CN104740623A

CN104740623A - 一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法

Info

Publication number: CN104740623A
Application number: CN201510066455.8A
Authority: CN
Inventors: 宋玉伟; 王国栋; 梁秀丽; 冯东亚; 李春堂
Original assignee: Anyang Institute of Technology
Current assignee: Anyang Institute of Technology
Priority date: 2015-02-07
Filing date: 2015-02-07
Publication date: 2015-07-01

Abstract

本发明公开了一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，具体方法为分离得到血清型为O₆₀，O₁₀₁和O₁₃₈致病性的猪大肠杆菌菌株，进行种子培养和扩大培养后，制备获得各菌株菌液，对菌液进行活菌计数，各菌株细菌悬液活菌的含量不低于100亿CFU/mL，符合要求的进行菌液灭活，经灭活的大肠杆菌混合菌液，按照每毫升混合菌液含蜂胶9-10mg的比例加入蜂胶提取液，加注过程中要边加边摇荡，制成浊状菌苗。结果表明，疫苗使用后，因大肠杆菌引起的仔猪黄白痢的发病率为7.69％，死亡率1.92％；未免疫仔猪的黄白痢发病率为32.65％，死亡率14.29％，说明疫苗免疫效果较好。

Description

一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及一种猪疫苗的制备方法，具体为一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法。

背景技术

大肠杆菌病(colibacillosis)是由病原性大肠埃希氏菌所致的一种急性、多型性、肠道传染病，能严重影响仔猪的成活率。其临床表现主要为仔猪黄痢、仔猪白痢和水肿病。其中黄痢多发于7日龄以内哺乳仔猪(病猪主要表现为排黄色或黄白色水样粪便)；白痢多发于10-30日龄仔猪(病猪粪便呈乳白或灰白色)：而水肿病多发于断奶前后的仔猪(病猪多表现神经症状，以胃壁、肠系膜等组织水肿为特征)。这三种病对养猪生产危害极大，在养猪业危害中居首位，严重威胁着养猪业的健康发展，导致饲料报酬率降低、仔猪成活率下降、生长缓慢、生长发育停滞(即所谓的僵猪)，甚至死亡。由于本病发生的原因很多，常表现为多种因素相互作用的结果，有时呈交叉感染，导致临床防治困难，引起仔猪大量死亡，给养猪业带来巨大的经济损失。因此，如何采取有效的措施预防和控制猪场大肠杆菌病已成为养猪业生产的一项重要课题。

目前，猪大肠杆菌病在世界各地均有发生，在我国该病也相当普遍，由于各场的饲养管理、卫生条件、防疫程序等不同，所以大肠杆菌的发病率也有所不同。有资料显示我国华东地区部分规模化猪场，仔猪黄白痢平均发病率为29.0％±3.096，平均死亡率为20.4％±1.9％；猪水肿病平均发病率为17.7％±3.5％，平均死亡率为11.0％±1.3％。

猪大肠杆菌病危害严重，细菌的多重耐药现象已十分严重，四耐及以上的菌株占总受试菌的96％，76.5％菌株耐6～10种药物。药物预防与治疗变得越来越困难。所以，研制猪大肠杆菌疫苗逐渐得到人们的认可和重视。由于大肠杆菌血清型非常复杂，而市场上销售的猪大肠杆菌疫苗与各地致病性猪大肠杆菌血清型有差异，免疫效果不理想。

发明内容

本发明旨在提供一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，目的在于解决由于大肠杆菌血清型非常复杂，而市场上销售的猪大肠杆菌疫苗与各地致病性猪大肠杆菌血清型有差异，免疫效果不理想的技术问题。

本发明通过以技术方案实现：

一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)菌种选择；

2)培养基的配置；

3)菌液制备；

4)活菌计数；

5)菌株灭活；

6)疫苗制备；

进一步的，所述的步骤具体为：

步骤(1)具体为从集的疑似猪大肠杆菌病的病料中分离出血清型为O₆₀，O₁₀₁和O₁₃₈3种致病性的猪大肠杆菌菌株，作为制苗菌株。

步骤(2)具体为制备培养基，营养琼脂培养基成分：蛋白胨11.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，水1000ml，PH值7.3±0.1；麦康凯琼脂培养基成分：蛋白胨21g，牛胆盐5g，氯化钠5g，琼脂14g，乳糖10g，中性红0.03g，水1000ml，PH7.4；马丁肉汤培养基成分：葡萄糖5g，蛋白胨2.5g，KH2PO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.25g，0.1％孟加拉红溶液1.65ml，琼脂7.5～10g，蒸馏水500ml，自然pH，2％去氧胆酸钠溶液10ml(预先灭菌，临用前加入)，链霉素溶液(10000u/ml)1.65ml(临用前加入)。

步骤(3)具体为将各分离的菌株分别接种于马丁肉汤，37℃培养1d，然后划线接种到麦康凯琼脂平板上培养，从中选择表面光滑、隆起、呈粉红色的典型菌落10个，再次接种于马丁肉汤，37℃培养1d，进行纯粹检验后，作为种子，将种子液接种到营养琼脂，37℃培养18h，置室温下，用灭菌生理水浸泡5～8min，然后刮下菌苔，再使用灭菌纱布过滤到灭菌瓶中，得到各菌株的细菌悬液。

步骤(4)具体为分别取各菌株的细菌悬液l mL，做10倍递增稀释，然后按照常规方法进行活菌计数，各菌株细菌悬液活菌的含量不低于100亿CFU/mL。

步骤(5)具体为根据活菌计数的结果，将菌株O₆₀、O₁₀₁、O₁₃₈按4:3:2的比例混合，加人浓度为0.3％的甲醛，于37℃灭活1d，在此期间每隔4h要摇荡1次。

步骤(6)具体为经灭活的大肠杆菌混合菌液，检验合格后，按照每毫升混合菌液含蜂胶9-10mg的比例加入蜂胶提取液，加注过程中要边加边摇荡，制成浊状菌苗，该菌苗含菌量为100亿CFU/mL，蜂胶干物质的量为10mg/mL。

本发明所述的蜂胶在冰箱内4℃以下保存，使用前粉碎，过筛需要在4℃～8℃温度下进行，按照质量体积比1:4比例加入95％乙醇，室温浸泡1-2d，冷却，离心取上清液，即得棕红色纯净蜂胶。去除干渣，浸液放置于4℃以下冰箱保存备用。

本发明的有益效果为：

1)用蜂胶为佐剂，蜂胶制剂注射方便，吸收较快，注射部位无病理变化，不影响胴体品质；

2)采用优势血清型的致病性大肠杆菌菌株O₆₀、O₁₀₁、O₁₃₈混合作为制苗种子，研制猪大肠杆菌多价蜂胶灭活疫苗；

结果表明，疫苗使用后，因大肠杆菌引起的仔猪黄白痢的发病率为7.69％，死亡率1.92％；未免疫仔猪的黄白痢发病率为32.65％，死亡率14.29％。经统计分析，差异极显著，说明疫苗免疫效果较好。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

应用实施例一

实施例1

一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

a.从安阳地区采集的疑似猪大肠杆菌病的病料中分离出血清型为O₆₀，O₁₀₁和O₁₃₈3种致病性的猪大肠杆菌菌株，作为制苗菌株；

b.将所得菌株进行培养，所使用的种子培养基为麦康凯琼脂，扩大培养基用普通琼脂培养基；

c.分别将血清型为O₆₀，O₁₀₁和O₁₃₈3种致病性的猪大肠杆菌菌株接种于马丁肉汤，37℃培养1d，然后划线接种到麦康凯琼脂平板上培养，从中选择表面光滑、隆起、呈粉红色的典型菌落10个，再次接种于马丁肉汤，37℃培养1d，进行纯粹检验后，作为种子，将种子液接种到营养琼脂，37℃培养18h，置室温下，用灭菌生理水浸泡5～8min，然后刮下菌苔，再使用灭菌纱布过滤到灭菌瓶中，得到各菌株的细菌悬液；

d.分别取少许各菌株的细菌悬液，接种于麦康凯琼脂平板上培养，然后取菌落涂片染色镜检，做细菌的纯度检验，应当纯粹无杂菌；

e.分别取各菌株的细菌悬液l mL，做10倍递增稀释，然后按照常规方法进行活菌计数。经过活菌计数，各菌株菌悬液的活菌数量均符合要求，高于100亿CFU/mL。

f.根据活菌计数的结果，将菌株O₆₀、O₁₀₁、O₁₃₈按4:3:2的比例混合，加人浓度为0.3％的甲醛，于37℃灭活1d，在此期间每隔4h要摇荡1次。然后将灭活1d的菌液，分别接种于厌气肉肝汤中和普通琼脂上，37℃培养2d，灭活后菌液接种培养，没有细菌生长。

g.经灭活的大肠杆菌混合菌液，检验合格后，按照一定比例加入蜂胶提取液，加注过程中要边加边摇荡，制成浊状菌苗，所得疫苗为棕褐色的混悬液，粘度较低。

应用实施例二

下面结合具体的实验对本发明实施例1的方法制得的疫苗做进一步的检验。

实验动物：小白鼠30只，来自河南农业大学牧医工程学院动物房。

仪器与设备：上海仕元科学器材有限公司生产的LD-ZX-30KBS型高压灭菌锅。上海基玮试验仪器设备有限公司生产的SPX-5型生化培养箱。由苏州净化设备有限公司生产的SW-CJ-2F型净化工作台。

实施例2安全试验

将使用实施例1方法制备的灭活疫苗，肌肉注射20日龄的哺乳仔猪10头，每头3mL；腹腔注射小白鼠10只，每只0.5mL，观察14d；选择三批孕期2个月未经大肠杆菌免疫的母猪各5头，颈部肌注20mL，观察7～10d。

结果：将制备的大肠杆菌灭活苗注射20日龄的哺乳仔猪、小白鼠和怀孕母猪后观察，均未见异常现象和死亡

实施例3疫苗试验

疫苗试验选用安阳地区饲养条件相同的、孕期70d以前没有用过仔猪黄白痢疫苗免疫过的临床健康的母猪20头进行预防试验，随机分为两组，即本实验灭活苗预防组和未免疫对照组。

本实验灭活苗预防组于产前35d和18d各肌肉注射制备灭活苗5mL，所产仔猪于12日龄再肌肉注射制备灭活苗2mL；对照组不进行任何免疫。

表1仔猪大肠杆菌菌苗预防仔猪黄白痢结果

预防组的发病率为7.69％，死亡率1.92％；未免疫对照组的发病率为32.65％，死亡率14.29％。经统计分析，差异极显著，说明疫苗免疫效果较好，由于时间和资金的原因，我们只对仔猪黄、白痢进行了试验，而猪的水肿病有待于今后进一步研究。

Claims

1.一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)菌种选择；2)培养基的配置；3)菌液制备；4)活菌计数；5)菌株灭活；6)疫苗制备。

2.根据权利要求1所述的一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(1)具体为从集的疑似猪大肠杆菌病的病料中分离出血清型为O₆₀，O₁₀₁和O₁₃₈3种致病性的猪大肠杆菌菌株，作为制苗菌株。

3.根据权利要求1所述的一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(2)具体为制备培养基，营养琼脂培养基成分：蛋白胨11.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，水1000ml，PH值7.3±0.1；麦康凯琼脂培养基成分：蛋白胨21g，牛胆盐5g，氯化钠5g，琼脂14g，乳糖10g，中性红0.03g，水1000ml，PH7.4；马丁肉汤培养基成分：葡萄糖5g，蛋白胨2.5g，KH2PO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.25g，0.1％孟加拉红溶液1.65ml，琼脂7.5～10g，蒸馏水500ml，自然pH，2％去氧胆酸钠溶液10ml，10000u/ml链霉素溶液1.65ml。

4.根据权利要求1所述的一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(3)具体为将各分离的菌株分别接种于马丁肉汤，37℃培养1d，然后划线接种到麦康凯琼脂平板上培养，从中选择表面光滑、隆起、呈粉红色的典型菌落10个，再次接种于马丁肉汤，37℃培养1d，进行纯粹检验后，作为种子，将种子液接种到营养琼脂，37℃培养18h，置室温下，用灭菌生理水浸泡5～8min，然后刮下菌苔，再使用灭菌纱布过滤到灭菌瓶中，得到各菌株的细菌悬液。

5.根据权利要求1所述的一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(4)具体为分别取各菌株的细菌悬液l mL，做10倍递增稀释，然后按照常规方法进行活菌计数，各菌株细菌悬液活菌的含量应不低于100亿CFU/mL。

6.根据权利要求1所述的一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(5)具体为根据活菌计数的结果，将菌株O₆₀、O₁₀₁、O₁₃₈按4:3:2的比例混合，加人浓度为0.3％的甲醛，于37℃灭活1d，在此期间每隔4h要摇荡1次。

7.根据权利要求1所述的一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(6)具体为经灭活的大肠杆菌混合菌液，检验合格后，按照每毫升混合菌液含蜂胶9-10mg的比例加入蜂胶提取液，加注过程中要边加边摇荡，制成浊状菌苗。

8.根据权利要求7所述的一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的蜂胶提取液通过以下方法制备：蜂胶在冰箱内4℃以下保存，使用前粉碎，过筛需要在4℃～8℃温度下进行，按照质量体积比1:4比例加入95％乙醇，室温浸泡1-2d，冷却，离心取上清液，即得棕红色纯净蜂胶提取液，放置于4℃以下冰箱保存备用。