CN113040094A - 一种牛支原体性小鼠乳腺炎模型的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种牛支原体性小鼠乳腺炎模型的构建方法及其应用。本发明提供了一种小鼠乳腺炎模型的构建方法，包括如下步骤：将感染液接种至泌乳期小鼠的乳腺；所述感染液是用无菌缓冲溶液悬浮牛支原体NMH7株得到的。具体的，接种方式可为通过小鼠乳导管接种。具体的，小鼠的乳腺为小鼠的第四对乳腺。本发明还保护N‑acetyl‑L‑cysteine在制备牛支原体奶牛乳房炎药物中的应用。本发明构建的模型，能够模拟临床上牛支原体奶牛乳房炎发生时，奶牛乳腺发生的病理变化，具有良好的可重复性和便捷性，具有良好的实际应用价值。

Description

一种牛支原体性小鼠乳腺炎模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及一种牛支原体性小鼠乳腺炎模型的构建方法及其应用。
背景技术
牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)可引起牛发生乳房炎、肺炎、关节炎和中耳炎等多种疾病。奶牛乳房炎是由于病原微生物感染或其他物理化学刺激等因素引起奶牛乳腺出现红、肿、热、痛等炎症反应，是引起世界范围内奶牛业经济损失最严重的疾病。牛支原体性奶牛乳房炎可导致奶牛出现发热等全身症状，乳区局部可出现红肿热痛等炎症反应。牛支原体性奶牛乳房炎可导致牛奶产量急剧下降或停止产奶，奶中脂肪或蛋白含量降低，奶品质下降，严重影响奶牛生产性能。感染的奶牛乳腺变硬，可诱发乳腺组织纤维化发展，甚至导致乳腺萎缩，增加奶牛的淘汰率，提高生产成本。牛支原体性奶牛乳房炎传染性极强，临床上依靠以杀灭牛支原体为主要目的抗生素治疗方案效果不佳，给奶牛养殖业造成巨大的经济损失。
牛支原体已经成为制约规模化奶牛养殖业发展的重要因素之一。然而，由于缺乏标准化实验动物模型，给牛支原体相关疾病的防控、新型治疗药物和疫苗研发带来巨大的障碍。目前，针对牛支原体的致病模型主要有犊牛、豚鼠的肺炎模型，为牛支原体呼吸道相关疾病的疫苗研发奠定了良好基础。然而，针对牛支原体引起的奶牛乳房炎，尚缺乏有效的病理损伤评价模型。血乳屏障的结构特殊性使支原体乳房炎的治疗方案不同于牛支原体肺炎模型，给奶牛乳房炎的抗炎治疗方案以及抗生素替代药品研发带来障碍。因此，十分有必要构建一种易于操作和标准化的支原体乳房炎模型，为研发牛支原体奶牛乳房炎新型治疗方案奠定技术基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛支原体性小鼠乳腺炎模型的构建方法及其应用。
本发明提供了一种小鼠乳腺炎模型的构建方法，包括如下步骤：将感染液接种至泌乳期小鼠的乳腺；所述感染液是用无菌缓冲溶液悬浮牛支原体NMH7株得到的。
所述缓冲溶液具体可为磷酸盐缓冲溶液。
所述小鼠具体可为CD-1小鼠。
接种量为每个乳腺接种感染液100μl以上。
接种量具体可为每个乳腺接种感染液100μl。
感染液中，牛支原体NMH7株的浓度为1×106CFU/ml以上。
感染液中，牛支原体NMH7株的浓度具体可为1×106CFU/ml。
具体的，接种方式可为通过小鼠乳导管接种。
接种方式也可为其他现有技术中的接种方式。
泌乳期小鼠为分娩4-7天后的小鼠。
泌乳期小鼠具体可为分娩5天后的小鼠。
时间选择在分娩4-6天后，理由是小鼠分娩后，乳腺开始发育，在第4天乳腺腺泡发育成熟，最适于感染模型的制作。注射时间不宜过晚，因为小鼠泌乳期为14天，时间太晚，乳腺会退化，腺泡被脂肪组织代替，无法用于感染模型制作。在本模型中，选在分娩4-6天后，目的在于选择乳腺腺泡最为成熟，功能最佳的状态。
具体的，小鼠的乳腺为小鼠的第四对乳腺。小鼠一共有五对乳腺，其中第四对乳腺最为发达，适用于感染模型的建立。
所述方法还可包括如下步骤：接种后，通过接种感染液的乳腺的病原载量和/或病理损伤程度和/或炎症反应指标进行评价，确认模型构建成功。
具体的，可于接种感染液12小时以后进行所述评价。
具体的，可于接种感染液12-72小时进行所述评价。
具体的，可于接种感染液12小时和/或24小时和/或48小时和/或72小时进行所述评价。
所述炎症反应指标具体可为促炎症细胞因子表达水平。
促炎症细胞因子具体可为IL-1β和/或COX2。
所述病理损伤程度具体可通过免疫组化和/或HE染色观察。
本发明中，从病原载量、病理损伤和促炎症细胞因子三个方面检测多项可量化的指标，对构建的小鼠乳腺炎模型进行了评价。结果表明，牛支原体感染小鼠乳腺引起小鼠乳腺损伤，具有良好的重复性和便捷性。
本发明还保护牛支原体NMH7株或感染液在制备小鼠乳腺炎模型中的应用；
所述感染液是用无菌缓冲溶液悬浮牛支原体NMH7株得到的。
所述缓冲溶液具体可为磷酸盐缓冲溶液。
感染液中，牛支原体NMH7株的浓度为1×106CFU/ml以上。
感染液中，牛支原体NMH7株的浓度具体可为1×106CFU/ml。
具体的，以上任一所述磷酸盐缓冲溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲溶液。
本发明还保护以上任一所述方法构建的小鼠乳腺炎模型在药物筛选和/或药效评估中的应用。
所述药物为牛支原体相关疾病的治疗药物。
所述药物为牛支原体相关疾病的预防药物。
所述药物为牛支原体奶牛乳房炎药物的治疗药物。
所述药物为牛支原体奶牛乳房炎药物的预防药物。
本发明还保护N-acetyl-L-cysteine在制备牛支原体奶牛乳房炎药物中的应用。
本发明构建的模型，能够有效地模拟牛支原体性奶牛乳房炎损伤，能够评价乳腺炎的药物治疗效果。本发明构建的模型，能够模拟临床上牛支原体奶牛乳房炎发生时，奶牛乳腺发生的病理变化，具有良好的可重复性和便捷性，具有良好的实际应用价值。
本发明为牛支原体奶牛乳房炎新型抗炎治疗方案以及抗生素替代药品的研发提供了易于标准化的技术手段，有助于促进牛支原体相关疾病的防控策略和新型治疗方案的开发。
附图说明
图1为实施例2中牛支原体病原载量的结果和免疫组化的结果。
图2为实施例2中HE染色的结果和随机视野内乳腺腺泡平均直径的结果。
图3为实施例2中IL-1β和COX2的结果。
图4为实施例3中HE染色的结果、乳腺腺泡平均直径的结果、IL-1β的结果和COX2的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。小鼠共有5对乳房，最靠近头部的为第一对乳房，其后依次为第二对乳房，第三对乳房、第四对乳房和第五对乳房。第四对乳腺即第四对乳房的乳腺。PPLO培养基：美国BD公司，货号0175457。PPLOA培养基：美国BD公司，货号241210。如无特殊说明，实施例中的PBS缓冲液均为pH7.4的PBS缓冲液。如无特殊说明，实施例中的磷酸盐缓冲溶液均为pH7.4的磷酸盐缓冲溶液。CD-1小鼠：斯贝福(北京)生物技术有限公司。
实施例1、用于感染的毒株选择
牛支原体NMH7株为发明人所在课题组于2018年在源自内蒙古某奶牛场奶样中分离得到的牛支原体分离株。经过流行病学、致病性分析，牛支原体NMH7株的基因型特征以及致病性获得了大量的背景信息。
多基因位点序列分析结果表明，牛支原体NMH7株属于我国境内新发现的基因型，ST173，其背景信息收录于MLST数据库(https://pubmlst.org/bigsdb？db＝pubmlst_mbovis_isolates&page＝query)(详见doi：10.1016/j.prevetmed.2020.105106)。牛支原体NMH7株记载于：https://pubmlst.org/bigsdb？db＝pubmlst_mbovis_isolates&page＝query，ID编号为1015。
进一步来说，发明人对全国范围内奶牛场来源的奶样进行检测，发现该基因型主要分布于内蒙古和河北地区；随后，发明人所在实验室于2018年在河北邢台市某牛场的三头犊牛肺炎肺脏中也分离获得同一基因型分离株，表明该基因型分离株在我国牧场中具有一定的地区性流行，同时，该基因型分离株与奶牛乳房炎和犊牛肺炎密切相关。
细胞感染实验结果表明，牛支原体NMH7株的致病性主要表现为：感染奶牛乳腺上皮细胞，引起后者产生显著的细胞损伤和明显的形态学变化，通过引起细胞内活性氧水平上升启动细胞凋亡(详见doi:10.3168/jds.2020-18599)。
由于牛支原体NMH7株具有明确的流行病学和对奶牛乳腺上皮细胞的致病性背景信息，所以，本发明中选择牛支原体NMH7株用于小鼠乳腺感染模型制造。
实施例2、牛支原体感染引起小鼠乳腺炎
一、构建乳腺炎模型小鼠
将感染液接种至分娩5天后的泌乳期CD-1小鼠。接种方式为通过小鼠乳导管接种。接种部位为小鼠的第四对乳腺。感染液是用无菌磷酸盐缓冲溶液悬浮牛支原体NMH7株得到的，牛支原体浓度为1×106CFU/ml。接种量为每个乳腺100μl感染液。
二、对照小鼠
将无菌磷酸盐缓冲溶液接种至分娩5天后的泌乳期CD-1小鼠。接种方式为通过小鼠乳导管接种。接种部位为小鼠的第四对乳腺。接种量为每个乳腺100μl无菌磷酸盐缓冲溶液。
三、相关指标的检测
分别于接种12小时、24小时、48小时和72小时，解剖小鼠，取第四对乳腺组织，进行病原学检测和病理学检测，并对其主要促炎症细胞因子(IL-1β和COX2)的表达水平进行分析。每次至少对3只小鼠进行检测，结果取平均值。
1、病原学检测
PPLO培养基的制备方法：称取PPLO培养基10.5g，溶解于350g蒸馏水中，置121℃高压蒸汽灭菌20分钟；冷却后，加入马血清200ml和过滤除菌的0.5％酚红溶液1ml，加入10万U/ml青霉素G钠盐5ml，得到PPLO培养基；置2-8℃冷藏保存。
PPLOA培养基平板的制备：称取PPLOA培养基17.5g，溶解于350g蒸馏水中，置121℃高压蒸汽灭菌20分钟；冷却至约55℃后，加入马血清200ml和过滤除菌的10万U/ml青霉素G钠盐5ml；然后，用无菌吸管量取20ml加入直径90mm平皿中，待冷却后，得到PPLOA培养基平板；置2-8℃冷藏保存。
无菌环境中取小鼠1/4乳腺，置于无菌离心管中，称重。将组织转置于组织研磨器中，按照组织：PBS＝1:9(g：ml)的配比加入无菌PBS缓冲液，用组织研磨器充分研磨。取研磨液转置于一个新的无菌离心管中，用无菌PBS缓冲液按照1:10的体积比进行10倍系列稀释。选10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀释度，取各稀释度悬液50μl，均匀涂布于PPLOA培养基平板上。将平板转置于37℃含5％CO2的生化培养箱中培养10天，从第3天开始，每天借助普通光学显微镜在100倍视野下观察牛支原体菌落形成状态，计算乳腺组织中的牛支原体病原载量。
乳腺炎模型小鼠的结果见图1A。图1A中，纵坐标为每个乳腺的牛支原体载量(CFU/乳腺)，横坐标为从完成接种开始计时的时间。牛支原体感染12小时，小鼠乳腺的牛支原体载量显著高于接种剂量(1×105CFU/乳腺)。牛支原体感染24小时，小鼠乳腺中牛支原体迅速增殖，达到108CFU/乳腺的数量级，表明牛支原体在CD-1小鼠乳腺中大量增殖。
2、病理学检测
制备兔抗牛支原体抗体：牛支原体NMH7株经0.1％甲醛灭活，然后经皮下注射接种成年兔(108CFU/只)，每间隔7天接种一次，在第三次接种一周后，耳静脉采血，先37℃静置1小时再2-8℃静置1小时，然后2000g离心10分钟，取上清，即为兔抗牛支原体抗体。
无菌环境中取小鼠1/4乳腺，置于无菌离心管中，加入4％多聚甲醛固定液固定24小时。组织块修整后，依次经30％、50％、70％、80％、95％和100％乙醇各脱水处理30分钟，依次用50％二甲苯乙醇溶液和100％二甲苯进行透明处理30分钟。将组织块用石蜡浸蜡包埋。用组织切片机切取4μm切片，经展片、烤片后常温保存备用。将切片用苏木精伊红染色法染色，观察组织的形态学变化。用兔抗牛支原体抗体对小鼠乳腺组织石蜡切片进行免疫组化检测。在显微镜100倍视野下，观察炎性细胞浸润情况。对随机观察的视野进行拍照，应用Image J(National Institutes of Health,Bethesda,MD)软件分析随机视野内乳腺腺泡平均直径。
牛支原体感染24小时乳腺炎模型小鼠和平行对照小鼠的免疫组化结果见图1B。乳腺炎模型小鼠的乳腺腺泡中存在大量增殖的牛支原体，腺泡内的炎性细胞和腺泡上皮细胞均感染牛支原体。
牛支原体感染12小时、24小时、48小时和72小时乳腺炎模型小鼠和平行对照小鼠的HE染色的结果见图2A。随机视野内乳腺腺泡平均直径的变化分析的结果见图2B。图2B中，纵坐标为乳腺腺泡直径(μm)，横坐标为从完成接种开始计时的时间(小时)。牛支原体感染12、24、48和72小时，引起小鼠乳腺腺泡内和间质发生炎症细胞浸润。牛支原体感染48和72小时，感染组小鼠乳腺腺泡呈现结构紊乱状态。乳腺炎模型小鼠的乳腺腺泡直径显著小于对照小鼠。
3、应用ELISA方法检测小鼠乳腺组织中主要促炎症细胞因子(IL-1β和COX2)
无菌环境中取小鼠1/4乳腺，置于无菌离心管中，称重，无菌PBS缓冲液洗涤三次。用灭菌处理后的滤纸吸干组织表面残留的液体，转入组织研磨器，按照组织：PBS＝1:9(g：ml)的配比加入无菌PBS缓冲液，充分研磨裂解组织。取研磨液，2-8℃、10000g离心15分钟，取上清。分别用小鼠IL-1β检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司的ELISA试剂盒)或小鼠COX2 ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司的ELISA试剂盒)进行检测。
乳腺炎模型小鼠和平行对照小鼠的IL-1β结果见图3A。乳腺炎模型小鼠和平行对照小鼠的COX2结果见图3B。图3中，纵坐标为上清中的IL-1β/COX2含量(pg/ml)，横坐标为从完成接种开始计时的时间(小时)。牛支原体感染24、48和72小时，乳腺炎模型小鼠的IL-1β和COX2表达水平均显著高于对照小鼠。
实施例3、活性氧清除剂对牛支原体感染引起小鼠乳腺炎的保护作用实验
NAC(N-acetyl-L-cysteine)：一种活性氧清除剂，美国Sigma公司，货号A7250。
NAC用无菌生理盐水稀释，得到浓度为10mM的NAC溶液。
一、M.bovis组+NAC组的处理方式
1、取分娩5天后的泌乳期CD-1小鼠，腹腔注射NAC溶液(150mg NAC/kg体重)。
2、完成腹腔注射12小时后接种感染液。接种方式为通过小鼠乳导管接种。接种部位为小鼠的第四对乳腺。感染液是用无菌磷酸盐缓冲溶液悬浮牛支原体NMH7株得到的，牛支原体浓度为1×106CFU/ml。接种量为每个乳腺100μl感染液。
3、接种感染液72小时，解剖小鼠，取第四对乳腺组织，进行病理学检测，并对其主要促炎症细胞因子(IL-1β和COX2)的表达水平进行分析。每次至少对3只小鼠进行检测，结果取平均值。方法同实施例1的步骤三。
二、M.bovis组的处理方式
1、取分娩5天后的泌乳期CD-1小鼠，腹腔注射等体积无菌生理盐水。
2、完成腹腔注射12小时后接种感染液。接种方式为通过小鼠乳导管接种。接种部位为小鼠的第四对乳腺。感染液是用无菌磷酸盐缓冲溶液悬浮牛支原体NMH7株得到的，牛支原体浓度为1×106CFU/ml。接种量为每个乳腺100μl感染液。
3、接种感染液72小时，解剖小鼠，取第四对乳腺组织，进行病理学检测，并对其主要促炎症细胞因子(IL-1β和COX2)的表达水平进行分析。每次至少对3只小鼠进行检测，结果取平均值。方法同实施例1的步骤三。
三、control组的处理方式
1、取分娩5天后的泌乳期CD-1小鼠，腹腔注射等体积无菌生理盐水。
2、完成腹腔注射12小时后接种无菌磷酸盐缓冲溶液。接种方式为通过小鼠乳导管接种。接种部位为小鼠的第四对乳腺。接种量为每个乳腺100μl无菌磷酸盐缓冲溶液。
3、接种无菌磷酸盐缓冲溶液72小时，解剖小鼠，取第四对乳腺组织，进行病理学检测，并对其主要促炎症细胞因子(IL-1β和COX2)的表达水平进行分析。每次至少对3只小鼠进行检测，结果取平均值。方法同实施例1的步骤三。
四、结果分析
各组小鼠HE染色的结果见图4A。
各组小鼠随机视野内乳腺腺泡平均直径的结果见图4B。图4B中，纵坐标为乳腺腺泡直径(μm)。
各组小鼠的IL-1β结果见图4C。图4C中，纵坐标为上清中的IL-1β含量(pg/ml)。
各组小鼠的COX2结果见图4D。图4D中，纵坐标为上清中的COX2含量(pg/ml)。
与M.bovis组对比，M.bovis组+NAC组小鼠的乳腺炎性细胞浸润得到显著缓解，乳腺腺泡紊乱状态得到明显改善。M.bovis组+NAC组小鼠的腺泡平均直径大于M.bovis组。M.bovis组+NAC组小鼠的乳腺组织中IL-1β和COX2表达水平均显著低于M.bovis组。结果表明，NAC能有效缓解由牛支原体感染CD-1小鼠的乳腺炎性损伤。
本实施例中，采用本发明的方法建立小鼠模型，以NAC为示例，验证模型在药物筛选中的应用。N-acetyl-L-cysteine是一种细胞内活性氧清除剂，在抗氧化损伤和抗炎性损伤方面具有很高的研究价值。但是，NAC作为一种抗氧化剂能否对牛支原体感染引起的炎症起到限制或缓解作用，这一点还没有被证实。同时，牛支原体性奶牛乳房炎的抗炎治疗方案还远远不能满足临床需求，因此，在本实施例中，NAC被选择作为牛支原体奶牛乳房炎抗炎性损伤的治疗药物，用于对牛支原体小鼠乳腺炎模型的应用评价，结果表明，NAC能有效缓解小鼠乳腺的炎性浸润和乳腺腺泡萎缩，起到明显的抗炎抗损伤作用。本实施例为牛支原体奶牛乳房炎的抗氧化治疗方案提供了良好的数据依据，为进一步应用抗氧化剂治疗牛支原体奶牛乳房炎奠定了良好的基础，同时，该实施例证明，本发明构建的牛支原体小鼠乳腺炎模型能够有效地评价抗炎药物，可以作为奶牛乳腺的替代模型，具有较高的实际应用价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种小鼠乳腺炎模型的构建方法，包括如下步骤：将感染液接种至泌乳期小鼠的乳腺；所述感染液是用无菌缓冲溶液悬浮牛支原体NMH7株得到的。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：接种量为每个乳腺接种感染液100μl以上。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述感染液中，牛支原体NMH7株的浓度为1×106CFU/ml以上。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：接种方式为通过小鼠乳导管接种。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：泌乳期小鼠为分娩4-7天后的小鼠。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：小鼠的乳腺为小鼠的第四对乳腺。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：接种后，通过接种感染液的乳腺的病原载量和/或病理损伤程度和/或炎症反应指标进行评价，确认模型构建成功。
8.牛支原体NMH7株或感染液在制备小鼠乳腺炎模型中的应用；
所述感染液是用无菌缓冲溶液悬浮牛支原体NMH7株得到的。
9.权利要求1至7中任一所述方法构建的模型在药物筛选和/或药效评估中的应用。
10.N-acetyl-L-cysteine在制备牛支原体奶牛乳房炎药物中的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114667969A (zh) * 2022-03-29 2022-06-28 吉林大学 一种小鼠乳腺纤维化模型的构建方法及其应用
CN114686600A (zh) * 2022-02-24 2022-07-01 宁波大学 基于七重pcr技术的肉类检测用引物组和方法
CN116058324A (zh) * 2021-11-03 2023-05-05 湖南农业大学 Lps诱导乳腺纤维化的小鼠模型及其构建方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2622501A (en) * 1999-11-08 2001-06-06 Biomune Vaccines for mycoplasma bovis and methods of use
US20030149999A1 (en) * 2000-07-31 2003-08-07 Shizuo Akira Nonhuman animal model non-responsive to mycoplasma-origin lipoprotein/lipopeptide
CN105492005A (zh) * 2013-02-08 2016-04-13 罗达制药有限公司 治疗包括乳房炎的微生物感染的方法
WO2019094700A1 (en) * 2017-11-10 2019-05-16 Cocoon Biotech Inc. Silk-based products and methods of use
CN111264461A (zh) * 2020-03-18 2020-06-12 中国农业大学 小鼠乳房炎模型的构建方法及应用
CN111387133A (zh) * 2020-02-25 2020-07-10 中国农业大学 一种肺炎克雷伯杆菌噬菌体抑制小鼠乳腺炎模型建立方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2622501A (en) * 1999-11-08 2001-06-06 Biomune Vaccines for mycoplasma bovis and methods of use
US20030149999A1 (en) * 2000-07-31 2003-08-07 Shizuo Akira Nonhuman animal model non-responsive to mycoplasma-origin lipoprotein/lipopeptide
CN105492005A (zh) * 2013-02-08 2016-04-13 罗达制药有限公司 治疗包括乳房炎的微生物感染的方法
WO2019094700A1 (en) * 2017-11-10 2019-05-16 Cocoon Biotech Inc. Silk-based products and methods of use
CN111387133A (zh) * 2020-02-25 2020-07-10 中国农业大学 一种肺炎克雷伯杆菌噬菌体抑制小鼠乳腺炎模型建立方法
CN111264461A (zh) * 2020-03-18 2020-06-12 中国农业大学 小鼠乳房炎模型的构建方法及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J.C.ANDERSON等: "Experimental Mycoplasma Mastitis in Mice", 《INFECTION AND IMMUNITY》 *
YANG LIU等: "Molecular characteristics and antibiotic susceptibility profiles of Mycoplasma bovis associated with mastitis on dairy farms in China", 《PREVENTIVE VETERINARY MEDICINE》 *
YANG LIU等: "Mycoplasma bovis-generated reactive oxygen species and induced apoptosis in bovine mammary epithelial cell cultures", 《JOURNAL OF DAIRY SCIENCE》 *
范媛等: "6株牛支原体分离株对鸡胚和小鼠的致病性研究", 《中国预防兽医学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116058324A (zh) * 2021-11-03 2023-05-05 湖南农业大学 Lps诱导乳腺纤维化的小鼠模型及其构建方法
CN114686600A (zh) * 2022-02-24 2022-07-01 宁波大学 基于七重pcr技术的肉类检测用引物组和方法
CN114686600B (zh) * 2022-02-24 2023-12-12 宁波大学 基于七重pcr技术的肉类检测用引物组和方法
CN114667969A (zh) * 2022-03-29 2022-06-28 吉林大学 一种小鼠乳腺纤维化模型的构建方法及其应用
CN114667969B (zh) * 2022-03-29 2023-10-10 吉林大学 一种小鼠乳腺纤维化模型的构建方法及其应用

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