CN104774796B - 禽致病性大肠杆菌灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，本发明提供一株禽致病性大肠杆菌菌株，为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，其保藏号为CGMCC 10602。本发明还提供一种禽致病性大肠杆菌灭活疫苗，所述的禽致病性大肠杆菌灭活疫苗为O78血清型禽致病性大肠杆菌灭活全菌以及佐剂。本发明对血清O78型禽致病性大肠杆菌强毒菌株攻毒的免疫保护率均达到90％以上。本发明对O78血清型禽致病性大肠杆菌菌株感染具有良好的免疫保护效果。

Description

禽致病性大肠杆菌灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种禽致病性大肠杆菌灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli，APEC)可导致鸡、火鸡及其他禽类的肠道外疾病，如心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎等，甚至引起败血症而急性死亡。APEC不仅危害禽体健康，同时影响了产蛋量和肉用禽的上市时间，并且增加了饲养成本，对养禽业造成了严重的经济损失。
随着我国养禽业的发展，禽大肠杆菌病已成为危害养禽业最严重的细菌性传染病之一。目前在世界范围，禽大肠杆菌病每年导致家禽业高达数亿美元的经济损失。APEC复杂的血清型及广泛的耐药性，一直制约该病的防控。对禽大肠杆菌病的防治除加强管理外，主要采用抗生素等药物进行防治。由于抗生素的大量使用，导致耐药性的出现及禽产品出现药物残留，这不仅关系到养禽业的健康发展，更重要的是关系到食品安全和对人类生存环境的影响。因此，研制禽致病性大肠杆菌疫苗，降低因该病造成的养殖风险，减少抗生素的使用，对于该病的防控和食品安全具有重要的公共卫生意义和良好的社会经济效益。
流行病学调查显示国内外APEC优势血清型中，O78血清型占64.29％，为主要血清型。据Gross、Deb and Harry等研究发现APEC血清O78型所制备的疫苗拥有很好的免疫保护效果。为了更好的防控禽大肠杆菌病的发生，为我国家禽业健康发展提供更有效的保障，本发明对APEC O78型血清型灭活苗进行了研究。迄今国内尚无商品化的O78血清型禽致病性大肠杆菌灭活疫苗。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一株禽致病性大肠杆菌菌株，为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
本发明再一目的在于提供一种禽致病性大肠杆菌灭活疫苗，可用于预防O78血清型禽致病性大肠杆菌感染。
本发明还一目的在于提供一种禽致病性大肠杆菌灭活疫苗的制备方法。
本发明采用如下技术方案：
一株禽致病性大肠杆菌菌株，为大肠埃希氏菌，命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli，已于2015年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC No.10602。
本发明所述禽致病性大肠杆菌菌株在制备疫苗中的应用。
本发明提供一种包含保藏号为CGMCC No.10602的禽致病性大肠杆菌菌株的禽致病性大肠杆菌灭活疫苗。
本发明所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗，灭活的大肠埃希氏菌菌株的抗原含量大于等于1×109CFU/mL。
其中，所述疫苗还包含佐剂，所述佐剂为Montanide ISA 70 VG佐剂或MontanideISA 71 VG佐剂。
所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗中大肠埃希氏菌菌株与佐剂的混合重量比例为3：7。
本发明的另一实施方面，本发明所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1)制备禽致病性大肠杆菌菌株灭活抗原
取所述禽致病性大肠杆菌菌株APCE94接种于LB培养基中培养，并分别进行一级和二级种子繁殖；然后转接培养，并进行灭活处理；
2)配制疫苗
将灭活处理的菌液调至大于等于3.33×109CFU/mL；取灭活菌液与佐剂按比例进行混匀，搅拌并乳化处理，得所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗。
其中，步骤1)中所述转接培养的条件为菌液按1:100转接，37℃震荡培养10h；所述灭活处理采用所述菌液加入体积比0.4％福尔马林，37℃200rpm振荡24h。
步骤2)中，混匀后，进行高速搅拌并乳化处理1分钟/次×2次。
具体地说，本发明所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1)所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗组成菌株灭活抗原的制备，取O78血清型禽致病性大肠杆菌制苗用菌株APCE94接种到LB中复苏后划线接种于LB平板上，置培养箱中37℃培养过夜，挑选菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑特征的单菌落分别进行一级和二级种子繁殖。取新鲜菌液按1:100转接，37℃震荡培养10h，经纯度检验和细菌计数后加入体积比0.4％福尔马林，37℃200rpm振荡24h进行灭活处理；分别取各灭活菌液少量接种于LB平板37℃培养24h，进行无菌检验，应无细菌生长。
2)所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗配制与疫苗乳化，根据细菌计数结果，将APCE94灭活菌液调至大于等于3.33×109CFU/mL；取灭活菌液3份，加入7份Montanide ISA70 VG佐剂或Montanide ISA 71 VG佐剂中混匀，高速搅拌乳化1分钟/次×2次，即为禽致病性大肠杆菌灭活疫苗。
本发明的另一方面，禽致病性大肠杆菌灭活疫苗于LB平板或LB培养基中培养，应无细菌生长，于室温保存6个月或4℃保存1年应无分层现象发生，3倍剂量疫苗接种10日龄易感鸭安全，易感鸭分别用免疫剂量(0.5mL)于5日龄和15日龄颈部皮下接种后，应产生1:400以上针对APCE94的血清抗体，对O78血清型禽致病性大肠杆菌APCE93、APCE94、APCE11的攻毒保护率为90％以上。
本发明的有益效果为：
本发明对筛选获得的制苗用O78血清型菌株APCE94(保藏号为CGMCC No.10602的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)进行培养条件的优化、最佳免疫剂量的确定、疫苗佐剂的筛选、疫苗制备以及检验规程的制定。通过对上述条件进行优化、筛选，最终获得禽致病性大肠杆菌灭活疫苗。
本发明所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗可用于免疫预防O78血清型禽致病性大肠杆菌感染，对O78血清型禽致病性大肠杆菌感染的免疫保护效果为90％以上；可以有效地预防国内养鸭地区流行的O78血清型禽致病性大肠杆菌的感染。
本发明疫苗对易感鸭可在10日龄左右进行首次免疫，首次免疫后14日左右进行二次免疫。本发明疫苗对易感雏鸭进行免疫后对O78血清型禽致病性大肠杆菌强毒菌株攻毒的免疫保护率均达到90％及以上。本发明的禽致病性大肠杆菌灭活疫苗可用于预防雏鸭免受国内主要流行的O78血清型禽致病性大肠杆菌感染。
本发明所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，已于2015年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC No.10602。
附图说明
图1为本发明不同免疫剂量一次免疫后血清抗体效价；
图2为本发明不同免疫剂量二次免疫后血清抗体效价。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
本发明中未标注的试剂和原料均为市场上购买所得。
实施例1制苗用候选菌株的复壮以及鉴定
本发明前期研究通过筛选获得了O78血清型禽致病性大肠杆菌制苗用候选菌株APCE94，保藏号为CGMCC No.10602。
将该菌株分别经过易感鸭体内复壮后进行菌株的形态、毒力因子检测以及免疫保护率鉴定。将复壮后的菌株在LB液体和LB琼脂平板上传代50次，每隔5代对其菌株的形态(圆形凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色菌落)、生化反应特性(发酵乳糖和山梨醇；不分解蔗糖；不产生硫化氢；不分解尿素；吲哚和甲基红试验均为阳性；VP试验和枸橼酸盐利用试验均为阴性)、分子生物学特性(PCR扩增毒力基因tsh、fimC、mat、ibeB、yijP、neuC、cva/cvi、iss、iroN、fyuA、irp2均为阳性，序列测定结果正确)以及免疫保护率进行鉴定，表明该菌株在体外连续传代50次后各种特性均不发生变化。
实施例2禽致病性大肠杆菌灭活疫苗的最佳含菌量选择
将192只10日龄樱桃谷鸭随机分成4组，48只/组，两组疫苗免疫试验组以及两组对照组。其中两个试验组再随机分成6小组，10只/组，分别为免疫剂量2.5×109CFU/只、1×109CFU/只、5×108CFU/只、2.5×108CFU/只、1×108CFU/只、5×107CFU/只和未免疫对照组。
将各组疫苗分别按相应剂量颈部皮下接种于相应编号的樱桃谷鸭，对照组不做任何接种处理。各组2周后同法加强免疫1次。
如图1所示，首次免疫及二次免疫后14天分别颈静脉采血分离血清，间接ELISA方法检测血清抗体水平。结果表明不同剂量的疫苗免疫后均能刺激机体产生一定的抗体水平，未接种疫苗组的血清ELISA效价低于1:100。
免疫后14天，各组分别用O78血清型禽致病性大肠杆菌强毒菌株进行攻毒，观察记录攻毒后7日内的发病死亡情况。结果见表1。
表1 不同剂量O78血清型禽致病性大肠杆菌灭活疫苗的免疫保护效果
综合考虑免疫攻毒后鸭的状态及免疫保护率等因素，确定O78血清型APEC灭活油乳剂疫苗最佳含菌量为：5×108CFU/只。
实施例3制备O78血清型禽致病性大肠杆菌灭活疫苗
O78血清型APEC灭活油乳剂疫苗用菌株APCE94如上述方法复苏、生长、灭活、检验后，制备灭活疫苗。
方法为：取含菌量3.33×109CFU/mL APCE94灭活菌液3份，加入7份Montanide ISA70 VG佐剂或Montanide ISA 71 VG佐剂，混匀后，高速搅拌乳化1分钟/次×2次即为禽致病性大肠杆菌灭活疫苗。分装100mL/瓶后4℃保存。
0.5mL疫苗含菌量为5×108CFU，免疫时颈部皮下接种0.5mL/只。
将90只10日龄未免疫健康易感樱桃谷鸭(无锡市青阳鸭场)随机分成3组，30只/组，编号为A、B，A组使用禽致病性大肠杆菌灭活疫苗免疫两次，B组为对照组，不做任何接种处理；将疫苗分别颈部皮下接种于相应编号的樱桃谷鸭，0.5mL/只。14日后同法加强免疫1次。
首次免疫后14天及二次免疫后10天分别颈静脉采血分离血清，并分别以APCE94作为包被抗原，用间接ELISA方法检测血清抗体水平。
如图1、2所示，抗体效价检测结果表明禽致病性大肠杆菌灭活疫苗很好地诱导产生了抗体，抗体效价高达1:12800。
攻毒保护试验：如表2所示，首次免疫后14天后及二免后10天各免疫组再随机分成2组，10只/组，分别用攻毒剂量分别为2×106～7×108CFU/只的菌液腿部肌肉注射攻毒，观察记录攻毒后1周内发病死亡情况。
结果表明，所制备的疫苗免疫均能对O78血清型APEC强毒菌株提供良好的保护，保护率达90％～100％。
实施例4禽致病性大肠杆菌灭活疫苗的一免二免的免疫保护差异性
将40只10日龄樱桃谷鸭随机分成4组，10只/组，两组疫苗免疫试验组以及两组对照组。其中两个疫苗免疫试验组均以5×108CFU/只的免疫剂量按上述免疫方法进行免疫，另两组不做任何处理。
攻毒保护试验：如表2所示，首免14天及二次免疫后10天各免疫组，分别用攻毒剂量分别为2×106～7×108CFU/只的APCE93、APCE11菌液腿部肌肉注射攻毒，观察记录攻毒后1周内发病死亡情况。结果见表2：
表2 O78血清型禽致病性大肠杆菌灭活疫苗的首免及二免的免疫保护差异性
实施例5禽致病性大肠杆菌灭活疫苗的交叉保护性
将60只10日龄樱桃谷鸭随机分成6大组，10只/组，三组疫苗免疫试验组以及三组对照组。其中三个试验组均以5×108CFU/只的免疫剂量按上述免疫方法进行免疫，另三组不做任何处理。
攻毒保护试验：如表3，首免14天及二次免疫后10天各免疫组，分别用APEC优势血清型O1(APCE242)、O2(DE719)、O78(APCE11)菌液腿部肌肉注射攻毒，观察记录攻毒后1周内发病死亡情况。结果见表3：
表3 O78血清型禽致病性大肠杆菌灭活疫苗的交叉保护性
实施例6疫苗制备以及检验规程的制定
禽致病性大肠杆菌灭活疫苗的制备规程：
禽致病性大肠杆菌灭活疫苗的制苗用菌株APCE94冻干保存于-80℃。取-80℃保存的O78血清型APEC制苗用菌株APCE94分别接种到LB中复苏后，划线接种于LB平板上，置培养箱中37℃震荡培养过夜，次日挑选菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑特征的单菌落分别进行一级和二级种子繁殖，按接种量为体积比1％的条件下(按1:100转接)培养至对数生长期，取新鲜菌液，37℃震荡培养10h，经纯度检验和细菌计数后加入体积比0.4％福尔马林，37℃200rpm振荡24h进行灭活处理。然后分别取各灭活菌液少量接种于TSA平板37℃培养24h，进行无菌检验。根据细菌计数结果，将APCE94灭活菌液调至3.33×109CFU/mL。再取灭活菌液3份，加入7份Montanide ISA70 VG佐剂或Montanide ISA 71 VG佐剂中混匀，高速搅拌乳化1分钟/次×2次，即为禽致病性大肠杆菌灭活疫苗。最后分装100mL/瓶后4℃保存。
本实施例的0.5mL疫苗含菌量分别为5×108CFU，免疫时颈部皮下接种0.5mL。
本发明禽致病性大肠杆菌灭活疫苗的检验规程：
1)禽致病性大肠杆菌灭活疫苗于液体LB或LB琼脂培养板上培养，应无细菌生长。
2)于室温保存6个月或4℃保存1年应无分层现象发生。
3)3倍剂量疫苗接种10日龄易感鸭安全。
4)易感鸭分别用免疫剂量(0.5mL)于10日龄和24日龄颈部皮、下接种后，应产生1:400(ELISA效价)以上针对APCE93、APCE11的血清抗体。分别用攻毒剂量分别为2×106～7×108CFU/只的菌液APCE93、APCE11的攻毒保护应在90％以上。
本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。

Claims (10)

1.一株禽致病性大肠杆菌菌株，为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)APCE94，其保藏号为CGMCC NO.10602。
2.权利要求1所述禽致病性大肠杆菌菌株在制备疫苗中的应用。
3.一种包含权利要求1所述菌株的禽致病性大肠杆菌灭活疫苗。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗中，灭活的大肠埃希氏菌菌株的抗原含量大于等于1×109CFU/mL。
5.根据权利要求3或4所述的疫苗，其特征在于，还包含佐剂，所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗中大肠埃希氏菌菌株与佐剂的重量比为3：7。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂为Montanide ISA 70VG佐剂或Montanide ISA 71 VG佐剂。
7.根据权利要求3-4任意一项所述的疫苗，其特征在于，所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗为灭活全菌疫苗。
8.制备权利要求3-7任意一项所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
1)制备禽致病性大肠杆菌菌株灭活抗原
取所述禽致病性大肠杆菌菌株APCE94接种于LB培养基中培养，并分别进行一级和二级种子繁殖；然后转接培养，并进行灭活处理；
2)配制疫苗
将灭活处理的菌液稀释或浓缩，调至大于等于3.33×109CFU/mL；取灭活菌液与佐剂按3：7重量比进行混匀，搅拌并乳化处理，得所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述转接培养的条件为菌液按1:100转接，37℃震荡培养10h；所述灭活处理采用所述菌液加入体积比0.4％福尔马林，37℃200rpm振荡24h。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，混匀后，进行高速搅拌并乳化处理1分钟/次×2次。
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