CN111264461A - 小鼠乳房炎模型的构建方法及应用 - Google Patents

小鼠乳房炎模型的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种小鼠乳房炎模型的构建方法及应用。本发明采用乳导管注射大肠杆菌悬液的方式进行小鼠乳房炎模型的构建。本发明利用大肠杆菌构建的小鼠乳房炎模型，可广泛应用于大肠杆菌诱发的乳房炎预防和治疗以及血乳屏障损伤修复的研究等相关领域，为奶牛乳房炎防治的相关研究提供合适的实验动物模型。

Description

小鼠乳房炎模型的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种小鼠乳房炎模型的构建方法及应用。
背景技术
乳房炎是哺乳动物常见的一种危害较大的临床性疾病，是奶牛乳腺薄壁组织受病原微生物、物理或者化学等致病因素刺激所导致的一种潜在致命性炎症反应。它发病率高、流行快、造成的经济损失巨大。据统计，我国奶牛乳房炎发病率在60％～70％，美国接近40％。全球每年因奶牛乳房炎所导致的产奶量下降、废弃奶产生、患病牛治疗和淘汰等经济损失高达350亿美元。
研究证明，大肠杆菌是诱发奶牛临床性乳房炎的主要环境性致病菌，通常引发急性或超急性乳房炎，临床症状明显。Joren Verbeke等人在2014年对845份奶牛乳房炎样品进行检测分析发现，在一级、二级、三级乳房炎中，大肠杆菌的分离百分比分别为45.8％、36.6％和17.6％。
由大肠杆菌导致的急性乳房炎早期会扰乱其乳腺上皮细胞正常分泌乳汁的功能，导致乳汁中断，还会使血乳屏障发生变化，而屏障功能被破坏后，乳汁中的成分如α-乳清蛋白和酪蛋白会进入血液，血液中的成分也会进入乳汁，严重者形成血乳，导致弃乳。
血乳屏障功能的实现依赖于乳腺上皮细胞的完整性和细胞间的连接复合体实现，包括紧密连接(Tight junction，TJ)、粘附连接(Adhesion junction，AJ)和桥粒(Desmosome)。其中紧密连接是血乳屏障的重要组成部分，位于上皮细胞最顶端的连接复合物，呈连续的带状结构，将相邻的上皮细胞互相连接。
发明内容
本发明的目的是提供一种小鼠乳房炎模型的构建方法及应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种小鼠乳房炎模型的构建方法，采用乳导管注射大肠杆菌悬液的方式进行小鼠乳房炎模型的构建。
所述方法包括：在体视显微镜下，去除乳头最外侧角质层，然后使用微型注射器微型注射器经乳导管给哺乳期小鼠乳腺注射大肠杆菌悬液，然后使小鼠自由采食，充足饮水，饲养8～15h(优选12h)。
优选地，哺乳期小鼠是指产后7～15天(优选8天)的母鼠。
优选地，所述大肠杆菌的菌株编号为ATCC 25922。
优选地，所述大肠杆菌悬液的浓度为2×103～2×105CFU/mL(优选2×104CFU/mL)，用PBS溶液进行配制。每只小鼠注射40～100μL(优选50μL)大肠杆菌悬液。
优选地，所述小鼠为CD-1小鼠。
第二方面，本发明提供按照上述方法获得的小鼠乳房炎模型在大肠杆菌诱发的乳房炎预防和治疗的药物筛选以及血乳屏障损伤修复的机制研究中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明采用乳导管注射活菌的方式进行小鼠乳房炎模型构建，相较于现有的小鼠乳房炎模型构建方法，本方法具有以下优点：
(一)本发明采用在体视体视显微镜下操作，去除乳头最外侧角质层，在基本不破坏乳头的基础上进行菌液注射，更为科学。
(二)本发明利用大肠杆菌构建的小鼠乳房炎模型，可广泛应用于大肠杆菌诱发的血乳屏障损伤机制的研究等相关领域，为探究奶牛大肠杆菌乳房炎发病机理提供合适的实验动物模型。
(三)本发明利用大肠杆菌构建的小鼠乳房炎模型，可广泛应用于大肠杆菌诱发的乳房炎治疗、预防相关药物的筛选与血乳屏障损伤修复的研究等相关领域，为探究奶牛大肠杆菌乳房炎的防治提供合适的实验动物模型。
附图说明
图1为本发明的技术路线图。
图2为本发明实施例1中对照组乳腺组织病理分析结果图。
图3为本发明实施例1中大肠杆菌处理组乳腺组织病理分析结果图。
图4为本发明实施例1中小鼠乳腺组织病理评分示意图。
图5为本发明实施例1中对照组乳腺组织苏木精-伊红染色切片(100×)图。
图6为本发明实施例1中大肠杆菌处理组乳腺组织苏木精-伊红染色切片(100×)图。
图7为本发明实施例1中小鼠乳腺组织苏木精-伊红染色切片病理评分示意图。
图8为本发明实施例1中乳腺组织炎性因子含量示意图。
图9为本发明实施例1中血清炎性因子含量示意图。
图10为本发明实施例1中血乳屏障中紧密连接蛋白ZO-1免疫荧光染色图。
图11为本发明实施例1中血乳屏障中紧密连接蛋白Claudin-3免疫荧光染色图。
图12为本发明实施例1中血乳屏障中紧密连接蛋白Occludin免疫荧光染色图。
图13为血乳屏障中紧密连接的透射电镜(TEM)示意图。
其中，图4、图7-图9中**表示与对照组相比差异显著。
具体实施方式
本发明提供一种利用大肠杆菌构建小鼠乳房炎模型的方法，包括以下步骤：
(1)将怀孕18天左右的CD-1小鼠随机分为对照组和大肠杆菌处理组。
(2)小鼠产后8天左右移走新生小鼠，对照组和大肠杆菌处理组小鼠采用舒泰进行麻醉。在体视体视显微镜下，去除乳头最外侧角质层，然后通过微型注射器给对照组乳导管注射50μL PBS无菌溶液，大肠杆菌处理组注射50μL 2×104CFU/mL(103CFU)的大肠杆菌悬液(用无菌PBS溶液进行配制)。
(3)试验处理后12h采用断颈法处死小鼠，取其乳腺组织样品和血液样品。
(4)将取得的乳腺组织用生理盐水清洗后，用4％的甲醛溶液固定，经乙醇脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，观察其组织病理形态变化。
(5)称取乳腺组织0.2g，加入2000μL RAPI组织细胞裂解液，用玻璃匀浆器制备匀浆，12000rpm离心10min，收集上清液进行ELISA分析，检测样品中的炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β。
(6)所得血液样品经12000rpm离心10min，收集上清液进行ELISA分析，检测样品中的炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β。
进一步地，如上述的利用大肠杆菌构建小鼠乳房炎模型的建立方法，步骤(1)中，对照组小鼠5只，大肠杆菌处理组5只。
进一步地，如上述的利用大肠杆菌构建小鼠乳房炎模型的建立方法，步骤(2)中，麻醉小鼠采用舒泰(50mg/mL)肌肉注射的方式，给药量为50μL。
进一步地，如上述的利用大肠杆菌构建小鼠乳房炎模型的建立方法，步骤(2)中，所用的大肠杆菌菌株为ATCC 25922。
进一步地，如上述的利用大肠杆菌构建小鼠乳房炎模型的建立方法，步骤(3)中，乳腺组织的取样方法为：处死小鼠后，沿腹中线剪开皮肤(不剪破腹膜)，暴露试验乳区，钝性分离乳腺组织。
进一步地，如上述的利用大肠杆菌构建小鼠乳房炎模型的建立方法，步骤(3)中，小鼠血液样品的采集方法为眼球采血法。
本发明的技术路线图见图1。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1小鼠乳房炎模型的构建
本发明所用大肠杆菌菌株为ATCC 25922，由北京中源合聚生物科技有限公司提供；试验小鼠由斯贝福(北京)实验动物科技有限公司提供；炎性因子ELISA试剂盒由英潍捷基(上海)贸易有限公司提供；其余试剂由索莱宝生物科技有限公司提供。
本实施例提供一种利用大肠杆菌构建小鼠乳房炎模型的方法，包括以下步骤：
(1)大肠杆菌的培养与计数：采用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基进行菌株传代，胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基进行菌落计数，挑取单菌落于TSB培养基，37℃，120rpm下振荡培养24h。TSA培养基在121℃下高压15min，待溶液冷却至45℃左右时倒至平板培养皿备用。按照10倍倍比稀释的方式，将菌液用PBS溶液等比稀释102、104、106倍，取稀释液10μL均匀滴于TSA琼脂培养基，每个稀释倍数设置四个重复，于37℃培养箱中倒置培养24h后进行菌落计数。
(2)根据菌落计数结果，用PBS溶液将大肠杆菌浓度稀释至2×104CFU/mL。
(3)将10只怀孕18天左右的CD-1小鼠随机平均分为对照组和大肠杆菌处理组。试验小鼠饲养于中国农业大学实验动物平台，自由采食，充足饮水，温度18～29℃；相对湿度40％～70％，垫料3天更换一次。
(4)小鼠产后8天左右移走新生小鼠，对照组和大肠杆菌处理组小鼠采用50μL舒泰进行麻醉，麻醉剂体积为50mg/kg。在体视体视显微镜下，去除乳头最外侧角质层，通过微型注射器给对照组乳导管注射50μL PBS溶液，大肠杆菌处理组注射50μL2×104CFU/mL(103CFU)的大肠杆菌溶液(用PBS溶液进行配制)，试验乳区为第四对乳区。
(5)试验处理后12h采用断颈法处死小鼠，沿腹中线剪开皮肤(不剪破腹膜)，暴露试验乳区，钝性分离取其乳腺组织样品备用，同时眼观小鼠乳腺组织的损伤情况，包括红肿、出血等变化，并进行评分。图2为对照组，图3为大肠杆菌处理组，乳腺组织表面损伤评分结果如图4所示。由图3可见，103CFU大肠杆菌处理后小鼠乳腺组织有轻微发红出血现象。由图4可以看出，大肠杆菌处理组组织病理学评分显著高于对照组(P<0.05)。此外，通过眼球采样法取其血液样品，与乳腺组织样品一同检测其中的炎性因子含量。
(6)将取得的乳腺组织用生理盐水清洗后，用4％的甲醛溶液固定，经乙醇脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，观察其病理形态变化，并进行乳腺组织损伤评分。图5为对照组，图6为大肠杆菌处理组，乳腺组织表面损伤评分结果如图7所示。从图5可见大肠杆菌处理组小鼠乳腺腺泡有轻微的病理变化，有少量嗜中性粒细胞，腺泡组织出现了一定程度的破坏。由图6可知，大肠杆菌处理组组织病理学评分显著高于对照组(P<0.05)。
(7)称取乳腺组织0.2g，加入2000μL RAPI组织细胞裂解液，用玻璃匀浆器制备匀浆，12000rpm离心10min，收集上清液进行ELISA分析。血清样品及组织裂解上清液中的炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β检测结果见图8和图9，可知大肠杆菌处理后，乳腺组织和血清中的炎性因子含量均显著上调。
(8)将所得乳腺组织通过免疫荧光染色的方法对其中的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-3、Occludin进行检测，主要方法如下：
1)蛋白样品的上样量为40μg。采用12％的聚丙烯酰胺凝胶，蛋白样品的上样量为40μg，采用湿转转膜将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(美国Bio-Rad电泳仪)；
2)用牛血清蛋白(BSA)4℃封闭过夜；
3)加入一抗(抗体来源：北京博奥森生物技术有限公司)孵育3h；
4)使用TBST洗涤缓冲液洗膜5次，每次6min；
5)加入二抗(抗体来源：金氏生物科技(上海)有限公司)孵育1h；
6)使用TBST洗涤缓冲液洗膜5次，每次6min；
7)使用照胶仪(Bio-Rad，美国)及ImageJ灰度分析蛋白表达量；
其结果如图10～图12所示，可知大肠杆菌处理后，血乳屏障中的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-3、Occludin被破坏。
(9)将所得的乳腺组织通过透射电镜观测其中的紧密连接结构，其结果如图13所示，可知大肠杆菌处理后，血乳屏障中的紧密连接结构被破坏。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.小鼠乳房炎模型的构建方法，其特征在于，将大肠杆菌悬液采用微型注射器经乳导管注射的方式进行小鼠乳房炎模型的构建。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：在体视体视显微镜下，去除乳头最外侧角质层，然后通过微型注射器给哺乳期小鼠乳导管注射大肠杆菌悬液，然后使小鼠自由采食，充足饮水，饲养8～15h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，哺乳期小鼠是指产后7～15天的母鼠。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌的菌株编号为ATCC25922。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌悬液的浓度为2×103～2×105CFU/mL，用PBS溶液进行配制。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，每只小鼠注射40～100μL大肠杆菌悬液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述小鼠为CD-1小鼠。
8.按照权利要求1-7任一项所述方法获得的小鼠乳房炎模型在大肠杆菌诱发的乳房炎预防和治疗的药物筛选以及血乳屏障损伤修复的机制研究中的应用。
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