CN103484397A - 一种hhdA基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌工程菌株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种hhdA基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌菌株及其构建方法。利用重叠PCR技术将HPS野生型菌株hhdA基因上下游序列进行连接，构建到自杀性质粒载体（PEMOC2ΔhhdA）并转入到E.β 2155菌株中，通过结合转移的方法将PEMOC2ΔhhdA转入到HPS野生型菌株中筛选出发生单交换的阳性结合子菌株，经有限稀释连续培养，筛选hhdA基因缺失的无抗性标记的HPS菌株HPSΔhhdA。本发明构建的HPSΔhhdA菌株生长特性和免疫保护原性与亲本菌株相似，并且免疫HPSΔhhdA菌株后动物不产生抗hhdA蛋白抗体，可用其作为疫苗用菌株在副猪嗜血杆菌病防控和检测中区别野生型菌株。

Description

一种 hhdA 基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌工程菌株及其构建方法

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，涉及一种hhdA基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌菌株的构建方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是一种多形态、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖型、不运动的革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德杆菌科嗜血杆菌属。该病原能引起猪的多发性浆膜炎、关节炎以及脑膜炎为主要特征的猪革拉泽氏病(Glässer’s Disease)。目前，该病在多个国家和地区广泛存在和流行，是造成2周龄到4月龄断奶仔猪发病和死亡的首要原因；临床上该病原菌还常常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒和猪瘟病毒等具有免疫抑制作用的病原微生物混合感染，造成了猪病的多样化和复杂化，严重危害了养猪业的发展。

目前对副猪嗜血杆菌的致病机理及毒力因子的研究尚无定论。早期研究中，主要从菌体结构和组成成分出发，研究了神经氨酸酶、外膜蛋白、转铁结合蛋白、生物被膜、荚膜多糖等与毒力的关系。随着分子生物学技术的发展，更多的新方法用到副猪嗜血杆菌的研究中，如Differential Display RT-PCR技术、基因芯片技术、表达差异捕获(SCOTS)技术、抑制消减杂交技术等企图从基因水平上挖掘更多的毒力因子。但上述所发掘的这些毒力相关因子都是处在推测和假定的阶段，缺少相关的遗传操作技术进一步证明这些相关因子与毒力的确切关系以及其分子机制。

利用同源重组技术构建基因缺失菌株已在其它病原菌中揭示了大多数可疑基因的功能，但该技术在副猪嗜血杆菌方面的应用还存在争议和难度。Anna等研究发现副猪嗜血杆菌具有一个cAMP依赖性自然转化系统，能够摄取含有ACCGAACTC序列信号肽（USS）的DNA，在改进诸如cAMP浓度、DNA浓度和外源DNA的曝光时间等参数后，构建了一个含有卡那霉素抗性基因标记的thy(编码胸营酸合成酶)基因缺失突变菌株（Anna B, M Elena Garrido, Ignacio B, et al. Colonization capacity and serum bactericidal activity of Haemophilus parasuis thy mutants. International Microbiology，2006, 9: 297-301）。Zhang等利用上述cAMP依赖性自然转化系统构建HPS基因缺失菌株并没有成功，反而利用ACCGCTTGT序列信号肽在不依赖cAMP的情况下，用庆大霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因作为筛选标记，构建了HPS血清4型SC096菌株一系列基因缺失突变菌株（Zhang B, Feng S, et al. Serum resistance in Haemophilus parasuis SC096 strain requiresouter membrane protein P2 expression. FEMS Microbiol Lett, 2012, 326: 109–115。Zhang B, He Y, et al. Cytolethal distending toxin (CDT) of the Haemophilus parasuis SC096 strain contributes to serum resistance and adherence to and invasion of PK-15 and PUVEC cells. Vet Microbiol, 2012, 157: 237-242）。张念章等利用构建的自杀质粒pDS-HPhhdA-Kan电转化到HPS中涂于卡那霉素的TSA平板上，将卡那霉素的TSA平板上生长的菌落转印到含5%蔗糖的TSA平板上，仔细观察在卡那霉素性平板上生长而在蔗糖平板上不生长的菌落，将其命名为HPSΔhhdA（张念章. 副猪嗜血杆菌hhdA基因缺失菌株的构建及胞外丝氨酸蛋白酶免疫原性的研究[D]. 中国农业科学院预防兽医学, 2011）。利用上述自然转化法和电转化方法虽构建了相应基因缺失突变菌株，但所构建的基因缺失突变菌株都是利用抗性基因来替代目的基因。从而根据突变菌株表型的变化来验证某种基因的功能不太确切，因为细菌的自身机能代谢调控是相互作用相互依赖的，这种突变菌株表型的变化有可能是抗性基因的插入所引起的调控，而非目的基因的缺失引起。另外用抗性基因作为筛选标记获得的弱毒免疫保护菌株，由于抗性基因的存在，从生物安全的角度考虑，阻碍了该基因缺失突变菌株作为疫苗用菌株的应用。马艳平等通过结合转移的方法，利用自杀性质粒载体PDM4携带缺失基因的同源臂序列，在15%的蔗糖培养基上获得了无抗性标记的密度感应信号相关基因luxS和鞭毛基因pilA的基因缺失株（马艳平. 副猪嗜血杆菌生物被膜形成相关基因luxS和pilA的克隆和功能鉴定[D]. 中国农业科学院预防兽医学, 2010）。但本科室在利用相应技术构建基因缺失菌株时，发现本研究室分离鉴定的HPS血清5型野生型菌株在含有15%蔗糖的培养基上不生长，无法用蔗糖的负筛选标记获得相应的基因缺失菌株，利用蔗糖的负筛选标记来获得HPS相应菌株的基因缺失存在一定的局限性。

相关研究表明hhdA基因存在于大多数有毒菌株中而无毒菌株为阴性，将副嗜血杆菌进行模拟体内培养时，用基因芯片技术鉴定到了hhdA基因的相对表达量发生了上调。推测该基因可能与HPS的毒力相关，但该基因在副猪嗜血杆菌中所发挥的生物学功能还不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种hhdA基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌菌株的构建方法，以及由此得到的菌株及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种hhdA基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

（1）扩增副猪嗜血杆菌hhdA基因上游序列A和下游序列B，利用重叠PCR方法将上游序列A和下游序列B拼接在一起，得到融合基因序列C；

（2）将步骤（1）得到的融合基因序列C连接到自杀性质粒载体PEMOC2中，得到自杀性质粒载体PEMOC2ΔhhdA；

（3）通过结合转移法将自杀性质粒载体PEMOC2ΔhhdA转入副猪嗜血杆菌野生型菌株中，筛选阳性单交换结合子菌株；

（4）挑选阳性单交换结合子菌株在含NAD的培养基中进行有限稀释连续培养，PCR法筛选hhdA基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌工程菌株HPSΔhhdA。

优选的，步骤（1）和步骤（3）所述的副猪嗜血杆菌为同一血清型的副猪嗜血杆菌。

优选的，步骤（1）和步骤（3）所述的副猪嗜血杆菌为HPS血清5型野生型菌株。

优选的，步骤（3）所述副猪嗜血杆菌为HPS 5型H11 株（副猪嗜血杆菌 HPS-H11，Haemophilus parasuis HPS-H11），已于2013年7月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION，CCTCC），地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2013316。

优选的，步骤（1）所述hhdA基因上游序列A如SEQ ID NO:1所示，所述hhdA基因下游序列B如SEQ ID NO:2所示，所述融合基因序列C如SEQ ID NO:3所示。

所述hhdA基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌工程菌株的构建方法中，步骤（3）的具体操作为：

1）将自杀性质粒载体PEMOC2ΔhhdA热应激转入到E.β 2155感受态中，得到含有PEMOC2ΔhhdA质粒的E.β 2155菌株E. β 2155（PEMOC2ΔhhdA）；

2）将E. β 2155（PEMOC2ΔhhdA）和副猪嗜血杆菌菌株在含二氨基庚二酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的TSA培养基上培养，然后冲洗菌体涂于含有氯霉素和NAD的TSA培养基上培养过夜，挑取单菌落接种于含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的TSB培养基中增菌，设计特异性引物hhdA-up-F和hhdA-down-R对菌液进行PCR扩增，能同时扩增出自杀性质粒载体PEMOC2ΔhhdA上的融合基因序列C和副猪嗜血杆菌野生型菌株上的（上游序列A+hhdA基因+下游序列B）片段的为阳性单交换结合子菌株。

步骤（4）的具体操作为：将筛选到的阳性单交换结合子菌株接种到含有NAD的培养基中进行有限稀释连续培养，设计特异性引物对菌液进行PCR鉴定，用引物hhdA-up-F和hhdA-down-R若扩增出特异的一条1136bp的条带，而用引物hhdA-F和hhdA-R没有扩增出hhdA基因的菌株即为目的菌株HPSΔhhdA。

由上述方法构建得到的hhdA基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌菌株HPSΔhhdA（Haemophilus parasuis HPSΔhhdA），已于 2013 年7月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION，CCTCC），地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2013317。

由以上方法构建得到的hhdA基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌菌株HPSΔhhdA在制备副猪嗜血杆菌基因工程缺失疫苗上的应用。

下面以HPS血清5型野生型H11菌株为基础构建hhdA基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌菌株为例，进一步说明本发明的方案：

（1）HPS-hhdA基因上下游序列的扩增：根据GenBank中登录的HPS-SH0165菌株全基因序列，序列号为CP-001321，设计HPS-hhdA基因上游序列引物hhdA-up-F和hhdA-up-R，下游序列引物hhdA-down-F和hhdA-down-R，以HPS 5型野生型菌株为模板进行PCR扩增HPS-hhdA基因上游序列560bp（SEQ ID NO:1）和下游序列576bp（SEQ ID NO:2），各条引物序列如下所示：

hhdA-up-F: 5’-aaagcggccgcgtgaccgctagcacccactgtc-3’（SEQ ID NO:4），含有NotⅠ酶切位点；

hhdA-up-R: 5’- acttgcagaaacgctcacgctaattgtaattcacttgccac-3’（SEQ ID NO:5）；

hhdA-down-F: 5’- gtggcaagtgaattacaattagcgtgagcgtttctgcaagt-3’ （SEQ ID NO:6）；

hhdA-down-R: 5’-cgcgtcgacttgcccagttatcttcccagcct-3’ （SEQ ID NO:7），含有SalⅠ酶切位点。

(2) HPS-hhdA基因上游序列和下游序列的拼接：采用hhdA-up-F引物和hhdA-down-R引物对纯化的hhdA基因上游序列和下游序列片段进行重叠PCR拼接，得到长为1136bp的hhdA基因上下游连接融合基因序列片段（SEQ ID NO:3）。

(3) HPS-hhdA基因的融合基因序列片段（SEQ ID NO:3）插入自杀性质粒载体PEMOC2中：将回收的融合基因序列片段（SEQ ID NO:3）用NotⅠ和SalⅠ双酶切，同时用NotⅠ和SalⅠ双酶切自杀性质粒载体PEMOC2，用T4 DNA连接酶将SEQ ID NO:3序列片段连接到自杀性质粒载体PEMOC2上，得到PEMOC2ΔhhdA质粒；将PEMOC2ΔhhdA质粒热应激转入到E.β 2155感受态中，经氯霉素抗性筛选和双酶切鉴定得到含有PEMOC2ΔhhdA质粒的E.β 2155菌株E.β 2155（PEMOC2ΔhhdA）。

(4) PEMOC2ΔhhdA转入HPS野生型菌株中获得阳性单交换结合子菌株：利用结合转移的方法将PEMOC2ΔhhdA转入HPS野生型菌株中，首先将E.β 2155（PEMOC2ΔhhdA）和HPS血清5型野生型菌株在含二氨基庚二酸（DAP）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的TSA（胰蛋白胨大豆琼脂）培养基上培养8小时，然后冲洗菌体涂于含有氯霉素和NAD的TSA（胰蛋白胨大豆肉汤）培养基上培养过夜，挑取单菌落接种于含NAD的TSB培养基中增菌，而后用hhdA-up-F和hhdA-down-R引物对菌液进行PCR扩增，鉴定获得阳性单交换结合子菌株，阳性单交换子菌株可同时扩增出两条基因片段，即长1136bp的PEMOC2ΔhhdA质粒上的融合基因片段SEQ ID NO:3和长3068bp的HPS野生型菌株基因片段（上游序列A+hhdA基因+下游序列B）。

(5) HPS-hhdA基因无抗性标记缺失菌株的筛选和获得：利用有限稀释连续培养法和特异性基因片段的扩增，筛选获得hhdA基因缺失菌株。首先将获得的阳性单交换结合子菌液以1:1000的比例接种到新的TSB培养基（含NAD）中进行增菌，过夜培养后用hhdA-up-F和hhdA-down-R引物进行PCR鉴定，若扩增产物出现两条带1136bp和3068bp，从新增菌液中吸取1μL菌液稀释到100μL的培养基中涂于TSA（含NAD）平板上，过夜培养后挑取单菌落接种于TSB（含NAD）培养基中进行增菌，并用hhdA-up-F和hhdA-down-R引物进行PCR扩增，若扩增出特异的一条1136bp的条带，而用hhdA-F和hhdA-R引物进行PCR扩增产物为阴性，即成功获得副猪嗜血杆菌hhdA基因无标记缺失菌株(HPSΔhhdA)。

hhdA-F：5’-taaaaaccttagcgtaggtggc-3’（SEQ ID NO:8），

hhdA-R：5’-tgtttcgctgactttattcac-3’（SEQ ID NO:9）。

(6) 通过大量生物学实验数据证明HPSΔhhdA菌株基因缺失遗传稳定，其生长特性和免疫保护原性同亲本菌株相似，并且该菌株缺失了hhdA蛋白，免疫动物后不产生相应的hhdA蛋白抗体，将为副猪嗜血杆菌基因工程缺失疫苗的制备及鉴别诊断方法的建立奠定重要基础。

本发明的有益效果是：

(1) 本发明针对副猪嗜血杆菌的hhdA基因，设计相应的引物，利用PCR 技术，获得hhdA基因上下游序列，通过重叠PCR技术将hhdA基因上下游序列进行拼接，最终克隆入自杀性质粒载体PEMOC2，成功构建了hhdA基因敲除质粒，即PEMOC2ΔhhdA。通过结合转移的方法将PEMOC2ΔhhdA质粒转入HPS野生型菌株中，经同源重组以及特异性序列片段PCR扩增等方法，成功筛选获得hhdA基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌菌株，即HPSΔhhdA菌株。

(2) 本发明对HPSΔhhdA菌株的遗传稳定性、生长特性和免疫保护性进行了分析，与亲本菌株相似。且该菌株缺失了hhdA蛋白，免疫动物后不产生相应的hhdA蛋白抗体。可作为研制副猪嗜血杆菌基因工程缺失疫苗的候选菌株之一，并且该基因缺失菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。

附图说明

图1：副猪嗜血杆菌hhdA基因无抗性标记缺失菌株构建图谱；

图2：副猪嗜血杆菌hhdA基因上、下游序列扩增及重叠PCR连接产物电泳图（M: DL2000 DNA Mark, 1: hhdA上游序列, 2: hhdA下游序列，3: hhdA上、下游序列的融合基因）；

图3：酶切鉴定构建的自杀性质粒PEMOC2ΔhhdA（M: DL 5000 DNA Mark，1: 构建的自杀性质粒PEMOC2ΔhhdA，2: 空质粒PEMOC2）；

图4：PCR鉴定HPSΔhhdA缺失菌株单交换接合子（M：DL 5000 DNA Mark，S1、S2、S3、S4：筛选的HPSΔhhdA缺失株单交换接合子；P1：E.β2155(PEMOC2ΔhhdA)，H1：野生型副猪嗜血杆菌）；

图5：PCR鉴定HPSΔhhdA菌株（M：DL 5000 DNA Mark，4：筛选的HPSΔhhdA菌株；1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12：回复野生型副猪嗜血杆菌基因特征）；

图6：HPS野生型菌株和HPSΔhhdA菌株特异性序列的扩增（1：hhdA-F和hhdA-R引物扩增HPSΔhhdA菌株hhdA基因序列，2：hhdA-F和hhdA-R引物扩增HPS野性型菌株hhdA基因序列，3：hhdA-up-F和hhdA-down-R引物扩增HPS野性型菌株基因序列，4：hhdA-up-F和hhdA-down-R引物扩增HPSΔhhdA菌株基因序列，M：DL 5000 DNA Mark）；

图7：HPSΔhhdA菌株遗传稳定性的鉴定（M: DL 5000 DNA Mark，H1:野生型副猪嗜血杆菌，D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7：为HPSΔhhdA基因缺失菌株传3代、6代、9代、12代、15代、18代、21代）；

图8：HPS野生型菌株与HPSΔhhdA菌株生长特性的比较；

图9： HPSΔhhdA菌株免疫豚鼠后hhdA蛋白抗体水平检测。

图10：HPS hhdA基因ORF区序列表达载体的构建、蛋白表达纯化及免疫反应原性的鉴定（A1: hhdA基因表达载体的构建鉴定，M1: DL2000 mark；A2：SDS-PAGE鉴定hhdA蛋白；M2: 蛋白质marker；A3:Western-blot鉴定hhdA蛋白的免疫反应原性，M3:预染蛋白质marker）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例 1

实施例以本科室分离鉴定的副猪嗜血杆菌血清5型野生型H11菌株（Haemophilus parasuis HPS-H11）（hhdA⁺）（已于2013年7月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION，CCTCC），地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2013316）为亲本菌株，针对hhdA基因上下游序列分别设计特异性引物，扩增上下游同源臂，利用重叠PCR的方法将上下游序列进行连接，构建自杀性质粒载体PEMOC2ΔhhdA，结合转移的方法将PEMOC2ΔhhdA转入亲本菌株中，经相应方法的筛选和鉴定最终获得hhdA基因无抗性标记缺失菌株（HPSΔhhdA）。具体步骤如下：

1 、 HPS-hhdA 基因上、下游序列的扩增

根据GenBank中登录的HPS-SH0165菌株全基因序列，序列号为CP-001321，设计扩增HPS-hhdA基因上游序列的一对引物hhdA-up-F和hhdA-up-R，其中引物hhdA-up-F加有NotⅠ限制性酶切位点（下划线标出）以及保护性碱基。扩增HPS-hhdA基因下游序列的一对引物hhdA-down-F和hhdA-down-R，其中引物hhdA-down-R加有SalⅠ限制性酶切位点（下划线标出）以及保护性碱基。以HPS血清5型野生型菌株为模板进行PCR扩增hhdA基因上游序列560bp（如SEQ ID NO:1所示）和下游序列576bp（如SEQ ID NO:2所示）。引物序列如下所示：

hhdA-up-F: 5’-aaagcggccgcgtgaccgctagcacccactgtc-3’(SEQ ID NO:4)；

hhdA-up-R: 5’- acttgcagaaacgctcacgctaattgtaattcacttgccac -3’（SEQ ID NO:5）；

hhdA-down-F: 5’- gtggcaagtgaattacaattagcgtgagcgtttctgcaagt -3’(SEQ ID NO:6)；

hhdA-down-R: 5’-cgcgtcgacttgcccagttatcttcccagcct-3’(SEQ ID NO:7)。

HPS-hhdA基因上游序列的PCR扩增体系为50μL：菌液模板2μL，5×PrimeSTAR Buffer 10μL，100μmol/L hhdA-up-F/R引物各1μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 4μL，2.5 U/μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，ddH₂O 31.5μL。PCR反应条件为：95℃变性5 min后进入循环，循环参数为94℃45s，60℃20s，72℃50s，30个循环后，72℃延伸10 min。结束后用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行鉴定，并纯化回收HPS-hhdA基因上游序列560bp的特异性目的片段(见图2)，如SEQ ID NO:1所示。

HPS-hhdA基因下游序列的PCR扩增体系为50μL：菌液模板2μL，5×PrimeSTAR Buffer 10μL，100μmol/L hhdA-up-F/R引物各1μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 4μL，2.5 U/μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，ddH₂O 31.5μL。PCR反应条件为：95℃变性5 min后进入循环，循环参数为94℃45s，60℃20s，72℃50s，30个循环后，72℃延伸10 min。结束后用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行鉴定，并纯化回收HPS-hhdA基因下游序列576bp的特异性目的片段(见图2)，如SEQ ID NO:2所示。

、 HPS-hhdA 基因上游序列和下游序列的拼接

采用重叠PCR的方法将上述(1)中扩增纯化回收的hhdA基因上游序列(SEQ和ID NO:1)下游序列(SEQ ID NO:2)进行拼接。

重叠PCR反应第一步：5×PrimeSTAR Buffer 10μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 4μL，hhdA基因上游序列/下游序列各2μL， 2.5 U/μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，ddH₂O 31.5μL，总体积50μL，然后平分到两个PCR管中，按每管25μL的体系进行第一步PCR扩增。PCR反应条件为：95℃变性5 min后进入循环，循环参数为94℃45s，50℃20s，72℃50s，5个循环后，72℃延伸10 min。扩增结束后进行第二步PCR反应，首先配制50μL扩增体系：5×PrimeSTAR Buffer 10μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 4μL，100μmol/L hhdA-up-F引物2μL，100μmol/L hhdA-down-R引物2μL，2.5 U/μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，ddH₂O 31.5μL，然后按每管25μL体系平分到第一步PCR反应结束的两个管中混匀，每管现为50μL体系进行第二步PCR扩增。PCR反应条件为：95℃变性5 min后进入循环，循环参数为94℃45s，60℃20s，72℃70 s，20个循环后，72℃延伸10 min。结束后用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行鉴定，并纯化回收HPS-hhdA基因上下游拼接的融合基因序列片段，大小1136bp (见图2)，如SEQ ID NO:3所示。

、重组自杀性质粒载体 PEMOC2 Δ hhdA 的构建

将回收的hhdA基因上下游拼接的融合基因序列片段（SEQ ID NO:3）用NotⅠ和SalⅠ双酶切，同时用NotⅠ和SalⅠ双酶切自杀性质粒载体PEMOC2，然后将SEQ ID NO:3序列片段同自杀性质粒载体PEMOC2进行连接。体系如下：SEQ ID NO:3序列(NotⅠ-SalⅠ酶切) 4μL，PEMOC2(NotⅠ-SalⅠ酶切) 4μL，10×连接缓冲液1μL，T4 DNA连接酶1μL，4℃连接16小时，然后热应激转化到E.β 2155感受态中，涂布添加有终浓度50μg/mL氯霉素和DAP的LB平板上，37℃培养16小时，挑取单菌落接种至含有50μg/mL氯霉素和DAP的LB液体培养基中，提取质粒进行鉴定。获得的质粒用NotⅠ和SalⅠ双酶切，1%的琼脂糖凝胶观察1136bp的目的片段(见图3)，然后将重组质粒插入的序列进行测序，以验证构建的正确性，筛选得到转化了质粒PEMOC2ΔhhdA的E.β 2155菌株E.β 2155(pEMOC2ΔhhdA)。

、 PEMOC2 Δ hhdA 转入 HPS 野生型菌株中获得阳性单交换结合子菌株

以转化了质粒PEMOC2ΔhhdA的E.β 2155菌株为供体菌，HPS血清5型野生型H11菌株为受体菌，利用结合转移的方法将PEMOC2ΔhhdA转入HPS血清5型野生型菌株中。

供体菌在含有50μg/mL氯霉素和DAP的LB液体培养基中37℃培养过夜，受体菌在含有10μg/mL NAD和10%胎牛血清的TSB液体培养基中37℃培养过夜。然后将培养的两种菌体分别用TSB洗两遍，调整菌液浓度至OD600为0.8，将供体菌和受体菌按1:2的体积比进行混合，涂布于TSA培养基(50μg/mL氯霉素、50μg/DAP、10μg/mL NAD、10%胎牛血清)上培养8小时；用TSB进行冲洗收集菌体涂于含有50μg/mL氯霉素和10μg/mL NAD的TSA培养基上37℃培养过夜，挑取单菌落接种于含有10μg/mL NAD和10%胎牛血清TSB培养基中进行增菌。用hhdA-up-F和hhdA-down-R引物对菌液进行PCR扩增鉴定，扩增体系为25μL：菌液模板1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25 mmol/L MgCl₂ 1μL，2.5 mmol/L dNTPs 2μL，100μmol/L hhdA-up-F引物0.5μL，100μmol/L hhdA-down-R引物0.5μL，2.5 U/μL rTaq 0.25μL，dd H₂O 17.25μL。PCR反应条件为：95℃变性5 min后进入循环，循环参数为94℃45s，60℃40s，72℃1min40s，30个循环后，72℃延伸10 min。结束后用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行鉴定，发生同源重组的阳性单交换子菌液可同时扩增出两条基因片段一条为1136 bp目的片段（即PEMOC2ΔhhdA质粒上的融合基因片段SEQ ID NO:3），另一条为3068bp的目的片段（即上游序列A+hhdA基因+下游序列B），见图4。

、 HPS-hhdA 基因无抗性标记缺失菌株 HPS Δ hhdA 的筛选和获得

在获得阳性单交换接合子的基础上，利用有限稀释连续培养法和特异性基因片段的扩增，筛选获得HPS-hhdA基因缺失菌株。

首先将获得的阳性单交换结合子菌液以1:1000的比例接种到新的TSB培养基（10μg/mL NAD、10%胎牛血清）中进行增菌，37℃过夜培养后用hhdA-up-F和hhdA-down-R引物进行PCR鉴定，扩增体系为25μL：菌液模板1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25 mmol/L MgCl₂ 1μL，2.5 mmol/L dNTPs 2μL，100μmol/L hhdA-up-F引物0.5μL，100μmol/L hhdA-down-R引物0.5μL，2.5 U/μL rTaq 0.25μL，dd H₂O 17.25μL。PCR反应条件为：95℃变性5 min后进入循环，循环参数为94℃45s，60℃40s，72℃1min，30个循环后，72℃延伸10 min。结束后用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行鉴定，若扩增产物中有1136bp条带出现。再从相应的新增菌液中吸取1μL菌液稀释到100μL的TSB中涂于TSA（10μg/mL NAD、10%胎牛血清）平板上，37℃过夜培养后挑取单菌落接种于TSB（10μg/mL NAD、10%胎牛血清）培养基中进行增菌。37℃过夜培养后用hhdA-up-F和hhdA-down-R引物进行PCR扩增鉴定，扩增体系为25μL：菌液模板1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25 mmol/L MgCl₂ 1μL，2.5 mmol/L dNTPs 2μL，100μmol/L hhdA-up-F引物0.5μL，100μmol/L hhdA-down-R引物0.5μL，2.5 U/μL rTaq 0.25μL，dd H₂O 17.25μL。PCR反应条件为：95℃变性5 min后进入循环，循环参数为94℃45s，60℃40s，72℃1min，30个循环后，72℃延伸10 min。结束后用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行鉴定，若扩增产物出现特异性的一条1136bp的目的条带，即筛选获得HPS-hhdA基因缺失的无抗性标记菌株（HPSΔhhdA） (见图5)。

用hhdA-F和hhdA-R引物对获得的hhdA基因缺失菌株进一步PCR扩增鉴定，同时设立HPS野生型菌株对照，扩增体系为25μL：菌液模板1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25 mmol/L MgCl₂ 1μL，2.5 mmol/L dNTPs 2μL，100μmol/L hhdA-F引物0.5μL，100μmol/L hhdA-R引物0.5μL，2.5 U/μL rTaq 0.25μL，dd H₂O 17.25μL。PCR反应条件为：95℃变性5 min后进入循环，循环参数为94℃45s，53℃40s，72℃1.5min，30个循环后，72℃延伸10 min。结束后用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行鉴定，HPS-hhdA基因缺失菌株扩增的基因片段为阴性，从HPS野生型菌株可扩增出hhdA基因1932bp的目的片段(见图6)。hhdA-F和hhdA-R引物对的序列如下所示：

hhdA-F: 5’-taaaaaccttagcgtaggtggc-3’（SEQ ID NO:8）；

hhdA-R: 5’-tgtttcgctgactttattcac-3’（SEQ ID NO:9）。

实施例 2

HPS Δ hhdA 菌株基因缺失遗传稳定性鉴定

将实施例1制备的hhdA基因缺失菌株HPSΔhhdA在TSA（10μg/mL NAD、10%胎牛血清）平板上进行划线培养，挑取单菌落接种到TSB（10μg/mL NAD、10%胎牛血清）培养基中，72℃、200 r/min 培养16 h，增殖的菌液为一代。然后将一代菌液再进行TSA平板上划线培养，挑取单菌落接种到TSB培养基中72℃振荡培养过夜，增殖的菌液为二代，这样反复在TSA和TSB培养基中进行传代，连续培养21代，每隔3代对增殖的菌液用hhdA-up-F和hhdA-down-R引物进行PCR扩增鉴定，扩增体系为25μL：菌液模板1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25 mmol/L MgCl₂ 1μL，2.5 mmol/L dNTPs 2μL，100μmol/L hhdA-up-F引物0.5μL，100μmol/L hhdA-down-R引物0.5μL，2.5 U/μL rTaq 0.25μL，dd H₂O 17.25μL。PCR反应条件为：95℃变性5 min后进入循环，循环参数为94℃45s，60℃40s，72℃1min，30个循环后，72℃延伸10 min。结束后用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行鉴定。如图7所示HPSΔhhdA菌株3代、6代、9代、12代、15代、18代、21代菌液模版所扩增的结果均无差别，表明本发明制备的基因缺失菌株HPSΔhhdA能够稳定遗传。

挑选菌株HPSΔhhdA（Haemophilus parasuis HPSΔhhdA）的单菌落扩大培养后于2013 年7月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION，CCTCC），地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2013317。

实施例 3

HPS Δ hhdA 菌株生长特性的鉴定

将实施例1制备的hhdA基因缺失菌株HPSΔhhdA和野生型菌株复壮后，分别接种于TSB培养基中，37 ℃振荡培养12 h左右并进行平板菌落计数作为种子液。根据计数结果分别将缺失菌株和野性型菌株1×10⁷菌落接种到5mL的TSB液体培养基中，37 °C 200r/min振荡培养，其间每隔2 h取样进行平板菌落计数，将实验结果绘制成曲线，分析鉴定基因缺失菌株的生长特性。如图8所示HPSΔhhdA菌株与野生型菌株的生长特性相似。

实施例 4

HPS Δ hhdA 菌株对豚鼠免疫保护性的鉴定

将实施例1制备的hhdA基因缺失菌株HPSΔhhdA在TSA平板上划线复苏后，分别挑取单菌落接种到TSB液体培养基中，37 °C 200 r/min振荡培养10 h，将其做为种子液按照1%的体积比接种到TSB培养基扩大培养，37 °C 200 r/min振荡培养10 h 后进行平板菌落计数，然后加入甲醛溶液使其终浓度为0.3%，150 r/min振荡灭活24 h以上。使用离心机8000 r/min离心10 min，除去上清收集菌体，将收集的菌体使用PBS洗3次，根据菌落计数结果用PBS配制成4×10⁹CFU/mL的菌液，用白油作为佐剂与配制的菌液按1:1比例混合制成灭活油疫苗。

将体重200~250g健康普通级白化豚鼠进行分组，每组8只，分别使用上述制备的HPSΔhhdA菌株灭活疫苗和野生型菌株（Wild-HPS）灭活疫苗通过皮下多点注射进行免疫，并设立未免疫对照组。免疫程序为一免后第15天进行二免，二免后第15天从豚鼠的后肢静脉采血分离血清。用ELISA方法检测hhdA蛋白抗体水平，将hhdA蛋白用包被液稀释成5μg /mL、100μL/孔包被过夜，0.01g/mL的牛血清白蛋白进行封闭，采集的豚鼠血清l:200稀释、100μL/孔作用30min，山羊抗豚鼠的酶标二抗l:5000稀释、100μL/孔作用30min，加TMB进行显色后并终止反应，酶标仪读取OD450nm的吸光值。如图9所示用野生型菌株灭活疫苗免疫豚鼠后血清中可检测到hhdA蛋白抗体，而HPSΔhhdA菌株灭活疫苗免疫豚鼠后血清中hhdA蛋白抗体同对照组相似。采完血清后用HPS野生型菌株对每只豚鼠进行腹腔注射攻毒(2.0×10⁹CFU/只)，攻毒后观察豚鼠的保护率。如表1所示，用HPSΔhhdA菌株灭活疫苗免疫豚鼠后同野生型菌株灭活疫苗免疫豚鼠后对豚鼠的攻毒保护相似。

ELISA检测中所用到的hhdA蛋白由以下方法制备得到：

根据GenBank中登录的HPS hhdA基因序列(CP001321)设计引物hhdA-ORF-F：5'-CGGGATCCATGAAAGAAGAAGCTGGATT-3'(SEQ ID NO:10)(下划线部分为Bam H 酶切位点)和hhdA-ORF-R：5'-CCCAAGCTTTGTTTCGCTGACTTTATTC -3' (SEQ ID NO:11) (下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点)扩增hhdA基因ORF区序列（1689bp）。序列鉴定酶切后连接pET-32a(+)载体，转化BL21(DE3)宿主菌加入IPTG进行大量诱导表达，利用镍离子树脂柱进行目的蛋白的纯化，SDS-PAGE和Western-blot鉴定表达纯化的蛋白（见图10）。

表1：HPSΔhhdA菌株免疫豚鼠的保护性鉴定

以上实验表明，HPSΔhhdA菌株灭活疫苗免疫动物后不产生相应的hhdA蛋白抗体。可作为研制副猪嗜血杆菌基因工程缺失疫苗的候选菌株之一，并且该基因缺失菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。HPSΔhhdA菌株将为副猪嗜血杆菌基因工程缺失疫苗的研制及鉴别诊断方法的建立奠定基础。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 一种hhdA基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌工程菌株及其构建方法

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 560

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgaccgcta gcacccactg tcaacataac cactacactg cagacaaaaa cgttaaagta 60

gaagagtacc gttccggcaa aaatgaaaaa tatcaagcaa ccaaaatcca agcggataat 120

cttgttgtcg atgtggataa ccgtttaaat gtttctgggg cagatattca agcgaaacaa 180

gcgagtatca tcggtggtca aacccatttt ggtacacaaa tcacaacgaa cgaaagtaac 240

gcacgtaaac atcaatctaa aggtctttgg ttccgtgaag aaaccgataa aactaaagct 300

caaactgttc accgtaccac tgtgactgca gataaactca atgtggtagc aacaaaaggt 360

caagtaacgg ggaatgcggt taaattagca gggcaagatg cttttgttta tggtgataaa 420

ggcgttgcat taaaaggtgt tacacaaaca acacaagctg aagcgacaag caaatttaaa 480

aatgaaactg cccgcttgcg tacaggttct agttcacaaa cagccaatac ccaagcgtta 540

gtggcaagtg aattacaatt 560

<210> 2

<211> 576

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agcgtgagcg tttctgcaag ttaaaccaat ccaacataac catcattaaa taagtaagat 60

aaattaggga aaaaattgaa ttaaacggaa taatgtgaaa taaaaaatga aaaggcatta 120

cacatagaga aataaaaaac tcagccgaga gcctctccca caatttgtgt aaatacctgt 180

ttctgagata atacattcag acacaggtat tttattatga acgaaaaaca acttcacgcc 240

ttggcagcgg aatttgccaa aaatctaaaa acaccggaag acctcaatca attttcacgg 300

atgctcaaga aaatcaccgt cgaggctgcg ttaaatggtg aactgaccga ccatcttggt 360

tatctaaaac gaaaattcag ctttgcattg tgcatttagt gcgtaacagc ttgaaattcg 420

tttcgtggaa agattacaaa gccgtcaccg cagatttaaa gcaggtttat caagccccga 480

cggaagcaca agctcgcgaa aatctgaccg cactttcgca aaaatggcag gcaaaatacc 540

cgcttgtggc gaaaggctgg gaagataact gggcaa 576

<210> 3

<211> 1136

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtgaccgcta gcacccactg tcaacataac cactacactg cagacaaaaa cgttaaagta 60

gaagagtacc gttccggcaa aaatgaaaaa tatcaagcaa ccaaaatcca agcggataat 120

cttgttgtcg atgtggataa ccgtttaaat gtttctgggg cagatattca agcgaaacaa 180

gcgagtatca tcggtggtca aacccatttt ggtacacaaa tcacaacgaa cgaaagtaac 240

gcacgtaaac atcaatctaa aggtctttgg ttccgtgaag aaaccgataa aactaaagct 300

caaactgttc accgtaccac tgtgactgca gataaactca atgtggtagc aacaaaaggt 360

caagtaacgg ggaatgcggt taaattagca gggcaagatg cttttgttta tggtgataaa 420

ggcgttgcat taaaaggtgt tacacaaaca acacaagctg aagcgacaag caaatttaaa 480

aatgaaactg cccgcttgcg tacaggttct agttcacaaa cagccaatac ccaagcgtta 540

gtggcaagtg aattacaatt agcgtgagcg tttctgcaag ttaaaccaat ccaacataac 600

catcattaaa taagtaagat aaattaggga aaaaattgaa ttaaacggaa taatgtgaaa 660

taaaaaatga aaaggcatta cacatagaga aataaaaaac tcagccgaga gcctctccca 720

caatttgtgt aaatacctgt ttctgagata atacattcag acacaggtat tttattatga 780

acgaaaaaca acttcacgcc ttggcagcgg aatttgccaa aaatctaaaa acaccggaag 840

acctcaatca attttcacgg atgctcaaga aaatcaccgt cgaggctgcg ttaaatggtg 900

aactgaccga ccatcttggt tatctaaaac gaaaattcag ctttgcattg tgcatttagt 960

gcgtaacagc ttgaaattcg tttcgtggaa agattacaaa gccgtcaccg cagatttaaa 1020

gcaggtttat caagccccga cggaagcaca agctcgcgaa aatctgaccg cactttcgca 1080

aaaatggcag gcaaaatacc cgcttgtggc gaaaggctgg gaagataact gggcaa 1136

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaagcggccg cgtgaccgct agcacccact gtc 33

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acttgcagaa acgctcacgc taattgtaat tcacttgcca c 41

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

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gtggcaagtg aattacaatt agcgtgagcg tttctgcaag t 41

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

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cgcgtcgact tgcccagtta tcttcccagc ct 32

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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taaaaacctt agcgtaggtg gc 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgtttcgctg actttattca c 21

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgggatccat gaaagaagaa gctggatt 28

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cccaagcttt gtttcgctga ctttattc 28

Claims (10)

1.一种hhdA基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

（1）扩增副猪嗜血杆菌hhdA基因上游序列A和下游序列B，利用重叠PCR方法将上游序列A和下游序列B拼接在一起，得到融合基因序列C；

（2）将步骤（1）得到的融合基因序列C连接到自杀性质粒载体PEMOC2中，得到自杀性质粒载体PEMOC2ΔhhdA；

（3）通过结合转移法将自杀性质粒载体PEMOC2ΔhhdA转入副猪嗜血杆菌野生型菌株中，筛选阳性单交换结合子菌株；

（4）挑选阳性单交换结合子菌株在含NAD的培养基中进行有限稀释连续培养，PCR法筛选hhdA基因缺失的无抗性标记副猪嗜血杆菌工程菌株HPSΔhhdA。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（3）所述的副猪嗜血杆菌为同一血清型的副猪嗜血杆菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（3）所述的副猪嗜血杆菌为HPS血清5型野生型菌株。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）所述副猪嗜血杆菌为HPS 5型H11株，已于 2013年7月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2013316。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述hhdA基因上游序列A如SEQ ID NO:1所示，所述hhdA基因下游序列B如SEQ ID NO:2所示，所述融合基因序列C如SEQ ID NO:3所示。

6.根据权利要求1、3或5所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）的具体操作为：

1）将自杀性质粒载体PEMOC2ΔhhdA热应激转入到E.β2155感受态中，得到含有PEMOC2ΔhhdA质粒的E.β2155菌株E.β2155（PEMOC2ΔhhdA）；

2）将E.β2155（PEMOC2ΔhhdA）和副猪嗜血杆菌菌株在含二氨基庚二酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的TSA培养基上培养，然后冲洗菌体涂于含有氯霉素和NAD的TSA培养基上培养过夜，挑取单菌落接种于含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的TSB培养基中增菌，设计特异性引物hhdA-up-F和hhdA-down-R对菌液进行PCR扩增，能同时扩增出自杀性质粒载体PEMOC2ΔhhdA上的融合基因序列C和副猪嗜血杆菌野生型菌株上的（上游序列A+hhdA基因+下游序列B）片段即为阳性单交换结合子菌株。

7.根据权利要求1、3、5或6所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）的具体操作为：将筛选到的阳性单交换结合子菌株接种到含有NAD的培养基中进行有限稀释连续培养，用引物hhdA-up-F和hhdA-down-R对挑取的单菌落培养液进行PCR扩增，若扩增出特异的一条1136bp的条带，而用hhdA-F和hhdA-R引物没有扩增出hhdA基因的菌株即为目的菌株HPSΔhhdA。

8.权利要求1～7任一项所述的构建方法构建得到的hhdA基因缺失无抗性标记的副猪嗜血杆菌菌株HPSΔhhdA。

9.根据权利要求8所述的hhdA基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌菌株HPSΔhhdA，已于 2013年7月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2013317。

10.权利要求1～9任一项所述的hhdA基因缺失的无抗性标记的副猪嗜血杆菌菌株HPSΔhhdA在制备副猪嗜血杆菌基因工程缺失疫苗上的应用。

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