CN102552894A - 一种乌鳢腹水病疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种乌鳢腹水病疫苗的制备方法，由提取菌种、感染、取材、悬液制备、扩大培养、计数、灭活、合成、稀释、分装、检验十一个步骤组成，所制备的乌鳢腹水病疫苗由费氏枸缘酸杆菌，再加入适量双抗及防腐剂组成，本发明成本低廉，操作方便，可有效提高乌鳢免疫力，防治乌鳢腹水疾病发生。本发明的乌鳢腹水病疫苗，使用方法简便，安全无毒性，对养殖场乌鳢养殖有免疫保护作用，能提高乌鳢养殖成活率，对发生乌鳢腹水病有很好预防效果。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖病害防治领域，具体涉及一种乌鳢腹水病疫苗的制备方法。
背景技术
乌鳢属鲈形目、鳢科，俗称乌鱼、才鱼、黑鱼等，是以鱼类为食的经济价值和营养价值较高的淡水名贵鱼类。乌鳢骨刺少，含肉率高，而且营养丰富，据测定，每100g乌鳢肉含蛋白质19.8g，脂肪1.49g，碳水化合物1.2g，并富含人体所需的钙、磷、铁、锌等营养元素。乌鳢还具有祛湿治病，祛痰生新，通气消肿，活血滋补，生肌补血等药用功效。因此，乌鳢历来深受东南亚各国和港、澳市场的欢迎，是我国外贸出口的重要水产品之一。当前随着乌鳢养殖规模的扩大，集约化养殖程度的提高，其病害的危害也越来越大，其危害程度有加剧趋势，其常见病有：水霉病、腐皮病、烂鳃病、腹水病、出血病、小瓜虫病、红线虫病等，特别是乌鳢腹水病(Ascitesosis of China snakehead)传染性强，发病率高、死亡率最高，可造成鱼种、成鱼大量死亡，给养殖户造成较大经济损失。其病原体是费氏枸缘酸杆菌(Gitrobacter freundii)，是该菌广泛分布于自然界，是人和动物肠道的正常菌落，是机会致病菌，皮肤和肠道是腹水病病原菌的侵入门户。当皮肤受伤可使病原菌侵入机体而发病。引起外伤的主要原因有网捞损伤和寄生虫寄生损伤等。另外，由于投喂变质饵料，乌鳢摄食后，导致肠道内正常菌落失调，为病原菌入侵创造了机会。
近几年来，国产、进口的药物对乌鳢腹水病均无明显疗效或成本太高，效果不明显。只能通过免疫的途径进行预防，而这种疫苗目前在还是空白。
发明内容
本发明提供了一种乌鳢腹水病疫苗的制备方法，本发明成本低廉，操作方便，可有效提高乌鳢免疫力，防治乌鳢腹水疾病发生。
本发明是通过下面的技术方案来实现的。
一种乌鳢腹水病疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)、提取菌种：从患有明显腹水病症状的乌鳢肝脏、肾脏、血液、腹水中分离出病原菌费氏枸缘酸杆菌，立即放入4-8℃的冰箱中保存；
(2)、感染：将分离的病原菌接种于健康的乌鳢体内，在室内进行感染试验，每只乌鳢接种的病原菌数为1×109-2×109个，检查是否有毒力，证明确有毒力才用作制疫苗材料；将分离的病原菌倒入灭菌空试管中，用无菌生理盐水稀释调节菌浓度，与麦氏比浊管进行比色，使菌浓度达到5×109cfu/ml；
(3)、取材：取上述乌鳢发病组织材料，称重，每克组织材料中加0.85％生理盐水9-11毫升10，用研钵或匀浆器进行匀浆，制成9％-10％浓度的组织悬液，将制得的组织悬液直接置于-30℃～-40℃低温冰箱中保存，或者向制得的组织悬液中按10％加入50％的磷酸缓冲甘油，将其置4-8℃的冰箱中保存。
(4)、悬液制备：将步骤(3)分离出的致病菌费氏枸缘酸杆菌接种在普通琼脂营养基或肉汤培养基内，培养24-48小时，加入少量生理盐水，用接种环将菌苔刮下，充分振荡，制成细菌分布均匀的悬液；
(5)、扩大培养：取单个菌落在25-30℃条件下培养48-72小时，振荡使培养斜面上的菌落洗下，或用灭菌接种环轻轻刮下，进行灭活处理；
(6)、灭活：将扩大培养结束的费氏枸缘酸杆菌悬液摇匀，放入60-70℃恒温水浴1.5-2.5小时灭活或32℃恒温水浴中70-73小时灭活，即制成灭活疫苗；
(7)、合成：将灭活后的菌液置于高速离心机中，用3000转/分离心机离心30-40分钟，分离出上清液，向分离出的上清液中添加一定量得青霉素、链霉素和浓度为10％的福尔马林溶液，并摇匀，其中，每10毫升上清液中加入青霉素7500-8500单位、链霉素7500-8500单位，10％浓度的福尔马林溶液0.1-0.12毫升；
(8)、稀释：用0.85％的无菌盐水稀释至灭活菌液浓度为5×109cfu/ml；
(9)、分装：将稀释后的灭活菌液，置于4-8℃冰箱中保存备用；
(10)、检验：对上述稀释好的灭活菌液进行无菌、安全及免疫效果三项检验，要求，灭活菌液中没有活菌存在，灭活细菌的安全的系数要达到100％，免疫保护率达到80％以上；
(11)、检验合格后的灭活菌液，继续置于4-8℃冰箱中保存备用。
步骤(7)合成时，每10毫升上清液中加入青霉素8000单位、链霉素8000单位，10％浓度的福尔马林溶液0.1毫升。
步骤(10)所述的无菌检验方法具体操作是：提取0.2ml灭活菌样本接种在普通营养琼脂培养基上，在25-28℃条件下培养48小时，观察是否形成菌落，若形成菌落则说明疫苗含菌，必须重新灭活，只有在琼脂平板上没有出现菌落出现才说明灭活彻底，灭活菌液中确实没有活菌存在。
步骤(10)所述的安全检验方法具体操作是：对当年健康乌鳢鱼种进行腹腔注射，每尾注射0.3-0.5毫升，在水温25-28℃的水缸中饲养，经15d观察无发病或死亡说明该灭活细菌是安全的，必须做到100％安全才可使用。
步骤(10)所述的免疫效果检验方法具体操作是：在给健康乌鳢接种上述制备的疫苗，二周后进行攻毒，观察免疫保护率，具体操作方法是取上述疫苗，每尾乌鳢注射疫苗量为0.5ml，每天观察乌鳢的发病及症状等情况并做好记录，另外用新鲜的或甘油保存的病鱼组织制成的未经灭活处理的浓度为10％的悬液，分别注射到已注射过疫苗的乌鳢和没有注射过疫苗的乌鳢体内进行对照，每尾按0.3-0.5毫升进行腹腔注射，继续观察15天，如果对照组全部发生腹水病，死亡率在70％以上，病乌鳢症状与天然发病的症状一样或相似，而免疫组仍健康存活，免疫保护率在80％以上，证明此疫苗有效。
免疫方法：
1、注射法。
①注射部位：一般通过肌注或腹腔注射进行免疫，这样操作用量较均，避免浪费。
②注射时间：一般在放养鱼种阶段进行。
③注射剂量：注射一次见效，注射剂量：鱼苗为0.3-0.5毫升/只，成鱼为2毫升/公斤，每毫升疫苗中含有50亿菌，
2、口服方法三天为一个疗程，鱼苗第一天用量为100毫升/公斤饲料，第二、三天减半；成鱼第一天用量为150毫升/公斤饲料，第二天为100毫升/公斤饲料，第三天为50毫升/公斤饲料。在菌苗拌入饲料时，要搅拌均匀，同时菌苗要在投喂前1-4小时拌入饲料，不宜过早，切忌过夜，以免菌苗变质，一般拌有菌苗的饲料为平时每日投喂量的1/5或2/5，等拌有菌苗的饲料吃完后再投放其余饲料。
3、浸浴免疫适用于大批鱼群的免疫，目前在国内应用于生产性鱼池的浸浴免疫方法有：疫苗加莨菪碱法，即用0.5％浓度下充氧浸浴3小时。
本发明的有益效果：
本发明方法制备的乌鳢腹水病疫苗，具有成本低廉，操作方便，可有效提高乌鳢免疫力，防治乌鳢腹水疾病，对乌鳢保护率可以达到80％以上，且防治效果显著，操作方便，易于实现，无任何副作用，可给乌鳢养殖户带来巨大的经济效益和社会效益。
具体实施方式
乌鳢腹水病疫苗的制备方法，具体操作步骤如下：
1、提取菌种：从患有明显腹水病症状的乌鳢肝脏、肾脏、血液、腹水中分离出病原菌费氏枸缘酸杆菌，立即放入4-8℃的冰箱中保存；
2、感染：将分离的病原菌以1-2×109/只的浓度接种于健康的乌鳢体内，感染试验在室内进行，检查是否有毒力，证明确有毒力才用作制疫苗材料；
3、取材：取上述乌鳢发病组织材料，称重，每克组织材料中加0.85％生理-30℃～-40℃低温冰箱中保存，或者放入50％的磷酸缓冲甘油中，置4-8℃的冰箱中保存(使用时一定要用无菌蒸馏水冲洗3次，最后用生理盐水冲洗1次)，按上述从发病的乌鳢体内提取菌种的方法分离出费氏枸缘酸杆菌；
4、悬液制备：将致病菌费氏枸缘酸杆菌接种在普通琼脂营养基或肉汤培养基内，培养24-48小时，加入少量生理盐水，用接种环将菌苔刮下，经过振荡，使成浓厚悬液。须使细菌分布均匀，切忌成块、成团，如果是液体(如肉汤)培养就不必用盐水洗刮；
5、扩大培养：取单个菌落在25-30℃条件下培养48-72小时；
6、计数：用微生物方法进行活菌计数，使每毫升含菌5×1010个；
7、灭活：将费氏枸缘酸杆菌悬液摇匀后放入放入65℃恒温水浴2小时灭活或32℃恒温水浴中72小时灭活，即成灭活疫苗；
8、合成：将灭活后的灭活菌液置于高速离心机中，用3000转/分离心机离心半小时，取其上清液，按照每毫升悬液，加入青霉素800单位、链霉素800单位，并每10毫升悬液中，加入10％浓度的福尔马林0.1毫升，摇匀；
9、稀释：用0.85％无菌盐水稀释灭活菌液至浓度5×109cfu/ml；
10、将悬液按每瓶100毫升进行分装，置于4-8℃冰箱中保存备用。
11、检验包括无菌检验、安全检验、和免疫效果检验。无菌检验是提取0.2ml灭活菌样本接种在普通营养琼脂培养基上，在25-28℃条件下培养48小时，观察是否形成菌落，若形成菌落则说明疫苗含菌，必须重新灭活，只有在琼脂平板上没有出现菌落出现才说明灭活彻底，灭活菌液中确实没有活菌存在。安全检验，是对当年健康乌鳢鱼种进行腹腔注射，每尾注射0.3-0.5毫升，在水温25-28℃的水缸中饲养，经15d观察无异样(无发病或死亡)才说明该灭活细菌是安全的，必须做到100％安全才可使用。免疫效果检验是在给健康乌鳢接种疫苗二周后进行攻毒，观察免疫保护率，方法是取上述疫苗，每尾鱼注射疫苗量为0.6ml，每天观察鱼的发病及症状等情况并做好记录，另外用1∶10新鲜的或甘油保存的病毒组织制成的未经灭活处理的病毒悬液，注射到已注射过疫苗的鱼和没有注射过疫苗的鱼进行对照，每尾按0.3-0.5毫升进行腹腔注射，继续观察15天。如果对照组全部发生腹水病，死亡率在70％以上，病鱼症状与天然发病的症状一样或相似，而免疫组仍健康存活，免疫保护率在80％以上，证明此疫苗有效。
应用乌鳢腹水病疫苗对照实验数据
1、安全检验：选择健康无病、无伤的15-20厘米乌鳢鱼种100尾，分A、B、C、D、E5组，每组20尾，进行腹腔注射，每组注射剂量依次为0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml，室内饲养，水温控制在25℃-28℃，观察15天，五组均无发病和死亡现象，全部存活，见表1。
表1不同剂量灭活苗的安全检验
单位：ml、d、尾
| 组别 | 接种方法 | 剂量 | 观察时间 | 实验数量 | 存活数量 |
| A | 腹腔注射 | 0.1 | 15 | 20 | 20 |
| B | 腹腔注射 | 0.2 | 15 | 20 | 20 |
| C | 腹腔注射 | 0.3 | 15 | 20 | 20 |
| D | 腹腔注射 | 0.4 | 15 | 20 | 20 |
| E | 腹腔注射 | 0.5 | 15 | 20 | 20 |
2、免疫效力检验：选择健康无病、无伤的15-20厘米乌鳢鱼种，100尾，随机分A、B两组，每组50尾，A为试验组，B为对照组，A组每尾腹腔注射灭活苗0.3ml，观察15天，结果A、B两组均无发病和死亡现象，然后进行攻毒试验，取种菌病料悬液，10倍稀释，A、B两组每尾各腹腔接种0.5ml，分别进行正常饲养，水温控制在25℃-28℃左右，观察15天，结果A组死亡5尾，存活45尾，死亡率10％，免疫保护率90％；B组全部死亡，死亡率100％。见表2。
表2乌鳢鱼种接种灭活疫苗后攻毒试验
单位：ml、d、尾、％
3、某场大面积乌鳢种的免疫效力检验：某场内共有乌鳢池7口，随机分为A、B两组，A组鱼池4口，为试验组，B组鱼池3口，为对照组，试验组鱼池待放养鱼种时进行免疫接种，每尾腹腔注射0.5ml，B组不进行接种，只进行常规鱼病预防措施，秋冬起捕时计数对比，结果A组最低免疫保护率81.2％，最高免疫保护率90.8％，平均免疫保护率86％；B组鱼池成活率分别为63.4％、53.9％、65.5％，平均成活率为60.9％，见表3。
表3大面积乌鳢种的免疫效力检验
单位：ml、尾、％
结论：本发明的乌鳢腹水病疫苗，使用方法简便，安全无毒性，对养殖场乌鳢养殖有免疫保护作用，能提高乌鳢养殖成活率，对发生乌鳢腹水病有很好预防效果。
Claims (5)
1.一种乌鳢腹水病疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)、提取菌种：从患有明显腹水病症状的乌鳢肝脏、肾脏、血液、腹水中分离出病原菌费氏枸缘酸杆菌，立即放入4-8℃的冰箱中保存；
(2)、感染：将分离的病原菌接种于健康的乌鳢体内，在室内进行感染试验，每只乌鳢接种的病原菌数为1×109-2×109个 ，检查是否有毒力，证明确有毒力才用作制疫苗材料；将分离的病原菌倒入灭菌空试管中，用无菌生理盐水稀释调节菌浓度，与麦氏比浊管进行比色，使菌浓度达到5×109cfu/ml；
(3)、取材：取上述乌鳢发病组织材料，称重，每克组织材料中加0.85%生理盐水9-11毫升10，用研钵或匀浆器进行匀浆，制成9%-10%浓度的组织悬液，将制得的组织悬液直接置于-30℃～-40℃低温冰箱中保存，或者向制得的组织悬液中按10%加入50%的磷酸缓冲甘油，将其置4-8℃的冰箱中保存；
(4)、悬液制备：将步骤（3）分离出的致病菌费氏枸缘酸杆菌接种在普通琼脂营养基或肉汤培养基内，培养24-48小时，加入少量生理盐水，用接种环将菌苔刮下，充分振荡，制成细菌分布均匀的悬液；
(5)、扩大培养：取单个菌落在25-30℃条件下培养48-72小时，振荡使培养斜面上的菌落洗下，或用灭菌接种环轻轻刮下，进行灭活处理；
(6)、灭活：将扩大培养结束的费氏枸缘酸杆菌悬液摇匀， 放入60-70℃恒温水浴1.5-2.5小时灭活或32℃恒温水浴中70-73小时灭活，即制成灭活疫苗；
(7)、合成：将灭活后的菌液置于高速离心机中，用3000转/分离心机离心30-40分钟，分离出上清液，向分离出的上清液中添加一定量得青霉素、链霉素和浓度为10％ 的福尔马林溶液，并摇匀，其中，每10毫升上清液中加入青霉素 7500-8500单位 、链霉素7500-8500单位， 10％浓度的福尔马林溶液0.1-0.12毫升；
（8）、稀释：用0.85％的无菌盐水稀释灭活菌液至浓度为5×109cfu/ml ；
（9）、分装：将稀释后的灭活菌液，置于4-8℃冰箱中保存备用；
（10）、检验：对上述稀释好的灭活菌液进行无菌、安全及免疫效果三项检验，要求，灭活菌液中没有活菌存在，灭活细菌的安全的系数要达到100%，免疫保护率达到80%以上；
（11）、检验合格后的灭活菌液，继续置于4-8℃冰箱中保存备用。
2.根据权利要求1所述的乌鳢腹水病疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（7）合成时，每10毫升上清液中加入青霉素 8000单位、链霉素8000单位，10％浓度的福尔马林溶液0.1毫升。
3.根据权利要求1所述的乌鳢腹水病疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（10）所述的无菌检验方法具体操作是：提取 0.2ml 灭活菌样本接种在普通营养琼脂培养基上，在25-28℃条件下培养48小时，观察是否形成菌落，若形成菌落则说明疫苗含菌，必须重新灭活，只有在琼脂平板上没有出现菌落出现才说明灭活彻底，灭活菌液中确实没有活菌存在。
4.根据权利要求1所述的乌鳢腹水病疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（10）所述的安全检验方法具体操作是：对当年健康乌鳢鱼种进行腹腔注射，每尾注射0.3-0.5毫升，在水温25-28℃的水缸中饲养，经 15d 观察无发病或死亡说明该灭活细菌是安全的，必须做到100%安全才可使用。
5.根据权利要求1所述的乌鳢腹水病疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（10）所述的免疫效果检验方法具体操作是：在给健康乌鳢接种上述制备的疫苗，二周后进行攻毒，观察免疫保护率，具体操作方法是取上述疫苗，每尾乌鳢注射疫苗量为 0.5 ml ，每天观察乌鳢的发病及症状等情况并做好记录，另外用新鲜的或甘油保存的病鱼组织制成的未经灭活处理的浓度为10%的悬液，分别注射到已注射过疫苗的乌鳢和没有注射过疫苗的乌鳢体内进行对照，每尾按0.3-0.5毫升进行腹腔注射，继续观察15天，如果对照组全部发生腹水病，死亡率在70％以上，病乌鳢症状与天然发病的症状一样或相似，而免疫组仍健康存活，免疫保护率在80%以上，证明此疫苗有效。
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