CN112795544B - 一株跨属烈性噬菌体、制备工艺及其在防治猪副伤寒和鸡白痢的应用 - Google Patents

一株跨属烈性噬菌体、制备工艺及其在防治猪副伤寒和鸡白痢的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株跨属烈性噬菌体，所述噬菌体，保藏编号为CCTCC NO：M 2020838；本发明首次分离出一株跨属感染鸡白痢沙门菌和猪霍乱沙门菌噬菌体，与单一裂解性沙门氏菌噬菌体相比，大大拓宽了其杀菌范围，对猪霍乱沙门菌强毒株C78‑2、弱毒疫苗株C500、鸡白痢沙门菌C79‑13、S06004、RKS5078、CDC1983‑67、均具有良好的裂解能力。本发明所述噬菌体具有杀菌速度快、产量高的特点。同时，还可与随水饮用，消除动物胃肠道沙门氏菌，用于防治猪副伤寒和鸡白痢，其使用方便。

Description

一株跨属烈性噬菌体、制备工艺及其在防治猪副伤寒和鸡白 痢的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株跨属烈性噬菌体的制备及其与枯草芽孢杆菌联合在防治猪副伤寒和鸡白痢的应用。
背景技术
沙门氏菌（salmonella）是公共卫生学上有重要意义的人畜共患病原菌之一。由沙门氏菌引起的食物中毒常居首位。不同的血清型的沙门氏菌可引起鸡白痢、鸡伤寒、猪副伤寒及动物流产等多种疾病，部分血清型沙门氏菌亦可以带菌状态寄生于动物体内，严重影响养殖业健康发展。目前，抗生素仍被认为是治疗沙门氏菌感染的主要方法，然而，随着兽用抗生素的长期使用和滥用，耐药性沙门氏菌除了使得动物疾病防治越来越棘手外，也通过食物链严重威胁人类生命健康安全。中国疾病控制中心报告的食物中毒数据显示沙门氏菌引起的发病人数比例居首，达13.8%。因此基于养殖效益、食品安全和公共卫生方面的考虑，寻找一种新的治疗沙门氏菌病疗效确实、无残留、符合国家减抗或无抗养殖发展方向的抗菌制剂乃当务之急。
噬菌体作为细菌的天敌，可以裂解宿主菌，专一性强，高效，快速杀菌，不会感染畜禽机体，也不会产生耐药性。噬菌体主要感染细菌，对动物机体和人体安全，不污染环境。2006年，美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准李斯特菌噬菌体制剂在即食食品（ready-to-eat）和禽类产品中使用，随后，沙门氏菌噬菌体产品如Intralytix公司的Salmon Fresh也相继通过美国FDA评价食品添加剂的安全性指标认证（Generally Recognized as Safe，GRAS），获得FDA应用批准，这为噬菌体的商业化应用奠定了基础。
但噬菌体研究中存在许多问题，阻碍其发展。（1）噬菌体具有高度的特异性，所以治疗性噬菌体往往只对单一菌株或亚型的细菌有效，而对其他菌株裂解效果很弱或无治疗作用，使其应用的范围受到很大的限制。且由于细菌对噬菌体存在抗性现象，因此要不断对抗多种病原体的噬菌体混合制剂进行调整以适应不断出现的新型菌种。（2）噬菌体的制备要求高，不仅要去除生产宿主菌的细菌内毒素，降低免疫原性，而且需要加入合适的稳定剂，保证噬菌体的活性。因此，扩大噬菌体的裂解谱、降低制备成本是今后的研究重点。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种跨属感染鸡白痢沙门菌和猪霍乱沙门菌烈性噬菌体，实现以下发明目的：
裂解谱广，稳定性能好，对鸡白痢、猪霍乱的治疗效果好。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一株跨属烈性噬菌体，所述噬菌体，保藏编号为CCTCC NO： M 2020838。
以下是对上述技术方案的进一步改进：
所述噬菌体对猪霍乱沙门菌强毒株C78-2、弱毒疫苗株C500、鸡白痢沙门菌C79-13、S06004、RKS5078、CDC1983-67、均具有良好的裂解能力。
以猪霍乱沙门菌弱毒疫苗株为宿主菌进行噬菌体的发酵，然后采取高压匀浆工艺进行噬菌体的提取。
所述宿主菌为猪霍乱沙门菌弱毒疫苗株C500。
所述高压匀浆，匀浆压力为53-57 MPa。
制备的噬菌体产品，效价≧1*1010pfu/mL；优选为1.40～1.45*1010pfu/mL；
所述噬菌体的制备工艺，包括发酵工艺、提取工艺；
所述发酵工艺，包括以下步骤：
（1）宿主种子制备：取猪霍乱沙门菌毒弱毒疫苗株C500冻干粉培养分离得到的单菌接种于90-110ml液体培养基中，培养7-9h，得到第一次宿主种子活化液。取第一次宿主种子活化液以2.5-3.5%（体积比）的接种量接种于培养基，培养至OD600=0.6～0.8，得到第二次宿主种子活化液。
（2）噬菌体种子制备：取噬菌体XPAR_CPS01的保存原液以0.8-1.2%（体积比）的比例、第二次的活化液以9-11%（体积比）分别接种于LB培养基，培养1.8-2.2h，将培养好的培养物以9-11%（体积比）的接种量接种于LB液体培养基，培养1.8-2.2h，培养好的噬菌体种子，置于4℃冰箱备用；
（3）种子罐工艺：
火焰保护以0.9-1.1%（体积比）接种第二次宿主种子活化液，初始PH在7.0左右。接种后将溶氧调至100%，通风量1:1起，培养过程溶氧降到30%以下适当增加风量，转速450-500rpm，培养至OD600在0.68-0.72，溶氧PH回升时（溶氧100%和pH为7.0）转种。
（4）发酵罐工艺：按9-11%（体积比）接种量转种，接种后将溶氧调至100%，通风量1:1起，培养过程如溶氧降到30%以下适当增加风量，培养6-8h，OD在0.6-0.8，再以0.8-1.2%（体积比）的接种量（步骤2培养好的噬菌体种子液）接入噬菌体，培养6-8h，溶氧PH回升时放罐。
所述噬菌体用于防治猪副伤寒和鸡白痢。
所述噬菌体与枯草芽孢杆菌联合用于防治猪副伤寒和鸡白痢。
所述噬菌体与枯草芽孢杆菌的比例为1mL：1g；所述噬菌体，效价为≧1*1010pfu/mL；优选为1.40～1.45*1010pfu/mL；
所述枯草芽孢杆菌，活性菌数≧1000亿cfu/g。
所述枯草芽孢杆菌，菌种保藏编号为CICC NO：10071。
本发明所述跨属烈性噬菌体XPAR_CPS01，分类命名为：沙门氏菌噬菌体Salmonella phage， 保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2020年12月4日，保藏编号为CCTCC NO： M 2020838，该噬菌体为长尾噬菌体，噬菌斑清晰透亮，空斑直径不低于1mm，于对猪霍乱沙门菌强毒株C78-2、弱毒疫苗株C500、鸡白痢沙门菌C79-13、S06004、RKS5078、CDC1983-67、均具有良好的裂解能力。以弱毒疫苗株C500为宿主菌进行发酵，产量高，效价不低1×1010pfu/mL。该噬菌体与枯草芽孢杆菌的复配作为有效预防及治疗猪副伤寒和鸡白痢。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
（1）本发明首次分离出一株跨属感染鸡白痢沙门菌和猪霍乱沙门菌噬菌体，与单一裂解性沙门氏菌噬菌体相比，大大拓宽了其杀菌范围，对猪霍乱沙门菌强毒株C78-2、弱毒疫苗株C500、鸡白痢沙门菌C79-13、S06004、RKS5078、CDC1983-67、均具有良好的裂解能力，噬菌斑直径为0.05～5.0 mm。
（2）本发明所述噬菌体具有杀菌速度快、产量高的特点。在发酵时，采用我国转基因微生物安全评价弱毒疫苗株C500为发酵菌种，避免了强毒株对环境和人类健康的危害，其生产过程安全。在发酵结束后，菌体经高压匀浆进行破碎，释放出更多噬菌体，发酵液离心收集上清，上清中噬菌体可于室温下稳定存活6个月以上，无需加入稳定剂，其生产成本低。同时，还可与随水饮用，消除动物胃肠道沙门氏菌，用于防治猪副伤寒和鸡白痢，其使用方便。
本发明所述噬菌体随水饮用在治疗后第二天50%患有白痢的鸡开始好转，对鸡白痢治愈率达86.67%
本发明所述噬菌体随水饮用在治疗后第四天50%患有副伤寒的猪开始好转，第六天63.33%基本恢复食欲，对猪副伤寒治愈率达83.33%。
（3）该噬菌体与枯草芽孢杆菌（CICC NO：10071）复配，可进一步改善动物胃肠道微生物区系，增强治疗效果，降低动物死亡率，提高经济效益。
噬菌体与枯草芽孢杆菌联用在治疗后第三天50%猪开始好转，第六天90.00%基本恢复食欲，对猪副伤寒治愈率达93.33%；
噬菌体与枯草芽孢杆菌联用在治疗后第二天70%鸡开始好转，对鸡白痢治愈率达96.67%。
附图说明
附图1噬菌体XPAR_CPS01的纯化后噬菌斑图。以猪霍乱沙门菌强毒株C78-2为宿主，纯化后可以观察到大小、形态保持均匀一致的噬菌斑。
附图2噬菌体XPAR_CPS01电镜观察图。电镜下噬菌体XPAR_CPS01呈正多面体头部（长径约65nm，横径约60nm）和无收缩性尾巴（长约120nm，直径约10nm）。根据《病毒分类-国际病毒分类委员会第9次报告》中有关噬菌体的分类，XPAR_CPS01属于长尾噬菌。
附图3噬菌体XPAR_CPS01宿主谱，不同宿主对应噬菌斑的大小。对猪霍乱沙门菌弱毒疫苗株C500、鸡白痢沙门菌C79-13、S06004、RKS5078、CDC1983-67、均具有良好的裂解能力，噬菌斑直径为0.05～5.0 mm。
附图4噬菌体XPAR_CPS01最佳感染复数的测定图。MOI为10：1时，宿主菌释放的子代噬菌体效价最高。
附图5噬菌体XPAR_CPS01酸碱稳定性的测定图。在PH值4～12范围时，效价较稳。
附图6噬菌体XPAR_CPS01热稳定性的测定图。在温度30～60℃条件下能够基本维持初始效价，70℃时效价下降较快。
附图7噬菌体XPAR_CPS01一步生长曲线。其潜伏期约为10 min，裂解期约为100min裂解量为112。
附图8噬菌体XPAR_CPS01产品稳定性的测定图。噬菌体XPAR_CPS01稳定性好，存放6个月后生物制剂效价仍未下降。
具体实施方式
实施例1 一株跨属感染鸡白痢沙门菌和猪霍乱沙门菌烈性噬菌体XPAR_CPS01的分离
样品处理：从自山东烟台市某猪场采集感染猪副伤寒病猪粪便，于37 ℃恒温箱用无菌水浸泡过夜，用纱布过滤掉多余杂质，0.22μM过滤除菌后待用，得到处理的样品。
宿主菌制备：挑取猪霍乱沙门菌强毒株C78-2单菌落接种于100mL LB肉汤中，180r/min、37℃振荡培养16-18 h，得到宿主菌的菌悬液，备用。
噬菌体的增殖：取上述处理的样品10mL加入至上述盛有宿主菌液的三角瓶中，混匀后，37 ℃空气浴振荡器中160rpm振荡培养过夜，得到噬菌体增殖液。
噬菌体分离：上述混合培养液（噬菌体增殖液）静置15min后，取15mL 4 ℃10000rpm离心5min，取上清液用无菌针头式滤器过滤除菌，滤液装于无菌EP管中，进行4次的10倍梯度稀释，制成稀释液，用于噬菌体分离。
采用双层平板法进行噬菌体分离，各取100μL宿主菌的菌悬液于无菌EP管中，再取200μL上述滤液的稀释液，混匀后，40℃水浴作用5min或37 ℃温箱中保存15min，再将混合液加入至已融化好的8mL上层琼脂中（将含有0.7%琼脂LB肉汤培养基融化后放置于45-50℃水浴锅内保温），用手快速搓动试管使之混匀，然后迅速倒入已准备好的底层为NA培养基平板上，倾斜旋转平皿使其分布均匀，待琼脂凝固后，37 ℃恒温培养6-8h后，观察结果。如果滤液内有噬菌体存在，则可在上层琼脂平板上形成蚕蚀的透明空斑，与黄白色的雾状菌苔形成鲜明的对比。
噬菌体纯化：用无菌牙签取一个形态大小较为均一的噬菌斑，接种到含有100μL宿主菌的菌悬液，900μL LB肉汤培养基的1.5mL EP中，37℃震荡培养6-8h。混合培养液经0.22μm微孔滤膜过滤后即得到噬菌体滤液，滤液经过10次的10倍梯度稀释，取200μL的不同梯度噬菌体滤液、分别与100μL宿主菌的菌悬液混匀，40℃水浴作用5min或37 ℃温箱中保存15min，再与7mL溶解并冷却至50℃的含有0.7%琼脂LB肉汤基混匀，立即倒入预先制备好的底层为NA培养基平板中，同时用含有0.7%琼脂LB肉汤培养基作为空白对照，待冷却凝固后，倒置于37℃恒温培养箱中培养16-24h。重复此步骤3~5次，每次观察到的噬菌斑大小、形态保持均匀一致，方可得到纯化的噬菌体，命名XPAR_CPS01。
噬菌体的保藏：将上述纯化步骤最后得到的噬菌斑大小、形态保持均匀一致的噬菌斑，挑取一个，接种到含有100μL宿主菌的菌悬液，900μL LB肉汤培养基的1.5mL EP中，37℃震荡培养6-8h。混合培养液经0.22 μm微孔滤膜过滤后即得到噬菌体滤液，取纯化好的噬菌体滤液500μL，2×SM缓冲液500μL，加入到1.5mL EP管中混匀，-20℃保存，即为噬菌体XPAR_CPS01原液。
噬菌体XPAR_CPS01呈现出典型的裂解性噬菌体特征，空斑透亮，边缘整齐清晰，无晕环，噬菌斑直径为3.63 mm，见图1。将所得的噬菌体进行投射电子显微镜扫描，结果表明电镜下噬菌体XPAR_CPS01呈正多面体头部（长径约65nm，横径约60nm）和无收缩性尾巴（长约120nm，直径约10nm）。根据《病毒分类-国际病毒分类委员会第9次报告》中有关噬菌体的分类，XPAR_CPS01属于长尾噬菌，见图2。
实施例2 噬菌体XPAR_CPS01裂解谱的确定
5mL的LB半固体培养基分别与猪霍乱沙门菌强毒株C78-2、弱毒疫苗株C500、鸡白痢沙门菌C79-13、S06004、RKS5078、CDC1983-67对数期的宿主菌（100µl，OD=1.0）混匀，倾倒于固体LB平板内形成双层平板，静置后取200μL上述纯化好的噬菌体涂布在平板上，待其晾干后37℃下倒置培养过夜，观察是否有裂解斑。结果表明其中在猪霍乱沙门菌弱毒疫苗株C500（噬菌斑直径为0.43 mm）、鸡白痢沙门菌C79-13（噬菌斑直径为0.50 mm）、S06004（噬菌斑直径为0.05 mm）、RKS5078（噬菌斑直径为0.16 mm）、CDC1983-67（噬菌斑直径为0.12 mm）平板上的噬菌斑均极其透亮，表明XPAR_CPS01对上述菌株具有极强的裂解作用，噬菌斑直径为0.05～5.0 mm，见图3。
上述猪霍乱沙门菌弱毒疫苗株C500购于中国兽医药品监察所；猪霍乱沙门菌强毒株C78-2、鸡白痢沙门菌C79-13、S06004、RKS5078、CDC1983-67由青岛农业大动物科技学院预防兽医学山东省重点实验室提供。
实施例3 噬菌体XPAR_CPS01效价的确定
以猪霍乱沙门菌毒疫苗株C500为宿主菌，取保存的1mL噬菌体XPAR_CPS01原液经过2~13次的10倍梯度稀释，做成不同梯度的稀释液备用。
取灭菌的10mL NA培养基倒入空培养皿中，凝固后制成NA琼脂平板。在15mL西林瓶中加入0.1mL不同梯度的稀释液、1mL宿主菌，再与5mL溶解并冷却至60℃的NA培养基混匀，立即倒入预先制备好的NA平板中，同时用NA培养基作为空白对照，设置三个平行，待冷却凝固后，倒置于37℃恒温培养箱中培养16-24h，读取噬菌体效价，确定噬菌体个数。噬菌体效价（pfu/mL）=噬菌斑数×稀释倍数×10。噬菌体XPAR_CPS01原液的效价为1.05×1010pfu/mL。
实施例4 噬菌体XPAR_CPS01最佳感染复数的确定
取对数期猪霍乱沙门菌毒疫苗株C500为宿主菌，按不同感染复数100:1、10:1、1:1、1:10、1:100、1:1000、在EP管中加入噬菌体XPAR_CPS01和宿主菌，37℃、180 r/min振荡培养4h，12000r/min离心10min，收集上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，测定噬菌体效价。结果表明MOI为10：1时，宿主菌释放的子代噬菌体效价最高，见图4。
实施例5 噬菌体XPAR_CPS01酸碱稳定性和热稳定性的确定
利用一定浓度的盐酸和氢氧化钠溶液调节pH，配制成pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0及13.0的溶液，0.22μm微孔滤膜过滤备用。取不同pH值溶液与噬菌体等量混合，37 ℃水浴2 h测定效价；结果表明在PH值4～12范围时，效价较稳，见图5。
取100 μL噬菌体于离心管中，将离心管分别于30、40、50、60、70、80 ℃的水浴环境中作用60 min，作用结束后立即冰浴冷却，稀释适当倍数进行噬菌体效价测定。XPAR_CPS01在温度30～60℃条件下能够基本维持初始效价，70℃时效价下降较快，见图6。
实施例6 噬菌体XPAR_CPS01一步生长曲线的确定
取对数期猪霍乱沙门菌毒疫苗株C500为宿主菌，加入噬菌体及宿主菌使MOI为10：1，混合后37°C 孵育15 min，然后12 000 r/min 离心30 s，弃上清，用LB肉汤培养基洗涤沉淀菌体2 次，然后加入5 mL的37 °C预热LB肉汤培养基悬浮沉淀并充分混匀，迅速置于37°C振荡培养，同时开始计时，在0时刻和每隔10 min 取样一次，12 000 r/min离心30 s，取上清测定噬菌体每一时间段的效价。以感染时间为横坐标，噬菌体的效价为纵坐标，绘制一步生长曲线。结果表明，噬菌体XPAR_CPS01感染宿主菌后的10 min内效价没有明显变化，表明其潜伏期约为10 min，从10 min后效价开始上升，一直持续到第110 min，之后效价趋于稳定，说明噬菌体裂解期约为100 min。根据裂解量=裂解末期噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度计算得到，噬菌体XPAR_CPS01的裂解量为1.29×1010/1.15×108=112，见图7。
实施例7 噬菌体XPAR_CPS01制备工艺
噬菌体XPAR_CPS01的发酵工艺：
（1）宿主种子制备：取猪霍乱沙门菌毒弱毒疫苗株C500冻干粉1支，溶于5mL LB肉汤培养基无菌培养基中，取菌液在LB固体培养基上划线，全程无菌操作；划线后的培养基置于37℃恒温培养箱中过夜培养；次日无菌环境下挑取单菌落接种于100mL的LB肉汤培养基，37℃，200rpm培养8h，为第一次宿主种子活化液。取第一次宿主种子活化液以3%的接种量接种于1000mL的LB肉汤培养基，同时接种6瓶，37℃，200rpm培养6h，OD600=0.6～0.8，第二次宿主种子活化液。镜检无染菌后，作为种子备用。
（2）噬菌体种子制备：取1mL噬菌体XPAR_CPS01的保存原液以1%的比例、第二次的活化液以10%分别接种于100mL的LB培养基，同时接种5瓶，37℃，200rpm培养2h，将培养好的培养物以10%的接种量接种于1000mL的LB液体培养基，同时接种5瓶，37℃，200rpm培养2h，培养好的噬菌体种子，置于4℃冰箱备用；
上述1% 10%均是体积比。
（3）种子罐工艺：将1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸粉、1%氯化钠溶解后倒入罐中，定容到30L体积，加入0.05%消泡剂（最好用泡敌，现用常州振统聚醚消泡剂），121℃ 灭菌30 min，降温备用。
然后火焰保护以1%接种第二次宿主种子活化液，初始PH应在7.0左右。接种后将溶氧调至100%，通风量1:1起，培养过程溶氧降到30%以下适当增加风量，转速450-500rpm，温度37℃，自然PH。培养6h后，OD600在0.7左右，溶氧PH回升时（溶氧100%和pH为7.0）转种。
（4）发酵罐工艺：将1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸粉、1%氯化钠溶解后倒入罐中（LB培养基），定容300L，加入0.05%消泡剂，121℃ 灭菌30 min，然后按10%接种量转种。接种后将溶氧调至100%，通风量1:1起，培养过程如溶氧降到30%以下适当增加风量，转速200rpm，温度37℃，自然PH，培养6-8h，OD在0.6-0.8，再以1%的接种量（步骤2培养好的噬菌体种子液）接入噬菌体，培养6-8h，溶氧PH回升时放罐。
上述接种量均是体积比。
噬菌体XPAR_CPS01的提取工艺：
（1）高压匀浆：利用压缩空气将发酵罐压力调节至0.05MPa左右，储料罐压力为零，利用发酵罐与储料罐之间的压力差通过不锈钢物料管道将发酵液压到储料罐中，采用匀浆机（ATS工业系统有限公司生产的AH-PILOT）进行匀浆破菌，匀浆压力分别设定为55MPa，处理量40L/h，进行高压条件下的匀浆破碎。高压匀浆对发酵液效价的影响，见表1。
表1
Figure 901374DEST_PATH_IMAGE001
（2）离心：匀浆液通过串联的两个连续离心机（辽阳隆达制药机械有限公司生产的GQ-105型管式离心机）离心，离心机的转速为12000rpm，离心机的处理量为1 m3/h，弃去沉淀，离心后的上清液通过离心机出液管接到中间储罐中进入膜分离处理程序，转鼓中的固体杂质刮下后经灭菌等处理后弃掉。
（3）膜分离：上清液通过5万分子量陶瓷膜进行过滤，过滤温度：40℃，操作压力：进口压力为0.2MPa；出口压力0.1MPa，进出口压降为0.1MPa，上清液以0.5m3/h的流速沿着陶瓷膜的表面流过。
（4）噬菌体产品制得：收集膜分离后的清液，将上清液经0.22μm滤器过滤，得到的滤液即为噬菌体XPAR_CPS01产品。连续3批噬菌体XPAR_CPS01产品的效价，见表2。
表2
Figure 927099DEST_PATH_IMAGE002
实施例8噬菌体XPAR_CPS01产品稳定性的测定
将噬菌体XPAR_CPS01产品放置在温室中，每个月定期采样进行其效价，结果表明噬菌体XPAR_CPS01稳定性好，存放6个月后生物制剂效价仍未下降，见图8。
实施例9 噬菌体XPAR_CPS01与枯草芽孢杆菌联合对猪副伤寒的防治效果
取30头15kg的健康断奶仔猪进行人工感染猪霍乱沙门菌C78-2，口服猪霍乱沙门氏菌剂量为1.0×1011 CFU，出现下痢时，随机分为3组，每组10头。其中，对照组不作治疗；噬菌体治疗组用噬菌体饮水治疗，以1mL（噬菌体XPAR_CPS01产品，效价为1.30～1.40*1010pfu/mL）加水1000mL比例，连续饮水治疗7天；
噬菌体与枯草芽孢杆菌联合治疗组用噬菌体与枯草芽孢杆菌混饲治疗，将1mL噬菌体（噬菌体XPAR_CPS01产品，效价为1.30～1.40*1010pfu/mL）和1g枯草芽孢杆菌（活菌数为1000亿cfu/g）加入到1000mL水中，连续饮水治疗7天；
枯草芽孢杆菌的保藏号为CICC NO：10071，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心
所有猪在同一条件下饲养；温度26-29℃，湿度58-62%；每日向各个猪舍提供等量的足量饲料和饮用水；每天记录各组猪下痢和饮食情况。试验重复三次。
结果表明，对照组所有猪均持续下痢现象，无食欲，在耳根、胸口以及腹部下方的皮肤不断存在淤青、紫斑等，病程进展较快，7天猪死亡率高达80%。噬菌体治疗组在治疗后第四天50%（15/30）猪开始好转，第六天63.33%（19/30）基本恢复食欲，对猪副伤寒治愈率达83.33%（25/30）；联合组在治疗后第三天50%（15/30）猪开始好转，第六天90.00%（27/30）基本恢复食欲，对猪副伤寒治愈率达93.33%（28/30），见表3。
表3
Figure 912242DEST_PATH_IMAGE003
实施例10 噬菌体XPAR_CPS01与枯草芽孢杆菌联合对鸡白痢的防治效果
选择25日龄、健康的不带病原体的鸡进行人工感染鸡白痢沙门菌C79-13，采用腹腔注射的方式，每只鸡注射的鸡白痢沙门氏菌剂量为2.0×1010 CFU，出现拉白色浆糊样稀粪为特征症时，随机分为3组，每组30只。其中，对照组不作治疗；噬菌体治疗组用噬菌体饮水治疗，以1mL加水1000mL比例，连续饮水治疗7天；噬菌体与枯草芽孢杆菌联合治疗组用噬菌体与枯草芽孢杆菌混饲治疗，噬菌体以1mL加水1000mL比例添加，枯草芽孢杆菌以1g加水1000mL添加，连续饮水治疗7天；
所述噬菌体为噬菌体XPAR_CPS01产品，效价为1.30～1.40*1010pfu/mL；
所述枯草芽孢杆菌，活性菌数为1000亿cfu/g；
枯草芽孢杆菌的保藏号为CICC NO：10071，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心
两组鸡在同一条件下饲养；鸡舍温度28-31℃，鸡舍湿度58-62%；每日向各个鸡舍提供等量的足量饲料和饮用水；每天记录各组鸡腹泻和饮食情况。试验重复三次。
结果表明，对照组所有鸡出现白痢的典型症状并死亡。噬菌体治疗组在治疗后第二天50%（45/90）鸡开始好转，对鸡白痢治愈率达86.67%（78/90）；联合组在治疗后第二天70%鸡开始好转，对鸡白痢治愈率达96.67%（87/90），见表4。
表4
Figure 783246DEST_PATH_IMAGE004
。

Claims (6)

1.一株跨属烈性噬菌体在制备防治猪副伤寒和鸡白痢的药物中的应用，其特征在于：所述噬菌体，保藏编号为CCTCC NO： M 2020838；所述噬菌体对猪霍乱沙门菌强毒株C78-2、弱毒疫苗株C500、鸡白痢沙门菌C79-13、S06004、RKS5078、CDC1983-67均具有良好的裂解能力。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述噬菌体的制备方法为以猪霍乱沙门菌弱毒疫苗株为宿主菌进行噬菌体的发酵，然后采取高压匀浆工艺进行噬菌体的提取。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述宿主菌为猪霍乱沙门菌弱毒疫苗株C500。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述高压匀浆，匀浆压力为53-57 MPa。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：制备的噬菌体产品，效价≧1*1010pfu/mL。
6.一株跨属烈性噬菌体在制备防治猪副伤寒和鸡白痢的药物中的应用，其特征在于：所述噬菌体与枯草芽孢杆菌联合用于制备防治猪副伤寒和鸡白痢的药物；
所述噬菌体，保藏编号为CCTCC NO： M 2020838；
所述枯草芽孢杆菌，菌种保藏编号为CICC NO：10071；
所述噬菌体与枯草芽孢杆菌的比例为1mL：1g；所述噬菌体，效价为≧1*1010pfu/mL；
所述枯草芽孢杆菌，活性菌数≧1000亿cfu/g。
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