigene binden loo % von zwei Komplimenteinheiten bis zu einer Verdünnung von 1/4 oder 1/8, wobei die Verdünnung bis zu 1/52 betragen kann. Diese serologischen Komplimentbindungsreaktionen können am rohen Virus oder am Virus, der vorher mit aliphatischen Chlorfluorkohlenwasserstoffen (Freon) oder mit halogenierten Kohlenwasserstoffen gereinigt worden ist, durchgeführt werden.
So wurde gefunden, daß die optimale Kulturdauer für die wenig adaptierten Viren (4.-6. Passage) gewöhnlich 16 Stünden beträgt, aber je "nach den Viren zwischen Io und 2o Stunden variieren.kann. Bei Viren, die eine größere Zahl von Passagen in der Zellkultur, z.B. 2o Passagen, durchlaufen haben, ist die Kulturdauer gewöhnlich verkürzt. Sie beträgt hierbei etwa 8 Stunden und kann je
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nach den Viren 6 bis 12 Stunden betragen.
Nach den Ergebnissen von immunologischen Tests wurde ferner gefunden, daß die Qualität des gebildeten Virus von der Zahl der lebenden Zellen im KuItürsubstrat ab-
hängt. Das Optimum beträgt 300.000 bis 600.000 Zellen/cm Monoschicht. Dies wird nach 3 oder 4 KuItivierungstagen bei einer Ausgangssuspension erreicht, die 4o.ooo bis
60.000 Zellen/cm enthält.
Nach der Gewinnung werden die Virussuspensionen von Zelltrümmern befreit und bakteriologisch nach Filtrationsverfahren oder durch chemische Behandlungen, z.B. Behandlung mit Chloroform oder TriChloräthylen, sterilisiert.
Nach der Sterilisation werden die Zellsuspensionen mit o,o2 bis 0,03 Gew.-# reinem Formaldehyd bei ^einer Temperatur von 360C inaktiviert. Die Inaktivierung kann auch mit Glycidaldehyd in einer Menge von 0,095 % bei einer Temperatur von 25°C für 16 Stunden oder mit Acetyläthylenimin erfolgen. Die Inaktivierungsverfahren werden in der Veröffentlichung von M. Durand (Bull.Off.Int.Epiz., 1968, 69 (3-4), 429-465) beschrieben. '
Der inaktivierte Virus ftird anschließend in einem, öl als Hilfsstoff emulgiert, um eine Wasser-in-öl-Emulsion oder eine Öl-in-Wasser-Emulsion oder eine gemischte öl-in-Wasser-in-öl-Emulsion zu bilden. Im letzteren Fall gibt man zum klassischen Gemisch Mayoline, die mit Io % eines Anhydrohexitoleats ("Arlacel") versetzt ist, einem Emulgator des Typs "tween11 oder eine beliebige andere Substanz, die eine Öl-in-Wasser-Emulsion zu bilden vermag, insbesondere ein als "Emulsine" bezeichnetes Spezialge-
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- Io -
misch eines Polyglykoläthers mit einem Fettalfcohol.
Die Emulsionen weiden auf ihre Beständigkeit gegen Zentrifugierung, ihren spezifischen Widerstand, durch mikroskopische Beobachtung, ihre Diffusionseigensehaften in Wasser und ihre Fließzeit über eine Nadel von bestimmtem Durchmesser geprüft.
Die Unschädlichkeit der Vakzine wird anschließend an der Schweinespezies überprüft.
Außerdem wird die Antigenität der Vakzine an der gleichen Spezies nach Normen bestimmt, die vom Office International des Epizooties veröffentlicht worden sind (J.POUL.Bull. Off.Int.Epiz. 1964, 61, 1225 und M. Giraud, Bull.Off.Int. Epiz. 1969* 71* 285-306).
Beispiel 1 Herstellung einer Vakzine gegen Maul- und Klauenseuche,
die der Schweinespezies ausgezeichnete Immunität verleiht.
Nach Tr yps inbehandlung gewonnene IB-RS-2-Zellen werden in einem Olyzerinmedium oder einem Medium, dem Dimethylsulfoxyd zugesetzt worden ist, in einer Menge von .1 bis 2 χ Io Zellen/ml suspendiert. Nach Verteilung auf verschlossene Ampullen werden diese Zellen mit Hilfe einer Tiefkühlvorrichtung, die eine gleichmäßige Temperatur-Senkung gewährleistet, eingefroren und dann in flüssigem Stickstoff oder im Tiefkühlschrank bei -4o°C gelagert.
Zur Verwendung werden eine oder mehrere Ampullen auf dem Wasserbad bei 37°C aufgetaut. Die Zellen werden im Kulturmedium in einer Menge von 80.000/ml suspendiert. Das
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verwendete Kulturmedium besteht aus einer Hanks —Lösung (oder Earle-Lösung), der 0,5 % Lactalbuminhydrolysat, o,l % Hefeextrakt, o,l % Glucose, 5 bis Io % Schweineserum (oder Kalbs- oder Pferdeserum) und o,l % Natriumdicarbonat zugesetzt worden ist. Trypsin, z.B. Difco I/300, wird diesem Medium nach Verdünnung auf 0,25 % in einer gepufferten Kochsalzlösung, die frei von Calcium- und Magnesiumsalzen ist, zugesetzt.
Die Zellsuspension mit 80.000 Zellen/ml im Nährmedium wird auf feststehende Kolben oder auf rollende Kolben in
einer Menge von o,4 ml/cm Oberfläche verteilt. Die Menge
ρ
der Zellen, die pro cm verfügbare Oberfläche inoculiert worden sind, beträgt somit etwa Jo.000. Die auf diese Weise geimpften Oberflächen werden 3 bis ^ Tage im Wärmeschrank gehalten, wobei die Kolben einmal in 5 Minuten gedreht werden, um die Ausbildung eines geschlossenen und dichten Fellrasens zu ermöglichen. Die Zahl der Zellen erreicht hierbei 500.000 bis 600.000/cm2 Oberfläche.
Das Nährmedium der Zellkultur wird entfernt und durch eine 2,5 #ige Lösung von Trypsin I/500 in einer gepufferten Salzlösung ersetzt. Die enzymatische Behandlung wird 8 Stunden bei 37°C vorgenommen. Die Zellsuspension im trypsinhaltigen Medium wird mit dem Nährmedium, dem Serum zugesetzt worden ist, in einer solchen Menge verdünnt, daß erneut eine Zellsuspension mit 80.000 lebensfähigen Zellen pro ml erhalten wird.
In der gleichen Welse werden mehrere Subkulturen in einer solchen Zahl durchgeführt, daß die Vermehrung der ZeIlmasse genügt, um eine Produktionsmenge zu gewährleisten. Die maximale Zahl der Subkulturen beträgt hierbei Io.
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Die erhaltene Zelloberfläche genügt, wird mit der Viruskultur begonnen. Das Pellnährmedium wird entfernt und durch ein gleiches Medium ersetzt, das Jedoch kein Serum enthält und mit dem Impfvirus versetzt worden ist. Die für die Vermehrung des Virus verwendete Menge des KuI-
turmediums beträgt o,l ml/cm Pelloberfläche. Das Virusinoculum wird so verdünnt, daß die Zahl der infektiösen
—5 —6 Einheiten pro ml Io ** bis Io beträgt.
Die Züchtung des Virus wird 12 Stunden durchgeführt. Nach dieser Zeit isiyder gesamte Zellrasen durch das Virus zerstört, und die Zellen sind lysiert. Die Virussuspension wird unmittelbar auf +40C gekühlt. Diese Virussuspension wird zentrifugiert und filtriert, um Zellreste zu entfernen, und dann mit Formaldehyd, Glycidaldehyd oder Acetyläthylenimin inaktiviert.
Nach Überprüfung der Inaktivierung wird diese Virussuspension in einem aus Mineralöl und Emulgatoren bestehenden Gemisch emulgiert, um die Vakzine zu bilden.
Es ist auch möglich, in einer gleichen Vakzine mehrere Virussuspensionen von verschiedenem Typ zu vereinigen und beispielsweise eine dreiwertige Vakzine zu bilden. Einige Beispiele der Zusammensetzung von dreiwertiger Vakzine sind nachstehend genannt;
Präparat Nr. 1 Wasser-in-öl-Emulsion von mit Glycidaldehyd inaktivierten
Viren
Virussuspension Typ O loo ml
Virussuspension Typ A loo ml
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Virussuspension Typ C loo ml
Glycidaldehyd o,ol5 g
Vaselinöl (Mayoline) 27o ml
Anhydrohexitoleat (Arlaeel A) ^o ml
Präparat Nr. 2 Wasser-in-öl-Suspension von mit Formaldehyd inaktivierten
Viren
Virussuspension Typ O loo ml
Virussuspension Typ A . loo ml
Virussuspension Typ C loo ml
Formaldehyd ο,οβ g
Vaselinöl (Mayoline) 27o ml
Anhydrohexitoleat (Arlaeel A) Jo ml
Präparat Nr. 3 Gemischte Emulsion von mit Glycidaldehyd inaktivierten
Virussuspension Typ O loo ml
Virussu-spension Typ A loo ml
Virussuspension Typ C loo ml
Glycidaldehyd o,ol5 g
Vaselinöl (Mayoline) 262,5 ml
Anhydrohexitoleat (Arlaeel A) Jo ml Spezialgemisch von Polyglykolather und
Fettalkohol (Emulgine) 7*5 g
Präparat Nr. 4
Öl-in-Wasser-Emulsion von mit Glyoidaldehyd inaktivierten Virussuspension Typ O loo ml Virussuspension Typ A loo ml Virussuspension Typ C loo ml
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Glycidaldehyd o,ol5 g
Vaselinöl (Mayoline) 27o ml Spezialgemisch von Polyglykolather und
Pettalkohol (Emulgine) J5° ml
Bei allen diesen. Präparaten beträgt die übliche Dosierung zur Gewährleistung der Immunisierung eines Jungschweines von J5o kg 3 ml dreiwertige Vakzine. Diese Dosierung entspricht 2.000,000 bis 4.ooo.ooo infizierten Zellen pro Dosis des monovalenten Impfstoffs.
> In Tabelle I sind die physikalischen Eigenschaften von zwei Vakzinen 1 und 2, nämlich erstens einer gemischten Emulsion und zweitens einer Wasser-in-öl-Emulsion, und die bei den mit diesen Vakzinen intramuskulär oder subkutan behandelten Tieren festgestellten Reaktionen genannt.
In Tabelle II sind die Ergebnisse von Antigen-Aktivitätstests drei Vakzinen 1 und 2 (monovalent) und 3 (trivalent) angegeben.
Die Ergebnisse in diesen Tabellen zeigen, daß die verwendete EmuüSsionsart (Wasser-in-öl oder gemischte Emulsion) einen großen Einfluß auf die Intensität der örtlichen Reaktionen (die Verträglichkeit.der gemischten Emulsion ist größer als die der Wasser-in-öl-Emulsion), aber keinen nennenswerten Einfluß auf die Intensität der Immunität hat.
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Tabelle I makroskopi p„-Wert spezifi- Tropfen Viskosität Verträglich Verträglichi- KJ
sches Aus sch-er auf in, der _,
Injektions
spritze mit
Nadel 30/15		 keit bei In keit bei K)
sehen Widerstand Wasser Gewicht loog tramuskulärer
Injektion		 subkutaner
Injektion		 K)
OJ
homogene Durehflußzeit
Flüssigkeit 8,18 153 Ohm breitet für Io ml: kein öliges lokalisier
Vakzine 1 cm sich aus, 32 Sekunden Granulat tes ödem, ' ^JS*
wird in den Ί
O Typ C sehr 1 Monat nach folgenden
co gemischte leicht der Impfung Tagen re-
Emulsion mischbar keine Ent sorbiex't.
CD zündungser
Durehflußzeit scheinungen lokalisier
homogen, 7,78 12.5OO breitet für Io ml: Entzündungsre tes, jedoch
00
cry 		viskos Ohm cm sich 15 Minuten aktionen mit starkes ödem,
PO Vakzine 2 nicht aus oder länger "huilome" 1 das unvoll
Typ C nicht Monat nach der ständig re
Wasser-in- mischbar Impfung sorbiert
Öl-Emulsion wird.
Tabelle II
Volumen Immunisie- Versuchs- Versuchsrungsdauer dosis (+) dauer
Ergebnisse
primäre Lesionen Generälisierungen
Vakzine 1
monovalent
Typ C		 1 ml 28 Tage Virus C
lo.ooo ID
5o
(Schwein)		 8 Tage 7/9** o/9x
Vakzine 2
monovalent
Typ C		 1 ml 28 Tage Virus C
lo.ooo ID
5o
(Schwein)		 8 Tage 2/9 o/9
Vakzine 3
trivalent		 3 ml 28 Tage Virus O
lo.ooo
ID 5o
(SchweinX		 8 Tage 1/5 o/5
Virus A
lo.ooo
ID 5o
(Schwein)		 ö Tage 2/5 0/5
Virus C
lo.ooo
ID 5o
(Schwein)		 ö Tage 5/9 0/9
χ Verhältnis der Zahl der Tiere mit generalisierten Lesionen zur Zahl der Versuchstiere. XX Verhältnis der Zahl der Tiere mit primären Lesionen an der Impfstelle des Versuchsvirus zur
Zahl der Versuchstiere.
(+)= Die Versuchsdosis ist in ID 5o (Schwein), d.h. in infektiösen 5o #-Dosen für das Schwein ausgedrückt.
Die Zelle IB-RS-2 stellt somit ein Substrat dar, das die Züchtung des Virus der Maul- und Klauenseuche und die
Gewinnung von Vakzinen gegen Maul- und Klauenseuche mit ausgezeichnetem Immunisierungsvermögen für Schweine ermöglicht. Ferner wurde gezeigt, daß die in dieser Weise hergestellten Vakzinen den mit anderen Zellen, z.B. der B.H.K.-Zelle, erhaltenen Vakzinen überlegen sind. Zwei
Vakzinen wurden aus einem gleichen Virus-Inpkulum hergestellt, und zwar eine Vakzine aus dem auf der BHK-Zelle in Monosohicht vermehrten Virus und die andere aus dem
auf der IB-RS-2-Zelle in Monoschicht vermehrten Virus.
Bei gleicher viraler Qualität, bestimmt nach den oben
beschriebenen Kriterien, hat die Vakzine, die aus dem
Virus hergestellt wurde, der auf IB-RS-2-Zellen gezüchtet wurde, eine höhere Antigenität als die Vakzine, die aus dem auf BHK-Zellen gezüchteten Virus hergestellt worden war, wie die Ergebnisse in der folgenden Tabelle
zeigen.
Auf BHK gezüchtetes Virus
Komplimentbindungsvermögen (loo % von 2 Komplimenteinheiten)
Infektiösität, 5o #iger zytopathogener Effekt für die IB-RS-2-Zelle
Antigenität beim Schwein
Antigene Dosis, die 5o #igen gewährleistet (Virus Typ A)
1/52
etwa 0,5 ml
2 Tiere von 5
mit 0,5 ml
AAntigen geschützt
Auf IB-RS-2 gezüchtetes Virus
1/16
<o,17 ml
5 Tiere von 5 mit 0,17 ml Antigen geschützt
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- i8 -
Beispiel 2 -
Herstellung einer Vakzine gegen Maul- und Klauenseuche , die gute Immunität bei Rindern verleiht.
Die Zelle IB-RS-2 wird in Monosehicht in gerollten 1 Liter-Kolben kultiviert. Das Zellinokulum kann aus loo.ooo bis ^oo.ooo Zellen/ml bestehen,, Das in einer Menge von loo bis 2oo ml/Kolben verwendete Kulturmedium besteht aus einer Hanks-Salzlösung, der 2,5 % Lactalbuminhydrolysat, o,5 $ Hefeextrakt und 5 % Kalbsserum zugesetzt worden sind. Die Zellkultur entwickelt sich innerhalb von 4 bis 5 Tagen.
Die Kulturflüssigkeit wird entfernt und durch 5o ml Kulturflüssigkeit ersetzt, die die gleiche Zusammensetzung hat, jedoch das gleiche Impfvirus enthält. Das Impfvirus wird aus dem von Rindern stammenden Virus der Maul- und Klauenseuche durch Züchtung in mehreren Subkulturen auf der Zelle IB-RS-2 hergestellt. Die Zahl der Virus-Subkulturen kann 2 bis 2o betragen.
Nach 16- bis 24-stündiger Züchtung des Virus ist der Zellrasen vollständig zerstört. Das Virus wird gewonnen, bakteriologisch durch Filtration oder auf chemischem Wege sterilisiert und mit 0,005 % Glycidaldehyd, das bei 25°C 16 Stunden zur Einwirkung gebracht wird, inaktiviert. Das auf diese Weise inaktivierte Virus wird mit Immunitätsadjuvantien gemischt, nämlich 2 #igem Aluminiumhydroxyd (ausgedrückt in Al2O^) in einer Menge von 25 Vol,# und Saponin (o,o6 g/l00 ml)„
Die VaksinCi, die mit einem Volumen von 5 ml pro Srivalent® Dosis zusammengestellt wird, wird 15 Rindern mit
Volumen vo$ 1^,25 ml entsprechend l/k der vor; der
empfohlenen Dosis für Rinder verabreicht. Mehr als 5o # der Rinder werden gegen Generalisierung geschützt, die durch den Virulenzversuch mit Hilfe von lo.ooo infektiösen 5o #-Dosen jedes der drei europäischen MKS-Viren 0, A und C hervorgerufen wird:
Typ 0: 5 von 5 Tieren geschützt Typ A: 5 von 5 Tieren geschützt Typ Ct 5 von 5 Tieren geschützt.
Beispiel 3
Herstellung einer Vakzine gegen das Newcastle Disease-Virus
Von der Anmelderin wurde nachgewiesen, daß die Zelle IB-RS-2 besonders empfindlich gegenüber dem Newcastle Disease-Virus ist. Eine Stammhaltung des Virus, die von der Allantoisflüssigkeit des bebrüteten Hühnereies herrührte, wird auf ein Brutei, auf die Zelle IB-RS-2 und auf die Zelle BHK-21 übertragen. Für jede Verdünnung wurde die Anwesenheit des Virus durch Ermittlung des zytopathogenen Effekts für die Zellen und durch das Hämagglutinationsvermögen der Flüssigkeiten der Zellkultur und der Allantoisflüssigkeit bestimmt. Die Infektiösität wurde nach der Methode der kumolierten Summen gemäß REED und MUNCH berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.
Titer bestimmt durch
Zytopathogenen Effekt . Hämagglutinations· vermögen
BHK lo7'85 lo7'8
IB-RS-2 lo8'5 lo8'5
Brutei " lo8'6
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- 2ο -
Ein virulenter Virus in Form der Allantoisflüssigkeit des infizierten bebrüteten Hühnereies wurde auf Monoschichten von IB-RS~2-Zellen gezüchtet, um das für die Herstellung der inaktivierten Vakzine bestimmte Antigen zu gewinnen. Von der Anmelderin wurde zunächst gefunden, daß das Virus-Inokulum (infektiöse Allantoisflüssigkeit) in geeigneter Weise verdünnt werden mußte, um die Autointerferenzerscheinungen zu vermeiden und eine optimale Vermehrung des Virus zu erzielen. Die Werte in der fol-
-4 genden Tabelle zeigen, daß die Verdünnung von Io sehr günstig für die Erzielung einer hohen Vermehrungsgeschwindigkeit des Virus ist.
—1 -2 -"5 -4 Verdünnung des Virus im Inokulum Io Io Io ^ Io
Inokulum 48 Stunden bei J57°C ge- '
halten		 lo7'5 lo^'8 lo6 nicht lo^
bestimmt
5o ^-Letaleffekt beim Brutei lo5'5 lo4'2 I/I28 lo3 lo1'8
50 #iger zytopathogener Effekt
bei der Zelle BHK 21		 I/256 I/128 1/4 < 1/2
Hämagglutinationsvermögen Flüssigkeit IB-RS-2
Nach 48 Stunaen gewonnene virulente lo?'1 nicht lo7'9
bestimmt
50 % Letaleffekt beim Brutei lo*'1 nicht lcP'5
bestimmt
50 #iger zytopathogener Effekt
bei der Zelle BHK 21		 I/256 I/I28 I/128
Hämagglutinationsvermögen
Rotierende Kolben, die eine Monoschicht der Zellen IB-RS-2 trugen, wurden mit 5° ml Kulturmedium geimpft, das als
-4
Impfvirus eine auf Io verdünnte virulente Allantoisflüssigkeit trug, die einen infektiösen Titer von Io '■> für das Brutei hatte.
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-4
Mit dem gleichen Virus, der auf Io in einer Kulturflüssigkeit verdünnt war, wurde ferner eine Reihe von IjJ Tage bebrüteten Eiern über die Allantoishöhle infiziert. Nach 48 Stunden wurden die beiden virulenten Flüssigkeiten gewonnen und in den oben beschriebenen Tests verglichen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.
Hämagglutinationsvermögen
50 $iger zytopathogener Effekt für die Zellen IB-RS-2
5o #-Letaleffekt für das Brutei
Allantois-
flüssigkeit		 Kulturflüssigkeit
IB-RS-2
I/8000 I/500
lo7'5 lc,™
lo8'5 Ιο?'6
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Zelle IB-RS-2 ein ausgezeichnetes Substrat für die Vermehrung des Newcastle Disease-Virus darstellt, und daß ohne vorherige Adaption bei der ersten Kultur mit dieser Linie eine virulente Flüssigkeit erhalten werden kann, die die gleiche Infektiosität wie eine Allantoisflüssigkeit hat.
Die in dieser Weise erhaltenen beiden Viruspräparate wurden mit ß-Propiolacton inaktiviert, worauf 2 #iges Aluminiumhydroxyd (ausgedrückt als Al2Ch5) in einer Menge von 50 Vol.-# zugesetzt wurde. Hierbei wurden zwei Vakzinen erhalten, mit denen Gruppen von jungen Hühnern geimpft wurden, denen jeweils 1 ml subkutan injiziert wurde. 3 Wochen später wurden die Tiere in Gruppen zu zehn mit verschiedenen Verdünnungen des Newcastle Disease-Virus (von Io bis Io ) infiziert. In beiden Fällen, d.h. bei beiden Vakzinen, wurden sämtliche Tiere geschützt, während
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die Vergleichstiere durch die Infektion eingingen.
Es wurde ferner festgestellt« daß es möglich ist, die Zelle IB-RS-2 für die Züchtung von abeschwächten Newcastle Disease-Viren, z.B. des Virus Hi tenner B. zu verwenden. In diesem Fall war der zytopathogene Effekt geringer, aber der durch Ermittlung des Hämagglutinationsvermögens berechnete Titer erheblich:
Zelle IB-RS-S = Infektiosität lo* Zelle BHK-21 = Infektiosität lo1
Beispiel 4· Verwendung der Kulturflüssigkeit der Zelle IB-RS-2 als Lebendvakzine gegen die Schweinepest
Eine Gruppe von Io Schweinen erhält 5 ml der in Beispiel 1 beschriebenen Flüssigkeit, die zur Züchtung der Zelle IB-RS-2 in Monosehieht diente. Während einer Beobacntungszeit von 25 Tagen zeigte keines der Tiere einen Temperaturanstieg. Nacn dieser Zeit erhielten die Schweine 1 ml virulentes Schweineblut, das während der Viräraie entnommen und auf l/lo verdünnt worden war. Nach der Infizierung wurden die Tiere 15 Tage unter Beobachtung gehalten. Keines der Tiere zeigte eine wesentliche Temperaturerhöhung oder ein Anzeichen der Schweinepest.
Beispiel 5 Verwendung von lebenden IB-RS-2-Zellen als Lebendvakzine
gegen Schweinepest
Io Tiere werden unter den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen mit Io χ Io lebenden ZB-3S-2—Zellen pro Tier geimpft. Die Verträglichkeit war vollkommen. Während der
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24 Tage der Immunisierung trat kein wesentlicher Temperaturanstieg auf. Der Schutz gegen eine auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise vorgenommene Virusinfektion war vollständig.
Beispiel 6 Verwendung von lysierten IB-RS-2-Zellen als Lebendvakzine
gegen Schweinepest
Ein durch Gefrieren und Auftauen von IB-RS-2-Zellen erhaltens Lysat in Mischung mit Kulturflüssigkeit wird gefriergetrocknet. Das erhaltene Produkt stellt eine Lebendvakzine gegen Schweinepest dar. Zur Bestimmung des Schutztiters und der Verträglichkeit dieser Vakzine werden Gruppen von je 5 Schweinen mit dieser Vakzine in Ver-
—1 —5
dünnungen von Io bis Iq ■* geimpft. Währund der Immunisierungsdauer zeigt keines der Tiere einen wesentlichen Temperaturanstieg. Anschließend wurde den Tieren 1 ml
virulentes Blut injiziert. Das Schutzvermögen wird mit
-4 4
Io berechnet. Die Vakzine enthält somit Io immunisierende Partikel.
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Claims (13)

- 24 Patentansprüche
1. Verfahren zur Züchtung von Viren, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirtszellen eine Linie von beim Instistut für Biologie von Sao-Paulo isolierten und konservierten und als "Zelle IB-RS-2" bezeichneten Schweinenierenzellen verwendet, die in Monosehieht oder Suspension kultiviert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus der Maul- und Klauenseuche gezüchtet wird.
3· Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Virus der Maul- und Klauenseuche auf Monoschichten der Zellen von 300.000 bis 60Q.000 IB-RS-2-Zellen pro cm Oberfläche züchtet.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beimpfung der IB-RS-2-Zellen Viren verwendet werden, die aus der Lympfe oder dem Blut von infizierten Schweinen stammen und 4 bis 20 aufeinander folgende Passagen auf Zellen, die gegenüber dem Virus der Maul- und Klauenseuche empfindlich sind, durchlaufen haben.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierungsdauer der Viren
von 20 Stunden bei wenig adaptierten Viren (4 Passagen) bis 6 Stunden bei gut adaptierten Viren (20 Passagen) variiert.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Newcastle Disease-Virus kultiviert wird.
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7# Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das vorher in der Zelle vorhandene Virus der Schweinepest gezüchtet wird.
8. Verfahren zur Herstellung einer inaktivierten Vakzine gegen Maul- und Klauenseuche, dadurch gekennzeichnet, daß man die durch Züchtung des Virus nach Anspruch 1 bis 5 erhaltene Virussuspension gewinnt und diese Suspension in an sich bekannter Weise inaktiviert.
9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die inaktivierte Virussuspension mit einem Hilfsöl emulgiert.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hilfsöl ein Gemisch von Polyglykoläthern von Fettalkoholen verwendet.
11. Verfahren zur Herstellung einer inaktivierten Vakzine gegen den Newcastle Disease-Virus dadurch gekennzeichnet, daß man ein virulentes Virus der Newcastle Disease gemäß Anspruch 1 und 6 züchtet, die gebildete Virussuspension gewinnt und in an sich bekannter Weise inaktiviert.
12. Verfahren zur Herstellung einer abgeschwächten Lebendvakzine gegen die Newcastle Disease, dadurch gekennzeichnet, daß man ein abgeschwächtes Virus der Newcastle Disease gemäß Anspruch 1 und 6 züchtet und
die gebildete Virussuspension gewinnt.
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13. Verfahren zur Herstellung einer abgeschwächten Lebendvakzine gegen die Schweinepest, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zelle IB-RS-2 in Monoschichten oder in Suspension kultiviert und die einen abgeschwächten Virus der Schweinepest enthaltende Kulturflüssigkeit gegebenenfalls nach Lyse der Zellen gewinnt.
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