CN104174018B - 一种鸡肿头综合症疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种鸡肿头综合症疫苗及其制备方法，从而弥补现有技术的不足。本发明的鸡肿头综合症疫苗，是以保藏编号为CGMCC？No.9001的禽肺病毒为抗原制备的。发明疫苗所使用的禽肺病毒具有安全性好，免疫原性高的特点。本发明的疫苗能提高SPF鸡的抗体，预防禽肺病毒引起的肿头、产蛋率下降等症状，此疫苗具有高效、安全性好的优点。使用效果表明，疫苗在14天就能达到100％阳性，而进口苗只有40％。且抗体均值本发明的疫苗达到5.7496，而进口苗为0.08707；21天抗体均值本发明的疫苗为11.9466，而进口苗为1.6595，高于国外疫苗5～10倍。

Description

一种鸡肿头综合症疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种鸡肿头综合症疫苗及其制备方法。

背景技术

鸡肿头综合症(SwollenHeadSyndrome，SHS)是由禽肺病毒(AvianPneumovvirus，APV)引起并继发致病性大肠杆菌等感染的一种鸡的传染病，以肿头和特征性神经症状为主要特征，产蛋鸡还可发生产蛋下降，孵化率降低等特征。

禽肺病毒(APV)是火鸡鼻气管炎(TRT)和鸡肿头综合症感染的病原，在鸡感染后通常会发生肿头综合症(SHS)。APV分为A、B、C亚型，先后发生于欧洲、亚洲、南美洲和中美洲，当初根据糖蛋白基因(G)的差异仅发现2个血清型A和B，1996年美国爆发了该病，然后根据基质蛋白基因(M)和融合蛋白基因(F)的差异发现了第三种血清型C。

SHS首先报道于南非(Morley和Thomson,1985)，它是南非经历1971～1972年新城疫(ND)大流行后开始出现的，起初认为是鸡新城疫的继发症，随着新城疫活疫苗的进一步使用，新城疫发生减少了，但这种症状一直到1974年还在广泛流行，而且似乎还在增多。到1979年，这种被看作是继发的综合症欲发展到相当严重程度时，才使人们承认它是一种独立的疾病。而后，英国、法国、荷兰、以色列及亚太地区(中国与日本)也相继报道了该病在各自国家与地区的发生与流行，并展开了病原学、流行病学、病理学、诊断学、免疫学等方面的研究。1993年在澳大利亚悉尼举行的第十届世界禽病会上，本病成为研讨的热点之一。我国近年来河北、山东、广西等地有了本病发生的报道，但还未波及全国。尽管如此，由于我国养禽数量大范围广，卫生管理及疾病预防水平相对比发达国家低，随着地区间的贸易发展，本病随时有波及全国的可能。

SHS主要危害鸡(肉用种鸡、商品蛋鸡、肉鸡均可发生)和火鸡。鸡和火鸡是已知的自然宿主。SHS主要通过接触水平传播，病鸡或康复鸡的消化道和鼻腔分泌物污染饮水及环境而成为传染源，该病传播速度较慢，目前尚无证据表明该病可以垂直传播。

该病出现的第一个症状是喷嚏，一天内发生眼结膜潮红，泪腺肿胀，在以后12～24h，头部开始出现皮下水肿，最先见于眼部周围，继而发展到头部，再波及下颌组织和肉垂。在早期，鸡以爪抓面部，表现出局部瘙痒，接着病鸡精神沉郁，不愿走动，食欲降低，死亡率1％～20％不等，对于肉用种鸡和商品蛋鸡，除观察到头肿现象外，还表现特异的神经症状，除部分病鸡只表现极度沉郁与昏迷外，大部分病例都出现脑的定向障碍，表现形式包括持续和重复的摇头，斜颈，运动失调，行动不稳及角弓反张等。一些鸡头往上仰，呈现“观星状”。病鸡不愿走动，部分鸡只因此不采食而死亡。产蛋鸡的产蛋率和孵化率也下降，但数天后恢复正常。

首先出现的病变是伴随打喷嚏而出现的鸡鼻甲骨黏膜轻微的瘀血，后发展到不严重的广泛的红色至紫色变化，在组织病理上，明显表现上皮变平，纤毛逐渐消失.上皮下充血和淋巴组织增生。上皮下充血与淋巴组织增生还见于浆细胞增多的泪腺。尽管上呼吸道可能观察到轻度瘀血斑点和纤毛运动性降低.但气管在急性期一般没有影响。病鸡肿头是由于眼眶周围皮下水肿并扩张所致。在一些严重病例中，还出现肉髯的发绀与肿胀。肿大的头，剥离皮肤后，可看到皮下组织黄色水肿至化脓，眼睛肉眼病变仍保持正常，但眼睑由于水肿和结膜炎而关闭。疾病的发展可产生气管炎，有时发生肺坏死，组织学检查发现，水肿部位有淋巴细胞和异嗜白细胞集结。

对于肉鸡，SHS的发病年龄在4～7周龄，而以5～6周龄为高峰，对于肉用种鸡和商品蛋鸡则可发生于各种年龄。在不予治疗的情况下，病程大约为10天，如果应用抗生素治疗并改善通风，病程一般可缩短到3～5天。近年来，该病呈慢性流行经过。常持续2～3周。该病发病率从1％～90％不等，肉鸡死亡率1％～20％不等，蛋鸡产蛋量下降2％～40％不等，产蛋鸡死亡率为0％～20％不等，肉用种鸡死亡率0％～10％不等。因此，筛选与免疫原性强的禽肺病毒来制备疫苗就成为免疫领域研究的热点之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡肿头综合症疫苗及其制备方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明的鸡肿头综合症疫苗，是以保藏编号为CGMCCNo.9001的禽肺病毒为抗原制备的。

上述的疫苗为灭活疫苗。

上述的灭活疫苗中禽肺病毒的含量为每毫升10^6.5TCID₅₀。

疫苗所使用的油相为白油95份、硬脂酸铝1份和5份的司本-80。

上述灭活疫苗的制备方法如下：

1)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加5份的司本-80，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；

2)水相制备：将灭活的SHS/B株病毒液加入水中，使每0.2ml水中含SHS/B株病毒含量不低于105.5TCID50；取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入病毒液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解；

3)乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟，乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟完成制备。

本发明疫苗所使用的禽肺病毒具有安全性好，免疫原性高的特点。本发明的疫苗能提高SPF鸡的抗体，预防禽肺病毒引起的肿头、产蛋率下降等症状，此疫苗具有高效、安全性好的优点。使用效果表明，疫苗在14天就能达到100％阳性，而进口苗只有40％。且抗体均值本发明的疫苗达到5.7496，而进口苗为0.08707；21天抗体均值本发明的疫苗为11.9466，而进口苗为1.6595，高于国外疫苗5～10倍。

附图说明

图1：SHS/B株的F基因的序列进化树分析图；

图2：SHS/B株的情缘关系比较图；

图3：筛选毒株基因序列变异位点；

图4：疫苗免疫后抗体阳性率对比图；

图5：免疫后抗体滴度值对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

一、禽肺病毒株的筛选及检测

1、毒株的筛选

从山东某鸡场发生鸡肿头综合症的鸡群中分离病原，个别鸡只病变表现典型，出现肿头症或面部蜂窝组织炎，眼结膜潮红，泪腺肿胀，头部出现皮下水肿，精神沉郁，不愿走动，食欲降低。经调查该鸡场早先免疫过进口厂家相关疫苗。

采集发病典型鸡只的鼻液，死亡鸡只鼻甲骨中的粘性分泌物，进行实验室病毒分离，在病料中分离到禽肺病毒和大肠杆菌、绿脓杆菌等，通过对禽肺病毒的鸡胚增殖、细胞传代培养后，进行分子生物学检测，该病毒为副粘病毒科，肺病毒亚科成员。结合中国家禽养殖现状，饲养密度大，氨气浓度高，卫生条件差的特点，很可能分离到的禽肺病毒在环境因素及疫苗免疫压力的条件下发生了变异，通过RT-PCR扩增，序列比对发现，筛选到的禽肺病毒与基因库中毒株序列比对，主要在268～283位碱基发生变异。该病毒已于2014年3月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9001。

2、筛选毒株的纯化及检测

将筛选的毒株经含2000UI的青链霉素处理后，同时经0.22μm滤器过滤后，接种Vero细胞，培养72～96小时，当80％以上细胞出现细胞病变时，收获病毒液，置-20℃反复冻融3次，用于传代，按上述方法进行传代，每次挑出细胞病变好的作为下次传代物，如此传至3代后，命名为SHS/B株，并进行了保藏(保藏编号：CGMCCNo.9001)。对纯化的毒株进行逐项目检验，检测结果如下：

2、纯化毒株的安全性研究

将毒株(TCID₅₀＝10^6.5/ml)分别作原倍和10倍稀释，即免疫100羽和10羽(按10^3.5TCID₅₀/羽计)，各免疫1日龄SPF鸡10只，同时设5只阴性对照，SPF鸡于负压隔离器中饲养，免疫后观察14天。结果如下：

临床观察：不同剂量免疫鸡均未出现因该病毒引物的肿头、肿脸、流涕、摇头、斜颈、运动失调、食欲减退及精神症状。

病理剖检观察：未见鸡鼻甲骨黏膜瘀血，头面部皮下组织未见黄色水肿及化脓等异常情况。

气管纤毛扫描电镜观察：未见纤毛损伤或停滞摆动，未对鸡呼吸道及黏膜造成损伤。

3、序列比对分析

通过RT-PCR扩增SHS/B株的F基因，与NCBI(美国国家生物技术信息中心)上发布的SHS的相应基因序列比对。

1)基因进化树

从图1、2可以看出，SHS/B株属于在中国流行的B亚型。

2)同源性分析

从图3可以得出：

①.分离株是目前中国流行的B型毒株与传统毒株同源性99.1～99.5％。

②.第268～283区间存在碱基发生变异，导致出现3-5个氨基酸序列上出现变异。推测上述的差异正是导致已有的禽肺病毒疫苗免疫效果不佳的原因所在。

二、鸡肿头综合症灭活疫苗制备工艺流程

1、制苗材料的选择

Vero细胞：选择从ATCC购买的Vero细胞进行培养病毒，该细胞来源清晰，代次明确，细胞状态良好，使用中严格控制代次在25代以内。

2、制苗用毒液的制备

2.1细胞制备从工作细胞库中取出冻存的细胞，置37℃水浴中融化，移入装有含8％新生牛血清的MEM细胞培养瓶中，置37℃温室中培养48小时，至细胞长成致密单层，用含0.25％的胰酶-EDTA消化，按1:3或1:4传代，扩大培养。

2.2细胞扩繁将扩大培养的细胞接种到转瓶中，37℃培养72～96小时，控制转速为8～12转/小时。

2.3接毒及收获当细胞长成良好单层时，弃去培养液，将毒种按维持液(含0.5％小牛血清的MEM)量的1％接种vero细胞，继续培养72～96小时，当80％以上细胞出现细胞病变时，收获病毒液，反复冻融3次，置-20℃以下保存。

2.4灭活将病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。37℃灭活16～18小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)，灭活后的病毒液置2～8℃保存，应不超过1个月。

2.5半成品检验

2.5.1无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

2.5.2病毒含量测定用细胞维持液(含2％小牛血清的MEM培养基)将毒种作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-63个稀释度，接种已长成单层的Vero细胞96孔板，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml。同时设正常细胞对照孔，置37℃、5％CO₂培养箱中培养、观察5日，用Reed-Muench法计算TCID₅₀，病毒含量应不低于10^5.0TCID₅₀/0.1ml。

2.5.3灭活检验取灭活后病毒液，接种已长成良好单层的Vero细胞96孔板，同时设病毒对照和阴性细胞对照，置37℃、5％CO₂培养箱中培养、观察5日，病毒对照孔应出现细胞病变(CPE)，灭活样品与阴性细胞对照孔均应不出现CPE，将样品收集后再接种Vero细胞盲传一代，仍不出现CPE，判为灭活完全。

2.6油佐剂灭活疫苗的制备

2.6.1油相制备取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加6份司本-80，当温度达到115℃时维持30分钟，冷却后备用。

2.6.2水相制备将检验合格的病毒液95份、灭菌的吐温-805份，加入配液罐中，开动搅拌电机搅拌20～30分钟，使吐温-80完全溶解。

2.6.3乳化取油相2份导入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以4000r/min搅拌30～40分钟。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

2.7分装定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。

三、鸡肿头综合症灭活疫苗的检测流程

1.性状检验

外观为乳白色乳剂。

剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第一滴外，均应不扩散。

稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

黏度：按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。

2.装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。

3.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

4.安全性检验用14～21日龄SPF鸡10只，每只胸部肌肉或颈背部皮下注射疫苗1.0ml，观察14日，应不出现由疫苗引起的局部和全身不良反应。

5.效力检验采用血清学方法进行检验

5.1血清学方法用14～21日龄SPF鸡15只，10只颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另5只不免疫作对照。免疫后14天、21天，分别采血，分离血清，用IDEXX公司禽肺病毒(APV)抗体检测试剂盒检测抗体，对照鸡抗体应为阴性，免疫鸡抗体应不低于8/10阳性。

6.甲醛残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。

7.作用与用途用于预防禽肿头综合征。

8.用法与用量颈部皮下或肌肉注射。雏鸡，15日龄以内免疫，每只0.3ml，免疫期为5个月；成鸡，开产前免疫，每只0.5ml，免疫期为6个月。

四、制备的疫苗的效果检测

1、同时取本发明制备的疫苗与同类国外疫苗免疫21日龄SPF鸡，颈背部皮下注射，0.3ml/只并设阴性对照鸡，免疫后14天、21天分别检测抗体，检测结果如下表1。

表1：本发明疫苗与国外同类疫苗的效果比较

注：从上述抗体测定结果可以看出，易邦灭活疫苗优于国外同类疫苗。

①.抗体产生快，14天就能达到100％阳性，有效保护鸡免受病毒侵害。

②.抗体水平高，无论14天、21天，抗体均高于国外疫苗5～10倍。

2、灭活疫苗与国外疫苗免疫保护期比较

同时免疫两种灭活疫苗后，每周采用监测抗体情况，比较两组疫苗抗体阳性率的持续时间，制备抗体消长规律曲线图：从抗体阳性率图3可看出，本发明制备的灭活疫苗免疫后2周即可100％抗体转阳，起到保护，而国外疫苗只有40％抗体转阳，在连续12周的监测中，易邦疫苗抗体能持续稳定的维持在100％阳性上，而国外疫苗最高达到90％阳性，随后一直在70～80％左右。

抗体滴度对比图4可以看出，本发明的肿头灭活疫苗抗体产生较早，抗体滴度平均值较高，第二周即可达到15000，而国外疫苗只达到285，相差40余倍，在随后跟踪监测的12周内，易邦疫苗抗体滴度最高达到35000，随着周龄的增加，缓慢降低，但仍维持在15000以上；而国外疫苗抗体滴度平均值均在5000以下，且从第5周开始呈缓慢下降趋势。

3、攻毒保护效果检测

将易邦疫苗与现在市场使用的进口疫苗同时免疫SPF鸡10只，免疫后21天，通过鼻眼途径攻毒，于攻毒后第3、5、7天分别采集喉头、泄殖腔棉拭子，分离病毒，通过鉴定，结果显示，易邦疫苗免疫组保护率为100％，进口苗保护只有60％，具体数据如下：

表2：免疫攻毒后，不同疫苗保护率

同时，用本发明保藏编号为CGMCCNo.9001的禽肺病毒作为病源进行攻毒实验，对象分别为目前市售的禽肺病毒疫苗和本发明制备的疫苗，结果表明本发明疫苗的免疫效果更好，发病率远低于其市售疫苗(p＜0.05)，上述的结果也表明本发明所筛选的病毒与已报道的禽肺病毒存在遗传背景上的差异。

综上，本发明的肿头灭活疫苗无论从抗体阳性率、抗体产生速度、抗体滴度及攻毒保护效果等方面，本发明的疫苗明显优于同类国外进口疫苗，更适于中国目前养殖市场用于防疫由禽肺病毒引起的鸡肿头综合症。

Claims (4)

1.一种鸡肿头综合症灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗是以保藏编号为CGMCCNo.9001的禽肺病毒为抗原制备的。

2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗中禽肺病毒的含量为每毫升10^6.5TCID₅₀。

3.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中的油相为白油95份、硬脂酸铝1份和5份的司本-80。

4.权利要求1所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包含有如下的步骤：

1)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加5份的司本-80，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；

2)水相制备：将灭活的保藏编号为CGMCCNo.9001的禽肺病毒液加入水中，使每0.2ml水中保藏编号为CGMCCNo.9001的禽肺病毒的含量不低于10^5.5TCID₅₀；取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入病毒液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解；

3)乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟，乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟完成制备。