CN107177531B - 一种提高副猪嗜血杆菌体外培养的促生长剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高副猪嗜血杆菌体外培养的促生长剂。该促生长剂由叶酸、KCl、NaH₂PO₄、NaCl、酵母提取物、NAD、山梨醇、土豆汁和水组成。本发明发现的促生长剂能够显著提高副猪嗜血杆菌本身生长的浓度，无需浓缩菌液便能生产出理想免疫效果的副猪嗜血杆菌灭活疫苗，免疫效价高，免疫效果好这为疫苗厂节约大量的生产成本、可降低疫苗的价格，具有广泛的应用价值。

Description

一种提高副猪嗜血杆菌体外培养的促生长剂

技术领域

本发明涉及一种提高副猪嗜血杆菌体外培养的促生长剂。

背景技术

副猪嗜血杆菌病是近年来严重危害养猪业的新发细菌性传染病，引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜脑炎等，发病率一般为10-15％，死亡率可达50％以上，给养猪业带来了巨大的经济损失，引起了人们的日益重视。

因副猪嗜血杆菌极易产生耐药性，所以控制该病的有效方式是疫苗接种。文献报道商业疫苗或自家苗的使用可以控制副猪嗜血杆菌的感染。但是也有使用灭活菌苗预防失败的实例。灭活疫苗要想达到理想的免疫效果，抗原浓度是非常重要的，副猪嗜血杆菌较难培养，一般很难达到制备疫苗的要求，因此疫苗厂家一般都通过离心浓缩来解决这一问题，但这无形当中增加了生产成本以及工序，给疫苗厂带来了诸多不便，因此提高副猪嗜血杆菌的培养浓度是解决这一问题的关键，同时也可为疫苗厂节约大量的生产成本、降低疫苗的价格。

发明内容

本发明的目的在于一种提高副猪嗜血杆菌体外培养的促生长剂。

本发明所采取的技术方案是：

叶酸和/或土豆汁作为副猪嗜血杆菌促生长剂的应用。

叶酸和/或土豆汁在副猪嗜血杆菌培养基中的应用。

进一步的，上述应用的方法为将副猪嗜血杆菌培养基中加入叶酸和/或土豆汁，使叶酸、土豆汁的浓度分别为1～10mg/mL、4％～8％v/v。

进一步的，上述土豆汁的制备方法为将干净的新鲜土豆捣碎榨汁，加入0.5～2倍体积的无菌水浸泡8～14h，离心取上清，高压灭菌。

一种副猪嗜血杆菌的促生长剂，该促生长剂中含有叶酸和土豆汁。

进一步的，上述促生长剂由叶酸、KCl、NaH₂PO₄、NaCl、酵母提取物、NAD、山梨醇、土豆汁和水组成。

进一步的，上述促生长剂配方为：

叶酸 0.1～10mg/mL

KCl 1.5～7.5mg/mL

NaH₂PO₄ 2～8mg/mL

NaCl 1～6mg/mL

酵母提取物 1～10mg/mL

NAD 10～30μg/mL

山梨醇 30～75mg/mL

土豆汁 1％～10％v/v，余量为水。

上述任一项所述的一种副猪嗜血杆菌的促生长剂，所述土豆汁的制备方法为将干净的新鲜土豆捣碎榨汁，加入0.5～2倍体积的无菌水浸泡8～14h，离心取上清，高压灭菌。

上述任一项所述的促生长剂在副猪嗜血杆菌培养基中的应用。

一种副猪嗜血杆菌培养基，该培养基中含有0.5～10％v/v上述任一项所述的促生长剂。

本发明的有益效果是：

本发明发现的促生长剂能够显著提高副猪嗜血杆菌本身生长的浓度，无需浓缩菌液便能生产出理想免疫效果的副猪嗜血杆菌灭活疫苗，免疫效价高，免疫效果好这为疫苗厂节约大量的生产成本、可降低疫苗的价格，具有广泛的应用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1土豆汁对副猪嗜血杆菌的促生长作用

在现常常规培养副猪嗜血杆菌的培养基中分别添加5％v/v的胡萝卜汁、番茄汁和土豆汁，将添加不同蔬果汁的培养基分别接入1％v/v副猪嗜血杆菌种子液，在常规的条件下进行培养，37℃，120rpm振荡培养24小时，进行活菌计数。同时设置不加任何促生长剂的原培养基进行培养，培养条件均相同。

上述现有常规的培养副猪嗜血杆菌的培养基为含NAD和胎牛血清的TSB培养基，具体制备方法为：将购买的TSB(Tryptone Soy Broth)培养基按照说明书加入水中溶解，于121℃高压灭菌15分钟，待培养基冷却至50℃左右时，无菌条件下每升加入100mL胎牛血清，加入NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，Nicotinamide adenine dinucleotide)使其终浓度为25μg/mL的，4℃保存，即可。

上述土豆汁的制备方法为：将洗干净的新鲜土豆用组织捣碎机捣碎榨汁后，加入1倍体积的无菌双蒸水浸泡12小时，离心机中8000rpm离心15分钟后，取上清于121℃高压灭菌15分钟，4℃保存备用。上述胡萝卜汁、番茄汁的制备方法与土豆汁的制备方法相同。

检测结果如表1所示，从中可以看出不同蔬果汁作为促生长剂时，对副猪嗜血杆菌促生长效果不同，其中玉米汁对副猪嗜血杆菌几乎没有促进效果，该组副猪嗜血杆菌活菌数与不添加促生长剂的菌数差不多，其中胡萝卜汁和番茄汁对副猪嗜血杆菌具有一定的促生长作用，但并不显著，只有将土豆汁作为促生长剂时才具有显著的促副猪嗜血杆菌生长的效果，活菌数可达3.34*10⁹CFU/mL，显著高于不添加促生长剂的1.02*10⁹CFU/mL，可使菌液的浓度提高3倍以上。在研究过程中，我们发现往培养基中加入4％～8％v/v的土豆汁，均可使菌液的浓度提高3倍以上。

表1不同促生长剂对副猪嗜血杆菌生长密度的影响

实施例2叶酸对副猪嗜血杆菌的促生长作用

在现常常规培养副猪嗜血杆菌的培养基(同实施例1)中分别添加叶酸、草酸、苹果酸，使其在培养基中的终浓度分别为1.5mg/mL，将这3种培养基中分别接入1％v/v副猪嗜血杆菌种子液，在常规的条件下进行培养，37℃，120转振荡培养24小时，进行活菌计数。同时设置不加任何促生长剂的原培养基进行培养，培养条件均相同。

检测结果如表2所示，从中可以看出叶酸、草酸、苹果酸分别作为促生长剂时，对副猪嗜血杆菌促生长效果不同，其中草酸、苹果酸对副猪嗜血杆菌促生长和繁殖的效果较弱，副猪嗜血杆菌活菌数相比不添加促生长剂的菌数只是小幅度增加，但将叶酸作为促生长剂时具有显著的促副猪嗜血杆菌生长的效果，活菌数可达2.92*10⁹CFU/mL，显著高于不添加促生长剂的1.02*10⁹CFU/mL，可使菌液的浓度提高约3倍。在研究过程中，我们发现常规培养副猪嗜血杆菌的培养基中含1～10mg/mL的叶酸，均可使菌液的浓度提高约3倍以上。

表2不同成分对副猪嗜血杆菌生长密度的影响

实施例3一种提高副猪嗜血杆菌体外培养的促生长剂

副猪嗜血杆菌促生长剂按下述配方进行配制，其中酵母提取物需进行121℃高压处理，其他成分需进行过滤处理，证促生长剂无菌。促生长剂配制好后4℃保存备用。

副猪嗜血杆菌促生长剂配方：

叶酸 5g/mL

KCl 3mg/mL

NaH₂PO₄ 4mg/mL

NaCl 3mg/mL

酵母提取物 5mg/mL

NAD 21μg/mL

山梨醇 55mg/mL

土豆汁 4％v/v，余量为水。

实施例4一种提高副猪嗜血杆菌体外培养的促生长剂

副猪嗜血杆菌促生长剂按下述配方进行配制，其中酵母提取物需进行121℃高压处理，其

他成分需进行过滤处理，证促生长剂无菌。促生长剂配制好后4℃保存备用。

副猪嗜血杆菌促生长剂配方：

叶酸 0.1g/mL

KCl 7.5mg/mL

NaH₂PO₄ 2mg/mL

NaCl 1mg/mL

酵母提取物 10mg/mL

NAD 10μg/mL

山梨醇 75mg/mL

土豆汁 10％v/v，余量为水。

实施例5一种提高副猪嗜血杆菌体外培养的促生长剂

副猪嗜血杆菌促生长剂按下述配方进行配制，其中酵母提取物需进行121℃高压处理，其

他成分需进行过滤处理，证促生长剂无菌。促生长剂配制好后4℃保存备用。

副猪嗜血杆菌促生长剂配方：

叶酸 10g/mL

KCl 1.5mg/mL

NaH₂PO₄ 8mg/mL

NaCl 6mg/mL

酵母提取物 1mg/mL

NAD 30μg/mL

山梨醇 30mg/mL

土豆汁 1％％v/v，余量为水。

实施例6本发明副猪嗜血杆菌促生长剂的应用

在现常常规培养副猪嗜血杆菌的培养基(同实施例1)中添加实施例3～5任一所述的促生长剂，使促生长剂在培养基中的含量为0.5％～10％(体积百分比)，然后按1/100的体积比接种活化好的副猪嗜血杆菌菌种，37℃，120rpm振荡培养24小时后，取菌液进行活菌计数。

检测结果如表3所示，从中可以看出加含有本发明促生长剂的培养基，可显著提高副猪嗜血杆菌活菌数，提高副猪嗜血杆菌的浓度，尤其是在培养基中含有5％(v/v)的促生长剂时，副猪嗜血杆菌的生长密度最高，可达7.24╳10⁹CFU/mL，将近是不添加促生长剂时生长密度的7倍(表3)。这为实际生产提高副猪嗜血杆菌大大节约生产成本，提高生产效率。

表3不同浓度促生长剂对副猪嗜血杆菌生长密度的影响

实施例7疫苗免疫效果试验

按现有常规技术制备副猪嗜血杆菌疫苗，具体操作方法如下：

1)一级种子液制备：取保存的副猪嗜血杆菌接种于TSA固体平板，在温度为37℃的条件下培养18h；然后挑取单菌落于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120rpm振荡培养18h，进行纯粹检验合格后，作为一级种子液，置2～8℃保存备用，保存时间均不超过3天；

2)二级种子液制备：取步骤1)得到的一级种子液，按种子液与培养基的体积比1:20接种于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120rpm振荡培养16h，进行纯粹检验合格后，作为二级种子液，置2～8℃保存备用，保存时间均不超过3天；

3)原菌液制备：取步骤2)得到的二级种子培养液，按种子液与培养基的体积比1:100分别接种于培养基A、B和C中(培养基成分如表4)，在温度为37℃的条件下，以转速120rpm振荡培养24h后，得到原菌液A、B、C；

表4培养基成分表

组别	培养基成分
		培养基A	TSB
培养基B	含2％v/v本发明促生长剂的TSB
		培养基C	含5％v/v本发明促生长剂的TSB

4)灭活：在上述3种菌液中加入终浓度为0.2～0.4％的甲醛溶液，37℃振荡灭活24h。

5)乳化：在步骤4)得到的灭活菌液中取样，按照《中华人民共和国兽药典》附录进行纯粹检验；将原菌液在转速为8000rpm的条件下离心10min取沉淀的菌体，用无菌生理盐水重悬菌体后洗涤，加入原体积的生理盐水后将制苗菌液与铝胶佐剂以体积比4：1混合，转速8000rpm的条件下乳化20min，得到副猪嗜血杆菌疫苗A、B、C，2～8℃保存备用。

6)免疫效果评价：将上述制备的疫苗分别各免疫5头10日龄仔猪，2mL/头，颈部肌肉注射，14日龄后，进行二免，2mL/头，颈部肌肉注射，另外设置1组试验对照组，免疫生理盐水，二免20日后进行攻毒，每头仔猪腹腔注射副猪嗜血杆菌杆菌5╳10⁹CFU，每头观察临床症状，连续观察10天，记录仔猪发病及死亡情况(表5)。

表5疫苗免疫效果评价结果

组别	免疫疫苗	仔猪数	发病数	死亡数
					1	疫苗A	5	2	0
2	疫苗B	5	0	0
					3	疫苗C	5	0	0
4	生理盐水	5	5	2

注：疫苗A为用常规TSB培养基培养的副猪嗜血杆菌制备的疫苗，疫苗B、C分别为用含2％v/v、5％v/v本发明促生长剂的TSB培养的副猪嗜血杆菌制备的疫苗。

试验结果显示，副猪嗜血杆菌培养时加入2％或5％促生长剂后，所制备的B和C组疫苗免疫效果明显优于未加促生长剂的A组。

灭活疫苗要想达到理想的免疫效果，抗原浓度是非常重要的，目前副猪嗜血杆菌较难培养，通常很难达到制备疫苗的要求，因此疫苗厂家一般都通过离心浓缩来解决这一问题，但这无形当中增加了生产成本以及工序，给疫苗厂带来了诸多不便，因此提高副猪嗜血杆菌的培养浓度是解决这一问题的关键，本发明发现的促生长剂能够显著提高副猪嗜血杆菌本身生长的浓度，有效地解决了这技术难题，无需浓缩便能生产出理想免疫效果的副猪嗜血杆菌灭活疫苗，免疫效价高，免疫效果更好(见表5)，这为疫苗厂节约大量的生产成本、可降低疫苗的价格，具有广泛的应用价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.叶酸和/或土豆汁作为副猪嗜血杆菌促生长剂的应用；该应用的方法为将副猪嗜血杆菌培养基中加入叶酸和/或土豆汁，使叶酸、土豆汁的浓度分别为1～10mg/mL 、4%～8%v/v。

2.叶酸和/或土豆汁在副猪嗜血杆菌培养基中的应用；该应用的方法为将副猪嗜血杆菌培养基中加入叶酸和/或土豆汁，使叶酸、土豆汁的浓度分别为1～10mg/mL 、4%～8%v/v。

3.根据权利要求1～2任一项所述的应用，其特征在于，所述土豆汁的制备方法为将干净的新鲜土豆捣碎榨汁，加入0.5～2倍体积的无菌水浸泡8～14h，离心取上清，高压灭菌。

4.一种副猪嗜血杆菌的促生长剂，其特征在于，该促生长剂配方为：

叶酸 0.1～10mg/mL

KCl 1.5～7.5mg/mL

NaH₂PO₄ 2～8mg/mL

NaCl 1～6mg/mL

酵母提取物 1～10mg/mL

NAD 10～30μg/mL

山梨醇 30～75mg/mL

土豆汁 1%～10%v/v，余量为水。

5.根据权利要求4所述的一种副猪嗜血杆菌的促生长剂，其特征在于，所述土豆汁的制备方法为将干净的新鲜土豆捣碎榨汁，加入0.5～2倍体积的无菌水浸泡8～14h，离心取上清，高压灭菌。

6.权利要求4～5任一项所述的促生长剂在副猪嗜血杆菌培养基中的应用。

7.一种副猪嗜血杆菌培养基，其特征在于，该培养基中含有0.5～10% v/v权利要求4～5任一项所述的促生长剂。