NL8801601A

NL8801601A - Een "swine-kidney" celcultuur, geschikt voor het kweken van virussen, een daaraan geadapteerde "chinese" stam van het varkenspestvirus, alsmede de hiervan afgeleide vaccins.

Info

Publication number: NL8801601A
Application number: NL8801601A
Authority: NL
Original assignee: Centraal Diergeneeskundig Inst
Priority date: 1988-06-23
Filing date: 1988-06-23
Publication date: 1990-01-16
Also published as: DE68904131D1; ES2052883T3; EP0351901B1; GR3006970T3; DE68904131T2; EP0351901A1; ATE83929T1

Description

Een "swine-kidney" celcultuur, geschikt voor het kweken van virussen, een daaraan geadapteerde "Chinese1’ stam van het varkenspestvirus, alsmede de hiervan afgeleide vaccins.

De uitvinding heeft betrekking op een "swine-kidney" celcultuur, welke geschikt is voor het kweken van virussen.

Voor de bestrijding van varkenspest wordt in verschillende Europese, Aziatische en Zuidamerikaanse landen tegenwoordig gebruik gemaakt van vaccins op basis van de zgn. "Chinese" (C-)-stam van het varkenspestvirus. Het is een aan konijnen geadapteerde virusstam, welke enerzijds een grote immuniteit ten aanzien van het varkenspestvirus en anderzijds nagenoeg geen gevaar voor de gezondheid van de behandelde varkens oplevert. Deze stam is in de vijftiger en zestiger jaren in Taiwan ontwikkeld (Lin, T.T.C. and Lee, R.C.T., 1981, An overall report on the development of a highly safe and potent lapinized hog cholera virus strain for hog cholera control in Taiwan; Nat. Sci. Council special publ. 5, 1-42) en heeft via Vietnam en de Chinese Volksrepubliek Hongarije bereikt (Bognar, K. and Meszaros, J, 1963, Experiences with a lapinized hog cholera virus strain of decreased virulence; Act. Vet. Acad. Sciï Hung·, 13: 429-438). Van hieruit is het naar verschillende Oost- en Westeuropese landen verspreid.

Als grondstof voor de bereiding van het vaccin op basis van de "Chinese" stam worden milt en lymfeklieren van met dit C-virus geïnfecteerde konijnen gebruikt. Een konijn levert circa 250-500 doses gevriesdroogd produkt op. Ten tijde van de laatste varkenspestepidemie in Nederland (1983-1986) werd circa 80% van de nationale varkensstapel tegen varkenspest gevaccineerd. Op basis van het aantal slachtdieren van 19 x 10 bedroeg het aantal varkenspestvaccinaties op jaarbasis 16,7 x 106. Voor de herenting van fokgelten werden nog eens 650.000 doses gebruikt. Voor de produktie van de Nederlandse behoefte van 17,3 x 10^ doses varkenspestvaccin per jaar waren alleen reeds 17,3 x 10 : 500 = 34.600 konijnen nodig.

Mede gezien het grote konijnenverbruik zijn velerlei pogingen ondernomen om het voor de vaccinbereiding benodigde C-virus in een andere gastheer of in celcultures te kweken, maar deze zijn door de lage opbrengst of door contaminatie van de primaire celcultures niet succesvol geweest. Bijvoorbeeld leken J. Biro c.s., (Acta, Vet. Acad. Sci. Hung, 16, 293-300, 1966) er aanvankelijk in te zijn geslaagd het virus van de Chinese stam van het varkenspestvirus, dat op basis van productie in konijnen door het hongaarse instituut "Phylaxia" als vaccin onder de naam "Suvac" in de handel wordt gebracht, aan schapen te hebben aangepast. Echter verloor deze geadapteerde stam na 30 passages zijn patho-geniteit voor konijnen en zijn immuniserend vermogen in varkens (zie Tabel II op blz. 296) en is sindsdien hierover niets meer vernomen.

In Ree. Med. Vet. 147, 937-953, 1971 wordt de aanpassing van de Chinese stam van het varkens pest virus aan primaire lammerniercellen beschreven, waarbij de zeventiende passage als seedlot wordt gebruikt. Over de eigenschappen van deze CL-stam, welke door IFFA-Merieux onder de naam "Pestiffa" in de handel wordt gebracht, is regelmatig in Rev.Med. Vet. gepubliceerd. Echter is gebleken, dat een partij vaccin op basis van deze CL-stam gecontamineerd was met het bovine virus diarree virus, hetgeen de oorzaak was van de geboorte van dode en zieke biggen en het afslachten van enkele fokbedrijven; Wensvoort, G. and Terpstra, C. Bovine viral diarrhea infections in piglets born from rows vaccination against swine fever with contaminated vaccine (Res. Vet. Science, in press).

Voorts is er door Kasza, L., c.s. een "swine kidney” (SK-6) cellijn ontwikkeld uit de nieren van een zes maanden oud slachtvarken: ("Establishment, viral susceptibility and biological characteristics of a swine kidney cell line SK-6"; Res. Vet. Sci:, 13: 1972^ 46-51). Deze cellijn werd als monolayer (SK6-M) gekweekt op een vaste bodem. Het ROVAC-virus vermeerderde zich in dit celsysteem zonder dat daarbij een zichtbaar cytopathologisch effect (CPE) werd waargenomen. Uit onderzoek van Aanvraagster is gebleken, dat ook het in konijnen geattenueerde virus van de C-virus-stam zich in SK6-M cultures vermeerderde, eveneens zonder dat daarbij een CPE optrad. De virusopbrengst bleef evenwel laag zoals blijkt uit de groeicurve van de zesde viruspassage op SK6-M (Tabel A). De adaptatie van C-virus aan SK6-M werd daarom niet verder voortgezet.

TABEL A. Groei na 6 passages van C-virus op SK6-M cellen.

Uren na Log plaqueforming units/ml

Datum besmetting supernatant celpellet 23.04.85 24 1.5 .<1.3 24.04.85 48 ^1.3 <1.3 25.04.85 72 1.8 <1.3 26.04.86 96 2.8 <Ί.3

Daar het monolayer-systeem voor het kweken van virussen velerlei nadelen in zich bergt, alsook het gebruik van veel proefdieren ten behoeve van de bereiding van vaccins in maatschappelijk opzicht steeds minder aanvaardbaar wordt geacht heeft Aanvraagster getracht de cellen van de bovenvermelde SK6-M-cultuur op een zodanige wijze te adapteren, dat deze in een syspensiecultuur kunnen groeien.

Na langdurig experimenteel onderzoek is Aanvraagster na menige mislukking er verrassenderwijs toch in geslaagd de uit de stand der techniek bekende swlne-kidney-cellen (SK6-cellen) zodanig te adapteren, dat deze in suspensie kunnen groeien. Meer in het bijzonder is de aanpassing van de cellijn van monolayer- tot suspensie-cultuur met behulp van een verrijkt Eagles minimum essential medium onder toepassing van verscheidene "passages" uitgevoerd. De samenstelling van het hierbij toegepaste verrijkte Eagle's minimum essential medium was als volgt:

De gewichten en volumina van de ingrediënten zijn gebaseerd op de bereiding van 100 1.

1. L-Arginine HCL, FBZa); art. 1543 3,82 g 2. L-Glutamine; Ajinomoto 26,55 g 3. L-Histidine HC1 H20 FBZ; art. 4350 2,13 g 4. L-Isoleucine FBZ; art. 5362 4,82 g 5. L-Leucine FBZ; art. 5360 4,82 g 6. L-Lysine HCl, FBZ; art. 5700 6,64 g 7. L-Fenylalanine, FBZ; art. 7256 3,00 g 8. L-Methionine, FBZ; art. 5707 1,37 g 9. L-Threonine, FBZ; art. 8411 4,37 g 10. L-Tryptofaan, FBZ; art. 8374 0,73 g 11. L-Tyrosine, FBZ; art. 8371. 3,28 g

Afzonderlijk opgelost bij 70°C

12. L-Valine, FBZ; art. 8495 4,28 g 13. Inositol Merck, art. 4731 NF X 11 0,32 g 14. D (+) Ca-Pantothenaat, FBZ; art. 2316 0,20 g 15. Thiamine HCl, Ph VIIIb^ 0,20 g 16. Folinezuur, ICN, cat.nr. 101725 0,18 g 17. Pyridoxal. HCl, FBZ, art. 7523 0,23 g 18. Nicotinamide, FBZ; art. 6818 0,18 g 19. Choline chloride DAB 8; Merck art. 500117 0,21 g 20. Riboflavine, FBZ; art. 7609. 0,02 g

Afzonderlijk opgelost in 1M Na0Hc^ en toegevoegd.

21 L-Cysteine FBZ; art. 2837 2,18 g 22. NaCl, Ph VIII 594,00 g 23. KC1, p.a. 36,35 g 24. CaCl2.2H20, p.a. 24,15 g 25. MgS04.7H20, p.a. 18,20 g 26. NaH2P04.2H20, p.a. 12,75 g 27. Fe (N03).9H20, p.a. 9,1 ml

Afzonderlijk opgelost als 0,1% en daarna aan 1-26 toegevoegd 28. Fenol rood Merck, art. 7241 1,35 g 29. NaHC03, p.a. 250,00 g 30. D (+) glucose. 1H20 voor parenteraal gebruik Ph Eur. 450,00 g 31. Pepton, Oxoid, code L37 200,00 g 32. LAH, ICN cat.nr. 102131 150,00 g 33. Tryptose-fosfaat 150,00 g

Antibiotica 34. Benzyl penieilline-natrium Ph VIII 10,00 g 35. Streptomycine sulfaat Ph VIII 10,00 g 36. Neomycine sulfaat Ph VIII 10,00 g

Ingrediënten 1-21 worden in Ongeveer tweederde van het eindvolume opgelost. Daarna worden achtereenvolgens 22-25, 26-29 en daarna 30-36 toegevoegd.

(a) FBZ: ”Für biochemische Zweeke", fabr. Merck Darmstadt;

(b) Ph VIII voldoet aan de vereisten vermeld in de Nederlandse Pharmacopeia, ed. VIII

(c) NaOH purum, EKA Ab Zweden

Bij het kweken in suspensie werd uitgegaan van getrypsiniseerde SK6-M-cellen van een "onbekend" passageniveau. Alhoewel bij suspensie— systemen sprake is van een continu-kweek wordt, analoog aan monolayer— cultures, met een passage een groeicyclus van de cultuur bedoeld. Na een groeicyclus werden de cellen afgezogen en aan een volgende groeicyclus in een verversd groeimedium onderworpen. Na een twintigtal "passages" £ werd een cultuur met een celconcentratie van 1.5 x 10 cellen/ml verkregen.

De uitvinding heeft derhalve betrekking op SK6-cellen, welke in suspensie kunnen groeien. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op SK-6-cellen, welke bij het Instituut Pasteur onder nummer i-768 zijn gedeponeerd. Als voordelen van de SK6-suspensiecultuur (SK6-S) ten opzichte van de SK6-monolayercultuur worden de belangrijk verhoogde opbrengst per vol. eenheid alsook de eenvoudige resp. regelbare procesvoering genoemd.

De SK6-S-cultuur volgens de uitvinding kan voor menig virus, eventueel na adaptatie, als groeisubstraat worden toegepast. Als voorbeelden van dergelijke virussen worden de "Chinese" stam van het varkenspest-virus en het Aujeszky-virus genoemd.

Meer in het bijzonder kan het bovenvermelde nadeel van een onvoldoende virusopbrengst bij een aan konijnen geadapteerde C-vaccinstam in een SK6-M-celcultuur worden opgeheven door toepassing van een celcultuur van de SK6-S-cellijn, waarin een daaraan geadapteerde "Chinese" stam van het varkenspestvirus persisteert, zoals gedeponeerd bij het Xnstitut Pasteur onder nummer i-767.

Het wordt zeer wel mogelijk geacht dat het aan SK6-S cellen geadapteerde C-virus nog in talloze andere zoogdiercellen te vermeerderen is waarbij, in tegenstelling tot hetgeen wordt gezien hij het uitgangs-virus, hoge virusopbrengsten worden verkregen. De uitvinding heeft derhalve tevens betrekking op het kweken van het SK6-S geadapteerde C-virus volgens de uitvinding in monolayer- en suspensie-cultuursystemen van alle zoogdiercellen. Gebleken is namelijk, dat het aan SK6-S geadapteerde C-virus volgens de uitvinding, in tegenstelling tot het aan konijnen geadapteerde en als uitgangsvirus toegepaste C-virus, zich uitstekend in SK6-M-cellen kan vermeerderen.

Deze toename en het gegeven dat het virus op PK15 cellen kan worden getitreerd, vormen het bewijs dat het C-SK6-S virus zich in PK15 cellen kan vermeerderen. Het uit konijnen afkomstige uitgangsvirus vermeerdert zich daarentegen niet in PK15 cellen. De eigenschap dat C-SK6-S virus op PK15 cellen kan worden gekweekt, kan derhalve als een "marker" voor het geadapteerde vaccinvirus volgens de uitvinding worden beschouwd.

Inzake de karakterisering van het C-SK6-S "seedlot'' virus volgens de uitvinding is nagegaan in hoeverre het "seedlot" virus ten opzichte van het in konijnen geproduceerde uitgangs- of "moeder"-virus is veranderd. Daartoe werd een suspensie van 4 x 10? PK15 cellen in 20 ml groeimedium simultaan besmet met 2 x lO^TCH^o van het seedlot virus (MOI = 1:200). Nadat de cellen in drie dagen waren uitgegroeid tot een monolayer werd deze met het bovenstaande medium ingevroren (-20°C) en ontdooid, waarna de suspensie op PK15 cellen werd getitreerd. De virustiter van de suspensie bedroeg IQ·* * *TCID5Q/ml .

De totale opbrengst was derhalve 20x10'’** = 2x10^'^TCID^Qj d.w.z. een toename van 2_x IQ6*1 ofwel een faktor 12>5 .

2 x 105

Het aan SK6-S geadapteerde C-virus volgens de uitvinding is op grond van de bovenvermelde verschillen van het in konijnen geproduceerde C-virus te onderscheiden. Hiertoe staan in principe twee wegen open, welke door Aanvraagster nader zullen worden onderzocht: 1) Differentiatie van de twee virussen op eiwit-niveau.

Tegen het C-SK6 "seedlot" virus is een panel van 12 monoclonale anti-lichamen (MCA’s) bereid. Aanvraagster zal aan de hand van nader onderzoek nagaan of deze MCA’s het gewenste onderscheid tussen de twee virussen mogelijk maken.

2) Differentiatie van de twee virussen op genoom-niveau.

Aanvraagster is erin geslaagd het genoom van de virulente Brescia stam van varkenspestvirus over zijn gehele lengte te doneren in de vorm van elkaar overlappende cDNA fragmenten. Eind 1988 zal het RNA van deze virusstam zijn gesequenced. Door middel van kruishybridisa-tie van in konijnen geproduceerd C-virus RNA en de cDNA clonen enerzijds, en van in SK6-S cellen geproduceerd C-virus RNA en cDNA clonen anderzijds, wordt het mogelijk geacht om verschillen in de nucleoti-de-sequenties van de twee virussen op te sporen.

Adaptatie van de "Chinese" stam van het varkenspestvirus aan de SK6-S-cellijn respectievelijk de vaccinbereiding ervan.

Voor de adaptatie van dit C-virus aan de bovenvermelde, bij het Instituut Pasteur gedeponeerde SK6-S-cellijn werd een 50 ml cultuur met een concentratie van 5 x 10^ SK6-S cellen/ml geïnfecteerd met 2 ml van een 10% konijne-miltsuspensie. De titer van de miltsuspensie bedroeg 105 konijn ID50/111I. Na besmetting werd de cultuur op gezette tijden bemonsterd. Met een vitaal kleuring werd de verhouding van levende en dode cellen vastgesteld en middels immunofluorescentie werden de cellen onderzocht op aanwezigheid van varkenspest-antigeen. Vanaf het begin van de besmetting trad een verhoogde sterfte van de cellen op, doch door tijdig de overlevende cellen door middel van centrifugatie te pelleteren en van nieuw medium te voorzien, kon de cultuur in stand worden gehouden. Na 15 suspensiedagen waarin de cultuur zesmaal van vers medium werd voorzien (= 6 "pasages") nam de celsterfte af. Tegelijk hiermee nam het deel van de SK6-S cellen dat op basis van een immunofluorescentie test (1FT) met C-virus geïnfecteerd bleek te zijn toe van £1% tot > 50% (Tabel B).

TABEL B.

Aanpassing C-virus aan SK6-suspensie-cultuur.

Passage IFT Opmerkingen

Datum nr»__ 25.03.85 1 + (CPE) Dag 2 enkele pos. cellen 28.03.85 2 + (CPE) Zeer veel dode cellen 29.03.85 3 + (CPE) Enkele pos. cellen 01.04.85 4 + Enkele pos. cellen 03.04.85 4 + Enkele pos. cellen 04.04.85 5 + Iets meer cellen 09.04.85 6 4+ Meer pos. cellen, contr. neg.

10.04.85 7 ++ Meer pos. cellen, contr. neg.

11.04.85 8 ++ Iets minder dan pass. 6 een enkele pos. cel 12.04.85 8 + Cellen naar 300.000/ml gebracht 15.04.85 9 +4+ 16.04.85 9 4++ 17.04.85 9 II1 19.04.85 9 +++ 22.04.85 10 4+4+ 23.04.85 11 -H-f I 75% v/d cellen geïnfecteerd 24.04.85 11 +++ Celgroei wat minder 26.04.85 +4++ Fluorescentie zwakker 01.05.85 12 +4++ Zwakke fluorescentie wel vrij vol 03.05.85 13-1 4+4+ Zeker 80% v/d cellen geïnfecteerd 03.05.85 13-2 4+4+ 06.05.85 14-1 4+4+ Vrij vol 06.05.85 14-2 4+4+ Vrij vol

10.05.85 15 groot 414I

10.05.85 15 klein 4141 13.05.85 16 1+; 2-; 3+; 1 t/m 5 44++ en 54+ 17.05.85 17 Grote en kleine partij - : geen positieve cel/cupje + : ^ 1 positieve cel/cupje + : >1 positieve cel/cupje, maar <1 positieve cel/gezichtsveld 4+ : 2-10 positieve cellen/gezichtsveld 4++ ; 11-100 positieve cellen/gezichtsveld ++H-: >100 positieve cellen/gezichtsveld

Titraties, uitgevoerd op SK6-M cellen in microtiter systeem, leverden echter de eerste 10 "passages" geen aanwijsbare virustiter op, waarschijnlijk omdat het C-virus nog onvoldoende was geadapteerd om zich in SK6-M-cellen te kunnen vermeerderen. In "passage" 11 werd met dit systeem wel virus aangetoond. Van deze "passage" werd een groeicurve van het virus bepaald. Na 24 uur werd een titer van 10^·*^ 50% tissue culture infective doses (TCID50) Per ml gemeten. Na 48, 72, 96 en 120 uur bedroeg de virustiter respectievelijk 104*^, ΙΟ·**4, ΙΟ5,5 en ΙΟ4,9 TCID50/ml.

Nadat 17 "passages" waren bereikt werd met virus van "passage” 11 een nieuwe reeks gestart, waarbij behalve de celconcentratie en bet percentage ÏFT-positieve cellen tevens de virustiter nauwlettend werd gevolgd (Tabel G). Hierbij trad opnieuw een CPE op met als gevolg een verhoudingsgetal van levende:dode cellen van kleiner dan 1. Het CPE-feno-meen is even zovele malen opgetreden als er C-virus, al dan niet gekweekt op SK6-S, aan onbesmette SK6-S cellen werd toegevoegd. Vanaf "passage" 14 nam het percentage IFT-positieve cellen snel toe en werd een stabiele (CPE-resistente) celpopulatie uitgeselecteerd. Deze celpo-pulatie (C-SK6-S) is persisterend met C-virus geïnfecteerd en produceert continu celvrij virus. Ondanks de persisterende infectie bezit de C-SK6-S cel het vermogen om zich in suspensie te vermeerderen.

Tabel C.

Overzicht passage C-virus op SK6-suspensie cultuur

Passage Dagen Celconcentratie % cellen Titer Opmerkingen na xlO^/ml IFT- log^g/ door- levend dood positief ml _zetten_ 11 3 0.78 105*5TCID50 in 50ml 12 1 0.36 0.55 <1 2.8 13 2 0.44 0.84 <1 2.8 14 3 0.65 0.85 5-10 2 0.58 0.78 85 5.3 3 0.70 0.53 50% vers medium 15 4 0.83 0.31 85 5.0 16 3 0.98 0.31 15 3-7 17 4 1.12 0.50 20 4.6 18 3 1.29 0.43 80 4.9 19 4 1.13 65 4.5 20 3 0.74 0.30 75 5.0 21 3 1.14 80 5.0 22 4 1.66 80 4.9 23 4 0.63 75 4.9 24 3 0.19 0.65 75 4.9 25 4 0.64 70 5.1 26 3 1.03 0.27 45 4.8 27 4 0.95 0.40 80 5.6 28 3 1.52 90 4.7 29 4 1.16 90 4.5 30 3 1.23 5.3

Vanaf "passage" 14 nam de virustiter eveneens abrupt toe tot circa 10^TCID5o/ml celvrij medium (Tabel C). De persisterende geïnfecteerde C-SK6-S cultuur is tot "passage" 30 doorgezet. Hierbij nam de virustiter niet verder toe.

Om de veiligheidsmarge van het geadapteerde virus te bepalen werd de produktie van "passage" 30 van de C-SK6-S cellijn gecontroleerd op afwezigheid van viruscontaminanten en op werkzaamheid in SPF-varkens. Het produkt van deze passage bleek in de geënte varkens apathogeen. Het induceerde geen antilichamen tegen andere pathogene varkensvirussen, zoals bovine virus, diarree virus, mond- en klauwzeer virus typen A, 0 en C, porcine parvo virus, transmissible gastroenteritis virus, vesiculaire varkensziekte virus en het virus van de ziekte van Aujeszky, maar beschermde de dieren wel tegen een challenge met virulent varkenspest-virus.

Normaliter wordt een vaccinvirus na adaptatie aan het celsysteem apart als "seed lot virus" ingevroren. Voor het bereiden van een partij vaccin dient dan eerst het celsysteem te worden aangekweekt, waarna het virus opnieuw moet adapteren. Het invriezen van de virus-celcombinatie volgens de uitvinding heeft als voordeel dat de eigenschappen van het symbiotische virus-cel-systeem maximaal worden geconserveerd. Een laag 'passage" niveau van de virus-cel-combinatie heeft enerzijds het voordeel, dat de biologische eigenschappen van het C-SK6-S virus ten opzichte van het uitgangsmateriaal (konijne C-virus) zo weinig mogelijk zijn veranderd en anderzijds het voordeel dat de veiligheidsmarge ten opzichte van "passage" 30 zo groot mogelijk is.

Daarom werd, nadat de werkzaamheid en onschadelijkheid van het door "passage" 30 geproduceerd virus was vastgesteld, nogmaals een SK6-S cultuur besmet met het virus van "passage" 11. Daartoe werd 1Ο^’^ΤΟΠ>50 van het 72 h monster van "passage" 11 toegevoegd aan een 300 ml cultuur van SK6-S. Het verloop van de kweek is samengevat in Tabel D.

TABEL D

Bereiding van "master cell seed" en "seedlot virus” van C-SK6-S

Passage Dagen Vol. Celconcentratie % cellen Titer Opmerkingen na ltr. xlO^/ml IFT- ^og10/ door- datum_nr. zetten_levend dood positief ml 27.01.86 11 0.3 0.2 31.01.86 12 4 0.3 0.9 0.14 65 03.02.86 13 3 0.3 0.78 - 35 07.02.86 14 4 2x0.3 1.40 - 50 10.02.86 15 3 3 0.43 - 75 13.02.86 16 3 3 0.81 - 90 uitsluizen 17.02.86 17 4 8 21.02.86 18 4 45_5^6_

Van "passage” 18 zijn 90 ampullen met circa 6 x 10? C-SK6-S cellen in 10% DMS0 (dimethylsulfoxide) ingevroren in vloeibare N2· Eén ampul van dit "master cell seed" is bestemd voor het starten van een nieuwe produktieserie. Tevens is circa 40 1 celvrij groeimedium van "passage” 18 als "seedlot" virus in vloeibare N2 opgeslagen. Deze partij met een virustiter van IO^'^/TCID^q/™! kan worden gebruikt als zaai-virus voor een eventuele nieuwe passage-reeks en/of voor het bereiden van partijen eindprodukt. Dit C-SK6-S "seedlot" virus is gedeponeerd onder nummer i-767 bij het Instutuut Pasteur.

Als kwaliteitseigenschappen van het C-SK6-S "seedlot" virus volgens worden genoemd: 1) Onschadelijk voor varkens - Het "seedlot" virus is bacteriologisch, mycologisch en mycoplasmo-logisch steriel.

- Het "seedlot" virus is door middel van een herhaalde intramuscu-laire toediening in gevoelige varkens gecontroleerd op virologische zuiverheid ten aanzien van Afrikaanse varkenspestvirus, bovine vi-rusdiarree virus, mond- en klauwzeervirus typen A, 0 en C, porcine enterovirus serotypen 1 en 2, porcine parvovirus, transmissible gastroenteritis virus, vesiculaire varkensziekte virus en het virus van de ziekte van Aujeszky. Het "seedlot" virus bleek na onderzoek geen antistoffen tegen de genoemde virussen te hebben geïnduceerd.

- Het "seedlot” virus veroorzaakt in varkenspest-gevoelige varkens geen ziekteverschijnselen of andere ongewenste neveneffecten zoals groeivertraging en leucopenie, ook niet indien de varkens werden behandeld met corticonsteroïden.

- Spreiding van het "seedlot” virus van geënte varkens naar ongeënte contactdieren is niet vastgesteld.

- Na enting van zeugen gedurende de eerste 35 dagen van de dracht met een hoeveelheid "seedlot" virus equivalent aan 400 doses vaccin werd geen transuterine overdracht van vaccinvirus vastgesteld.

2) Stabiliteit en houdbaarheid na vriesdrogen - Na toevoeging van lactose 5% aan het "seedlot" virus kon dit worden gevriesdroogd zonder een meetbaar verlies aan infectiositeit. Het gevriesdroogde produkt is bij 4eC en —20eC tenminste twaalf maanden houdbaar.

3) Werkzaamheid - Met "seedlot" virus gevaccineerde varkens zijn na zeven dagen bestand tegen een intramusculaire besmetting met 10^*^ letale doses (LD50) van een virulente varkenspestvirus stam.

- De immuniteit duurt tenminste zes maanden.

Claims

1. Cellen van de "swine-kidney" SK6-eellijn, welke in een suspen-sieeultuur kunnen groeien.

2. Cellen van de "swine-kidney" SK6-cellijn volgens conclusie 1, zoals gedeponeerd bij het Institut Pasteur onder nummer i-768.

3. Cellen van de "swine-kidney" SK6-cellijn volgens conclusie 1 of 2, waarin persisterend een daaraan geadapteerde "Chinese” stam van het varkenspestvirus, welk virus gedeponeerd is bij het Instituut Pasteur onder nummer 1-767.

4. Werkwijze voor het kweken van virussen, zoals het Aujeszky-virus, met behulp van een cellijn, met het kenmerk, dat men daarbij de "swine-kidney" SK6-cellijn volgens conclusie 1 of 2 toepast.

5. Vaccin, afgeleid van het in conclusie 3 gedefinieerde produkt resp. volgens conclusie 4 verkregen produkt.

6. Aan de SK6-cellijn volgens conclusie 1 of 2 geadapteerde "Chinese" stam van het varkenspestvirus, zoals gedeponeerd bij het Instituut Pasteur onder nummer i-767.

7. Werkwijze voor het kweken van de in conclusie 6 gedefinieerde "Chinese" stam van het varkenspestvirus onder toepassing van op zoog-diercellen gebaseerde cultuursystemen.

8. Vaccin, afgeleid van het produkt, verkregen onder toepassing van de in conclusie 7 beschreven werkwijze.