CN111990330B - 小鼠金黄色葡萄球菌型乳房炎模型的构建方法 - Google Patents

小鼠金黄色葡萄球菌型乳房炎模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物技术领域，涉及小鼠金黄色葡萄球菌型乳房炎模型的构建方法。本发明采用微量进样器向小鼠乳腺组织注射金黄色葡萄球菌悬液的方式进行小鼠乳房炎模型的构建。本发明利用从患有临床型奶牛乳房炎的奶样中分离出的金黄色葡萄球菌构建的小鼠乳房炎模型，可广泛应用于金黄色葡萄菌诱发的奶牛乳房炎预防与治疗等研究，并为奶牛乳房炎的研究病因，病理机制、免疫机制、药代动力学以及临床防治提供试验模型基础。

Description

小鼠金黄色葡萄球菌型乳房炎模型的构建方法
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，涉及小鼠金黄色葡萄球菌型乳房炎模型的构建方法。
背景技术
奶牛乳房炎是一种乳腺疾病，发病率高，经济损失高。它不仅影响牛奶的生产和质量，而且危害人类健康。奶牛乳腺炎的发病率高达20%-30%，全世界约有1/3的奶牛患有不同类型的乳腺炎，不仅严重影响牛奶品质，也会影响奶牛的繁殖、生长、发育与牛奶产量。我国因乳腺炎造成的损失达1200～3600元/头牛以上，加上牛奶不能销售的损失和治疗奶牛乳腺炎的药物成本，对奶牛养殖业造成巨大的经济损失，严重制约奶牛养殖业的发展。
病原性微生物感染是奶牛乳房炎的主要原因，金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌之一。金黄色葡萄球菌可以在奶牛的乳腺中定殖和繁殖。金黄色葡萄球菌可以进入并长期存在于细胞中，而一般的抗生素无法进入细胞或细胞中的浓度过低而无法达到治疗效果。
急性的奶牛金黄色葡萄球菌型乳房炎病例常见于最近犊牛的母牛或感染期乳牛，表现为高热（40.5-41.6℃)，精神沉郁，食欲不振，乳区发炎肿胀、坚实疼痛。患金黄色葡萄球菌性乳房炎的产犊小母牛，感染乳区的分泌物中常有米粒样疑块或浓汁。
金黄色葡萄球菌对某些抗生素敏感，但很容易产生耐药性。金黄色葡萄球菌导致的乳房炎主要致病机理是侵入奶牛乳腺组织后，定殖与粘附于乳腺上皮细胞，损害其和腺泡功能，还可出现乳腺肿胀、硬化或瘘管，严重会出现乳腺的坏死和脱落，感染后很难治愈。小鼠乳房炎模型的构建已有一些，但还有一些不足。例如，注射菌液前麻醉可能导致麻醉药物对小鼠自身乃至整个实验产生影响；对小鼠乳房切开后注射菌液再缝合的方式有可能导致感染的风险从而出现并不是所注射菌液而导致的乳房炎情况等。
发明内容
本发明的目的是提供一种小鼠金黄色葡萄球菌型乳房炎模型的构建方法，本发明用从患有临床型奶牛乳房炎的奶样中分离出的金黄色葡萄球菌，经纯化、培养后计数，采用微量进样器对小鼠乳腺组织注射金黄色葡萄球菌悬液的方式进行小鼠乳房炎模型的构建，可广泛应用于金黄色葡萄菌诱发的奶牛乳房炎预防与治疗等研究，并为奶牛乳房炎的研究病因，病理机制、免疫机制、药代动力学以及临床防治提供试验模型基础。
为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：
小鼠金黄色葡萄球菌型乳腺炎模型的构建方法，将金黄色葡萄球菌采用微量进样器经乳腺组织注射，注射后48h处死小鼠，取乳腺组织使用氯仿抽提RNA，再反转录成cDNA后使用荧光定量PCR检测IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平；取乳腺组织进行HE染色与透射电镜试验。
进一步的，qPCR检测采用的序列如下：
基因 引物序列
IL1β-F TGGGTAAAGAATCTGCCTGC
IL1β-R CATAGACTCACCTTCATCTGTTTAG
IL6-F CTGGGTGCTAATGGACTGTG
IL6-R AAGCATCCGTCCTTTTCCTC
TNF-α-F CAAGGGATGGAAGCAGTAGG
TNF-α-R ATTCAGCCCCCTAATCCTAC
β-actin-F CAAGGACCTCTACGCCAACA
β-actin-R ACATCTGCTGGAAGGTGGAC。
进一步的，通过微量进样器给哺乳期小鼠乳腺组织直接注射黄色葡萄球菌悬液，然后检查注射位置是否鼓包注射进皮下组织，同时不能进针太深以防戳穿乳腺组织。
进一步的，所述哺乳期小鼠是指产后7～15天的母鼠。
进一步的，注射后使小鼠自由采食，充足饮水，饲养48小时后处死取乳腺组织。
进一步的，所述金黄色葡萄球菌的菌株从患有临床型奶牛乳房炎的奶样中分离而得。
进一步的，所述金黄色葡萄球菌悬液的浓度为1x104CFU/mL，用NaCl溶液配制。
进一步的，小鼠分为处理组和对照组，所述处理组每只小鼠注射50 uL金黄色葡萄球菌悬液，所述对照组每只小鼠注射50 uL的NaCl溶液。
进一步的，注射时对小鼠的徒手保定方式，具体为抓住小鼠尾巴将小鼠转晕后，用一只手捏住小鼠双耳及其脖颈，另一只手抓住小鼠尾巴后将其腹部斜朝上。
进一步的，注射后将小鼠放回鼠笼，不挪走新生小鼠。
进一步的，乳腺组织的取样方法为：将处死后的小鼠沿着腹中线剪开皮肤，暴露试验乳区，钝性分离乳腺组织。
本发明至少具有下列优点及有益效果：
1）本发明只需熟悉小鼠乳腺位置后进行试验，无需麻醉，消除麻醉药物对小鼠自身乃至整个实验产生影响
2）在不破坏乳头与乳房结构的情况下进行菌液注射，避免其他感染情况，建模结果更加稳定、可靠。
3）本发明无需显微镜等其他实验器材，不深戳的情况下注射后若无鼓包，可以判定注射成功，节省成本。
4）本发明使用的金黄色葡萄球菌是从患有临床型奶牛乳房炎的奶样中分离而得的，构建的模型更接近真实情况，为探究奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎发病机理提供了合适的试验动物模型。
5）本发明构建的小鼠金黄色葡萄球菌型乳房炎模型，可广泛应用于金黄色葡萄菌诱发的奶牛乳房炎预防与治疗等研究，并为奶牛乳房炎的研究病因，病理机制、免疫机制、药代动力学以及临床防治提供试验模型基础。
附图说明
图1是本发明的技术路线图；
图2是本发明实施例1中对照组乳腺组织解剖图；
图3是本发明实施例1中金黄色葡萄球菌处理乳腺组织解剖图（对照组（左）与处理组（右））；
图4是本发明实施例1中病理形态评分；
图5是本发明实施例1中乳腺组织IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平
图6 本发明实施例1中HE染色切片病理结果（对照组（左）与处理组（右））；
图7 本发明实施例1中HE染色切片病理评分；
图8 本发明实施例1中透射电镜结果（对照组（左）与处理组（右））。
具体实施方式
为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。
（1）将预产期前的ICR小鼠随机分为对照组和金黄色葡萄球菌处理组；对照组小鼠3只，金黄色葡萄球菌处理组3只；
（2）小鼠产后第7天，对小鼠的徒手保定方式为抓住小鼠尾巴将小鼠转晕后，用一只手捏住小鼠双耳及其脖颈，另一只手抓住小鼠尾巴后将其腹部斜朝上；通过微量进样器给对照组小鼠乳腺组织注射50uL NaCl无菌溶液，金黄色葡萄球菌处理组注射50uL1x104CFU/mL（5x102CFU）的金黄色葡萄球菌悬液（用无菌NaCl溶液进行配制）；然后检查注射位置是否鼓包注射进皮下组织，同时不能进针太深以防戳穿乳腺组织。使用的金黄色葡萄球菌是从患有临床型奶牛乳房炎的奶样中分离而得的。哺乳期小鼠是指产后7～15天的母鼠，第7天是小鼠产后的泌乳高峰期，适合菌液的注射。
（3）注射后使小鼠自由采食，充足饮水，饲养48小时后采用脊椎脱臼法处死小鼠，取其乳腺组织样品；注射后将小鼠放回鼠笼，不挪走新生小鼠，可以保持小鼠乳腺组织的正常泌乳功能；乳腺组织的取样方法为：将处死后的小鼠沿着腹中线剪开皮肤，暴露试验乳区，钝性分离乳腺组织。
（4）将取得的乳腺组织用生理盐水清洗后，用4%的多聚甲醛溶液固定，经乙醇脱水、石蜡包埋、染色后进行HE染色，观察其病理形态变化。
（5）将取得的乳腺组织用生理盐水清洗后，用2.5%的戊二醛溶液固定，经乙醇脱水、包埋、切片后进行透射电镜试验，观察其组织形态变化。
（6）称取乳腺组织0.1g，加入液氮在用研磨棒在研钵中快速捣碎，转移到研磨器中加入2mL RNA裂解液进行研磨，使用氯仿抽提RNA，再反转录成cDNA后使用荧光定量PCR检测IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。
以下实施例用于说明本发明，所用原料均为市售商品。
实施例1小鼠乳房炎模型的构建
本发明使用的金黄色葡萄球菌是从患有临床型奶牛乳房炎的奶样中分离而得的，由本实验室自行分离后纯化培养而得；ICR试验小鼠由扬州大学兽医学院动物房提供。
本实施例提供一种利用金黄色葡萄球菌构建小鼠乳房炎模型的方法，包括以下步骤：
(1) 金黄色葡萄球菌的培养与计数：将冷冻保存的金黄色葡萄球菌复苏后纯化培养。用NaCl溶液进行倍比稀释，且进行菌落计数。
(2)根据菌落计数结果，用NaCl溶液将金黄色葡萄球菌浓度稀释至1x104CFU/mL。
(3)将6只体型相近且处于预产期的ICR小鼠随机平均分为对照组和金黄色葡萄球菌处理组。试验小鼠饲养于扬州大学无菌动物房，自由采食，充足饮水，温度20～28℃；相对湿度45%～65%，垫料每2天加少许，每4天更换一次。
(4)小鼠产后第7天，对小鼠的徒手保定方式为抓住小鼠尾巴将小鼠转晕后，用一只手捏住小鼠双耳及其脖颈，另一只手抓住小鼠尾巴后将其腹部斜朝上。然后通过微量进样器给对照组乳腺组织注射50uL NaCl溶液，金黄色葡萄球菌处理组乳腺组织注射50uL1x104CFU/mL（5x102CFU）的金黄色葡萄球菌悬液（用NaCl溶液进行配制），试验乳区为左下乳区。注射完成后检查有无鼓包现象。
(5)注射完成后将小鼠放回鼠笼，不移走新生小鼠，维持小鼠乳腺正常泌乳功能。
(6)试验处理后48h采用脊椎脱臼法处死小鼠，沿腹中线剪开皮肤（不剪破腹膜），暴露试验乳区，钝性分离取出乳腺组织样品，同时观察小鼠乳腺组织的损伤情况，包括红肿、出血等变化，并进行评分。
(7)称取乳腺组织0.1g，加入液氮在用研磨棒在研钵中快速捣碎，转移到研磨器中加入2mL RNA裂解液进行研磨，使用氯仿抽提RNA，再反转录成cDNA后使用荧光定量PCR检测IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。检测结果见图5，可知金黄色葡萄球菌处理后，乳腺组织中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量均极显著上调。
本发明实施例1中TNF-α、IL-1β和IL-6的荧光定量引物序列：
基因 引物序列
IL1β-F TGGGTAAAGAATCTGCCTGC
IL1β-R CATAGACTCACCTTCATCTGTTTAG
IL6-F CTGGGTGCTAATGGACTGTG
IL6-R AAGCATCCGTCCTTTTCCTC
TNF-α-F CAAGGGATGGAAGCAGTAGG
TNF-α-R ATTCAGCCCCCTAATCCTAC
β-actin-F（内参基因）CAAGGACCTCTACGCCAACA
β-actin-R（内参基因）ACATCTGCTGGAAGGTGGAC。
(8)将取得的乳腺组织用生理盐水清洗后，用4%的多聚甲醛溶液固定，经乙醇脱水、石蜡包埋、染色后进行HE染色，观察其病理形态变化。图6左为对照组，图6右为金黄色葡萄球菌处理组，乳腺组织表面损伤评分结果如图7所示。从图6可见，金黄色葡萄球菌处理组小鼠乳腺腺泡有显著病理变化，腺泡组织出现了一定程度的破坏。腺泡壁增生明显，可见上皮细胞肿胀，有大量的细胞脱落。
(9)将取得的乳腺组织用生理盐水清洗后，用2.5%的戊二醛溶液固定，经乙醇脱水、包埋、切片后进行透射电镜试验，观察其组织形态变化。图8可见对照组组织微观结构完整，各细胞器清晰完整；处理组已无完整结构，染色质边集，大量脂滴出现。

Claims (1)

1.小鼠金黄色葡萄球菌型乳腺炎模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)金黄色葡萄球菌的培养与计数：将冷冻保存的金黄色葡萄球菌复苏后纯化培养；用NaCl溶液进行倍比稀释，且进行菌落计数；使用的金黄色葡萄球菌是从患有临床型奶牛乳房炎的奶样中分离而得的；
(2)根据菌落计数结果，用NaCl溶液将金黄色葡萄球菌的浓度稀释至1x104CFU/mL；
(3)将6只体型相近且处于预产期的ICR小鼠随机平均分为对照组和金黄色葡萄球菌处理组；ICR小鼠饲养于无菌动物房，自由采食，充足饮水，温度20～28℃；相对湿度45%～65%，垫料每2天加少许，每4天更换一次；
(4)小鼠产后第7天，对小鼠进行徒手保定，抓住小鼠尾巴将小鼠转晕后，用一只手捏住小鼠双耳及其脖颈，另一只手抓住小鼠尾巴后将其腹部斜朝上；然后通过微量进样器给对照组乳腺组织注射50uL NaCl溶液，金黄色葡萄球菌处理组乳腺组织注射50uL 1x104CFU/mL的金黄色葡萄球菌悬液，注射完成后检查有无鼓包现象；同时不能进针太深以防戳穿乳腺组织；
(5)注射完成后将小鼠放回鼠笼，自由采食，充足饮水，不移走新生小鼠，维持小鼠乳腺正常泌乳功能；
(6)试验处理后48h采用脊椎脱臼法处死小鼠，沿腹中线剪开皮肤，钝性分离取出乳腺组织样品，同时观察小鼠乳腺组织的损伤情况，包括红肿、出血变化，并进行评分；
(7)称取乳腺组织0.1g，置入研钵中并加入液氮，用研磨棒在研钵中快速捣碎，再转移到研磨器中加入2mL RNA裂解液进行研磨，使用氯仿抽提RNA，再反转录成cDNA后使用荧光定量PCR检测IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平；
(8)将取得的乳腺组织用生理盐水清洗后，用4%的多聚甲醛溶液固定，经乙醇脱水、石蜡包埋、染色后进行HE染色，观察其病理形态变化；
(9)将取得的乳腺组织用生理盐水清洗后，用2.5%的戊二醛溶液固定，经乙醇脱水、包埋、切片后进行透射电镜试验，观察其组织形态变化；
荧光定量PCR检测采用的序列如下：
基因 引物序列
IL1β-F TGGGTAAAGAATCTGCCTGC
IL1β-R CATAGACTCACCTTCATCTGTTTAG
IL6-F CTGGGTGCTAATGGACTGTG
IL6-R AAGCATCCGTCCTTTTCCTC
TNF-α-F CAAGGGATGGAAGCAGTAGG
TNF-α-R ATTCAGCCCCCTAATCCTAC
β-actin-F CAAGGACCTCTACGCCAACA
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