CN104745521A - 一株鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株及其应用，本发明所述鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株，保藏编号为CGMCC 10147。本发明用鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株研制的油乳剂灭活疫苗对鸭疫里默氏杆菌国内优势血清型1、2和10型代表菌株均具有100％的交叉保护力，可应用于鸭疫里默氏杆菌的广谱疫苗。

Description

一株鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一株鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株及其作为广谱疫苗候选株应用于鸭疫里默氏杆菌油乳剂灭活疫苗。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)病又称为鸭传染性浆膜炎，是一种主要侵害鸭、火鸡和其他鸟类的禽类接触性传染病。1-8周龄雏鸭十分易感，主要病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪样输卵管炎等，发病率高，病死率高，耐过鸭多成僵鸭，生长迟缓，造成的经济损失重大，是当前危害养鸭业最为严重的传染病之一。

鸭疫里默氏杆菌血清型复杂，目前世界范围内已确认的RA血清型有21个(l～21型)，国内报道的血清型至少有13个，分别为血清型1、2、3、5、6、7、8、10、11、13、14、15及未定型，其中血清型1、2和10为国内引发感染的优势血清型，各血清型之间缺乏有效的交叉保护^[1]。

近年来，我国鸭疫里默氏杆菌感染发病呈上升趋势。该病的发展越来越复杂而且呈动态变化，使用药物进行防治导致耐药性的普遍产生，既增加防治成本，也给食品安全和人类健康带来了极大危害，因此疫苗免疫是一种高效而经济的手段。研究表明，同一鸭场的鸭群可以感染一种或同时感染几种血清型的鸭疫里默氏杆菌，而且感染鸭疫里默氏杆菌的血清型还可能经常变化^[2]，因此理想的鸭疫里默氏杆菌疫苗应该可以同时提供针对几种血清型的保护力。

目前国外已有商品化针对血清1、2、5型鸭疫里默氏杆菌的灭活疫苗和弱毒疫苗^[3][4]。针对血清1、2和10型鸭疫里默氏杆菌病的三价油乳剂灭活苗已有报道^[5]，具有较好的推广价值，然而在制备疫苗时需要应用血清1、2和10型的三个菌株。因此，获得对优势流行血清型菌株具有交叉保护作用的鸭疫里默氏杆菌菌株用作广谱疫苗候选株至关重要。研究表明，鸭疫里默 氏杆菌伴侣蛋白GroEL和TonB依赖性受体TdR1蛋白(gi:312446409)对鸭疫里默氏杆菌1、2、10型菌株具有部分交叉保护力或交叉反应性^[6][7]，迄今尚无具有有效交叉保护力的鸭疫里默氏杆菌疫苗候选菌株报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1。

本发明的另一目的在于提供含鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1的广谱疫苗。

本发明的再一目的提供该广谱疫苗的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1中细菌脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌表面的主要抗原成分，决定细菌的血清型。本发明利用LPS单抗筛选CH3转座子随机突变库，获得一株鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1，该菌株缺失与LPS单抗结合的能力，表明其LPS的抗原性发生了变化。进一步的研究表明LPS抗原性发生变化的RA-M1菌株对血清1、2和10型强毒攻毒具有100％交叉保护性。

本发明所述鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株，命名为鸭疫里默氏杆菌Riemerella anatipestifer，已于2014年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC No.10147。

本发明还提供一种含鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1的广谱疫苗。

本发明所述鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1在用于制备疫苗中的应用。

本发明所述含鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1的疫苗，包含菌量为6.7×10⁹CFU/mL的鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株。

本发明所述的疫苗还包含Montanide ISA 70VG佐剂(赛比克Montanide ISA 70VG)。

其中，鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株与Montanide ISA 70VG佐剂的重量比为3:7。

本发明所述疫苗的剂型优选采用油乳剂。

本发明所述疫苗的制备方法，包括如下步骤：

1)先将RA-M1进行细菌培养，到生长期时加入0.4％的福尔马林，37℃，200rpm振荡培养18h灭活，根据细菌计数结果对灭活菌液进行配制，使其含菌量为6.7×10⁹CFU/mL；

2)然后取灭活RA-M1菌液以及Montanide ISA 70VG佐剂，按重量配比3:7充分混匀搅拌10min，4℃保存。

本发明所述疫苗在制备预防鸭疫里默氏杆菌感染制品中的应用。

免疫印迹(Western blotting)研究表明，RA-M1LPS在与抗CH3兔血清的反应中，其O抗原成分较野生株CH3有明显的缺失现象，表明该突变株的抗原性发生了改变。

为了研究该突变株是否具有对不同血清型RA的交叉保护力，将RA-M1按已报道的方法^[8]制备油乳剂灭活疫苗，二次免疫后用血清1、2、10型RA强毒WJ4、Yb2和Hxb2进行攻毒(10LD₅₀)，结果表明，免疫鸭对WJ4、Yb2和Hxb2攻毒获得了100％的交叉保护。因此，鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1可作为广谱疫苗候选菌株用于疫苗研究。

本发明所述鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株，命名为鸭疫里默氏杆菌Riemerella anatipestifer，已于2014年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC No.10147。

附图说明

图1为Southern blot(印迹法)鉴定转座子Tn4351对CH3全基因组插入位点的个数。1、10μg经XbaI酶切后的pEP4351(阳性对照)；2、10μg经XbaI酶切后的CH3基因组(阴性对照)；3、10μg经XbaI酶切后的RA-M1基因组。结果显示RA-M1基因组只有单个Tn4351插入位点。

图2a-2c为Genome Walking(染色体步移技术)鉴定转座子插入位点。

图2a为第一轮PCR产物鉴定图，M：DL1,5000Marker(标记)；1-4分别为SP1分别与AP1-AP4与突变株进行PCR的产物。

图2b为第二轮PCR产物鉴定图。M：DL1,5000Marker；1-4分别为SP2分别与AP1-AP4与突变株进行PCR的产物。

图2c为第三轮PCR产物鉴定图。M：DL1,5000Marker；1-4分别为SP3分别与AP1-AP4与突变株进行PCR的产物。由图可知突变株第三轮PCR产物中AP2为单一的特异性条带，故将此条带进行切胶回收，连T载体蓝白斑筛选后送上海华津生物科技有限公司测序。

图3-a PCR鉴定转座子插入M949_1603基因。M：DL 2,000Marker；1：CH3；2：RA-M1；3：阴性对照。突变株PCR扩增不到M949_1603基因。

图3-b定量PCR鉴定转座子插入致M949_1603基因失活。转座子插入导致突变株RA-M1的M949_1603基因失活，因此检测不到其转录水平。M949_1603基因的缺失对其上下游基因(M949_1602和M949_1604基因)的转录影响不大。

图4为野生株和突变株的生长曲线的测定图。以每个时间点测得的OD值绘制CH3、RA-M1的生长曲线，重复3次。结果表明，CH3和RA-M1生长速度无显著差别。

图5为Western blot检测LPS与1型抗兔血清的反应。CH3、RA-M1LPS上样量均为1μg，1、CH3LPS；2、RA-M1LPS。提取的LPS纯度较好，蛋白残留低于考染检测限。Western blot结果显示，RA-M1LPS与CH3LPS相比，代表O抗原的梯状条带部分出现了缺失现象。

图6为二次免疫后抗体水平检测结果。二次免疫后10天血清抗体滴度高达1：1.024×10⁵。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。

实施例1RA CH3随机突变库的构建

(1)转座子随机突变法构建RA CH3随机突变库 

按文献报道的方法^[9]将E.coli BW19851(含有转座子质粒Tn4351)和RA菌株CH3(卡那霉素抗性)分别培养后按供体菌：受体菌为1:2进行接 合转导，30℃培养8h后涂至含红霉素和卡那霉素的TSB平板上，37℃，5％CO₂培养箱中继续培养24-30h。挑取单菌落至含双抗的TSB中，37℃震摇，直至生长。以红霉素基因设计的引物Erm F/R(表1)以及RA的16S rRNA引物16S rRNA F/16S rRNA R(表1)对突变株进行PCR鉴定，双阳性为阳性菌，构建随机突变库。

实施例2RA LPS单抗的制备 

按常规方法进行^[10]。将RA CH3菌株培养至对数期，并加入0.4％的福尔马林灭活18h。将灭活菌液与等体积的福氏完全佐剂(Sigma-Aldric)进行乳化，按1×10⁸CFU/只的剂量背部和腹部皮下多点注射BALB/c雌性小鼠(6-8周龄，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供)进行首免。每隔2周用福氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich)加等体积的灭活CH3菌液乳化后加强免疫3次，剂量、方法、途径同首免。最后一次免疫后7天检测血清抗体效价，腹腔注射CH3菌液(1×10⁸CFU/只，不添加佐剂)，3天后取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，待融合细胞集落长至培养孔1/4时，吸取细胞培养上清，用CH3LPS包被ELISA板(10μg/孔)进行间接ELISA检测。阳性克隆继续培养，用有限稀释法进行亚克隆筛选，直至100％阳性。最终获得一株稳定分泌抗体的细胞，命名为8A9。接种10周龄BALB/c雌性小鼠制备8A9腹水抗体，间接ELISA法测定腹水单抗效价为1.024×10⁵。

实施例3突变株RA-M1的鉴定

CH3随机突变株包被酶标板，以8A9腹水单抗进行间接ELISA筛选，获得一株8A9单抗阴性反应菌株(RA-M1)，Southern blotting鉴定转座子Tn4351对CH3全基因组为单位点插入(如图1所示，显示RA-M1基因组只有单个Tn4351插入位点)。

然后采用Genome walking对突变位点进行鉴定，如图2a-2c所示，图2a为第一轮PCR产物鉴定图，SP1分别与AP1-AP4与突变株进行PCR；图2b为第二轮PCR产物鉴定图，SP2分别与AP1-AP4与突变株进行PCR；图2c 为第三轮PCR产物鉴定图，SP3分别与AP1-AP4与突变株进行PCR。由图2a-2c可知，突变株第三轮PCR产物中AP2为单一的特异性条带，故将此条带进行切胶回收，连T载体蓝白斑筛选后送上海华津生物科技有限公司测序。测序结果表明，转座子插入的基因座号为M949_1603，该基因长度为873bp，转座子插入位点在该基因的197bp处。该基因的编码蛋白有290个氨基酸，预测为糖基转移酶Family 2家族(glycosyl transferase family 2)之一。

应用在线软件primer3v.0.4.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计引物M949_1603F/M949_1603R(表1)，PCR扩增M949_1603基因，以及用实时定量PCR检测其基因的表达(引物M949_1603F/R，表1)，表明突变株的M949_1603基因被转座子Tn4351插入。该基因由于转座子的插入而失活，无mRNA产生，检测不到其转录水平。如图3-a所示，突变株PCR扩增不到M949_1603基因。随后，分别应用引物M949_1602F/R、M949_1604F/R检测其上、下游基因M949_1602和M949_1604的表达，结果为无明显变化；因此，M949_1603基因的缺失对其上下游基因的转录影响不大(图3-b)。

表1本发明所用引物

实施例4突变株的形态特性观察及生长曲线测定

突变株RA-M1在TSA平板上长出直径约1mm的乳白色半透明小菌落，菌落光滑圆整，微突起，细润有光泽，与野生株CH3眼观菌落形态基本一致。

将OD₆₀₀为1的CH3和RA-M1菌液1:100转接，37℃，200rpm培养12h，每间隔1h测一次OD₆₀₀值，绘制CH3、RA-M1的生长曲线，重复3次。结果见图4，可见M949_1603基因的缺失对生长速度影响不大，表明，CH3和RA-M1生长速度无显著差别。

实施例5Western blotting比较CH3和突变株RA-M1LPS的抗原差异。

按^[11]所述的方法用热酚水法抽提CH3、RA-M1的LPS。将纯化的LPS与2×上样缓冲液(1M Tris[pH6.8]，2％SDS，4％β-巯基乙醇，10％蔗糖，0.004％溴酚蓝)按1:1混合，100℃煮沸10min，分别取10μL野生株CH3和突变株RA-M1纯化的LPS样品进行SDS-PAGE电泳(100V，2h)，分离胶聚丙烯酰胺浓度为15％，再用Trans-Blot转印槽将LPS转移至NC膜上(200mA、360min)。转印结束后将NC膜用含有5％的脱脂乳PBS封闭两个小时，PBST洗涤3次，每次5min。将抗CH3兔血清做1:2000稀释，孵育过夜，PBST洗涤5次，每次5min。然后再与1:20,000荧光标记的驴抗鼠IgG(LI-COR公司提供)室温孵育2h，PBST洗涤5次，每次5min。利用红外扫描仪扫描(Gene Company Limited提供)。由图5可知，CH3、RA-M1LPS上样量均为1μg，1、CH3LPS；2、RA-M1LPS。提取的LPS纯度较好，蛋白残留低于考染检测限。Western blotting结果显示，RA-M1LPS与CH3LPS相比，LPS O抗原部分的梯状条带出现了缺失现象。

实施例6突变株RA-M1灭活油乳剂疫苗的交叉保护试验

(1)RA-M1灭活油乳剂疫苗的制备

1)菌液培养将RA-M1接种入胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB，pH值7.4，121℃灭菌20分钟后冷却)，37℃，200rpm/min培养15小时。

2)活菌计数培养完毕后分别取样进行活菌计数，RA-M1活菌含量应≥1.5×10¹⁰CFU/ml。

3)取样接种含2％新生牛血清的TSA平板/斜面做纯粹检验，应纯粹。

4)菌液配制与灭活将纯检合格的菌液用pH 7.4的PBS制成含菌量为6.7×10⁹CFU/mL的悬浮液。然后按菌液总量的0.4％缓慢加入甲醛溶液，37℃恒温作用18小时，每隔4小时振摇一次。

5)灭活检验取0.2ml灭活菌液接种含2％新生牛血清的TSA平板进行灭活检验，应无菌生长。

6)Montanide ISA 70VG佐剂购自赛比克(SEPPIC)上海特殊化学品有限公司，121℃高压灭菌20分钟备用。该佐剂为油包水型疫苗的矿物油佐剂，使用比例为70％(重量比)，即70％重量的佐剂，30％重量的抗原。

7)疫苗制备取佐剂7份放于乳化罐内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入灭活菌液3份，以3000r/min搅拌10分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.005％。

8)半成品检验配苗完成后，取样做无菌检验，应无菌生长。

9)分装经无菌检验合格后，充分搅拌10min，分装100mL/瓶后4℃保存，即为RA-M1灭活油乳剂(赛比克Montanide ISA 70VG)疫苗，无菌检验应无细菌生长。

(2)免疫接种

将48只7日龄樱桃谷鸭分成随机2大组，24只/大组。其中24只作为免疫组进行首次免疫，免疫剂量为0.25mL/只(5×10⁸CFU)，颈部皮下接种。2周后同法加强免疫1次。另外24只作为对照组，对照组不做任何接种处理。

(3)抗体检测

首次免疫及二次免疫后10天分别颈静脉采血分离血清，分别用RA-M1、WJ4、Yb2和HXb2全菌作抗原包被酶标板(CBS稀释至10⁸CFU/mL，50uL/孔)，间接ELISA法检测抗体水平。间接ELISA操作流程方法同上，山羊抗鸭IgG-HRP(1:800稀释)作为二抗。

结果如图6：表明雏鸭经2次免疫后，RA-M1灭活油乳剂疫苗能诱导机体产生较高的抗体水平，抗体滴度达1：1.024×10⁵。

(4)攻毒保护： 

二免后14天后将免疫组和对照组各随机分成3小组，8只/小组，分别用1×10⁹CFU/mL WJ4(RA血清1型菌株)、2×10⁶CFU/mL Yb2(RA血清2型菌株)和1.6×10³CFU/mL HXb2(RA血清10型菌株)菌液腿部肌肉注射攻毒，0.5mL/只，观察记录攻毒一周内发病死亡情况。

结果：免疫组存活率分别为8/8、8/8、8/8，对照组死亡率分别为8/8、8/8、8/8。RA-M1灭活油乳剂疫苗对血清1、2、10型RA强毒攻击保护率达100％。

参考文献： 

[1]胡清海,张知良,苗晋锋,刘岳龙,刘晓文,丁铲，2001。江苏安徽两省鸭疫里默氏杆菌病的流行病学调查研究。中国兽医科技，18:18–19。

[2]Sandhu TS.1991.Immunogenicity and safety of a live Pasteurella anatipestifer vaccine in White Pekin ducklings:laboratory and field trials.Avian Pathol.20(3):423-32. 

[3]Timms and Marshall.1989.Laboratory assessment of protection given by experimental Pasteurella anatipestifer vaccine.Br Vet J.145(5):483-93. 

[4]Layton HW,Sandhu TS.1984.Protection of ducklings with a broth-grown Pasteurella anatipestifer bacterin.Avian Dis.28(3):718-26. 

[5]Haiwen Liu,Xiaolan Wang,Chan Ding,Xiangan Han,Anchun Cheng,Shaohui Wang,Shengqing Yu,Development and Evaluation of a Trivalent Riemerella anatipestifer-Inactivated Vaccine,Clinical and Vaccine Immunology,(2013)20:691-697. 

[6]Qinghai Hu,Chan Ding,Jing Tu,Xiaolan Wang,Xiangan Han,Yunbin Duan,Shengqing Yu,2012a.Immunoproteomics analysis of whole cell bacterial proteins of  Riemerella anatipestifer.Veterinary Microbiology,157,428–438.

[7]Xiangan Han,Qinghai Hu,Siyu Ding,Wenjing Chen,Chan Ding,Liang He,Xiaolan Wang,Jiabo Ding,Shengqing Yu.2011.Identification and immunological characteristics of chaperonin GroEL in Riemerella anatipestifer.Applied Microbiology and Biotechnology.93(3):1197-205. 

[8]王小兰，胡青海，童永亮，韩先干，丁铲，于圣青.血清1型鸭疫里默氏杆菌灭活油乳剂疫苗的研制.中国预防兽医学报.2012,34(4):313-316。

[9]Qinghai Hu,Yinyu Zhu,Jing Tu,Yuncong Yin,Xiaolan Wang,Xiangan Han,Chan Ding,Beimin Zhang,Shengqing Yu,2012,Identification of the genes involved in Riemerella anatipestifer biofilm formation by random transposon mutagenesis,PLoS One,2012；7(6):e39805

[10]侯湾湾，韩先干，王少辉，王小兰，岳嘉蘋，曹守林，范红结，于圣青。鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的原核表达和单克隆抗体制备。中国动物传染病学报，2014,22(2):58-64。

[11]Gu X.-X.,Chen J.,Barenkamp S.J.,Robbins J.B.,Tsai C.-M.,Lim D.J.,Battey J.,Synthesis and Characterization of Lipooligosaccharide-Based Conjugates as Vaccine Candidates for Moraxella(Branhamella)catarrhalis,Infection and immunity.(1998)66:1891-1897. 

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。

Claims (9)

1.一株鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株，其保藏号为CGMCC 10147。

2.权利要求1所述鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株在制备疫苗中的应用。

3.一种包含所述鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株的疫苗。

4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，包含含菌量为2×10⁹CFU/mL的鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株。

5.根据权利要求3或4所述的疫苗，其特征在于，还包含Montanide ISA70VG佐剂。

6.根据权利要求5所述疫苗，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株与所述Montanide ISA 70VG佐剂的重量比为3:7。

7.根据权利要求3-5任意一项所述疫苗，其特征在于，所述疫苗的剂型为油乳剂。

8.一种制备权利要求3-7任意一项所述疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)先将RA-M1进行细菌培养，到生长期时加入0.4％的福尔马林，37℃，200rpm振荡培养18h灭活，根据细菌计数结果对灭活菌液进行配制，使其含菌量为6.7×10⁹CFU/mL；

2)然后取灭活RA-M1菌液以及Montanide ISA 70VG佐剂，按重量配比3:7充分混匀搅拌10min，4℃保存。

9.权利要求3-7任意一项所述的疫苗在制备预防鸭疫里默氏杆菌感染的制品中的应用。