CN115717126A - 一种鸭耐药性大肠杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭耐药性大肠杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用，所述鸭耐药性大肠杆菌噬菌体被命名为PD328，于2021年4月12日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，保藏编号为CGMCCNo.22364。该噬菌体PD328属于肌尾噬菌体，其对鸭源耐药性以及多重耐药大肠杆菌表现出强裂解性、宽裂解谱的特点，具有高效裂解耐药大肠杆菌以及降低鸭群死亡率的作用，可被用于制备防治鸭耐药性大肠杆菌感染的疾病的药物、环境消毒剂、饲料添加剂、食品保鲜剂等，在解决鸭耐药性大肠杆菌感染的同时避免抗生素残留和加剧病原菌耐药性的问题。

Description

一种鸭耐药性大肠杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种鸭耐药性大肠杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用。

背景技术

山东是全国水禽产业的第一大省，2018年山东全省肉鸭出栏12亿多只，占全国的40％以上，居全国第一位。山东区肉鸭养殖业发展迅速，养殖模式也不断优化，虽然标准化立体养殖模式、发酵床养殖模式等在一定程度上提高了养殖效率，减少疾病的发生，但是由于目前肉鸭行业面临无序发展、管理落后等问题，依旧存在严重的环境污染、细菌病多发、出现大量耐药细菌的现象。

鸭大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的局部或全身性感染的细菌性疾病，其主要发病特征为心包炎、肝周炎和急性败血症等。由于大肠杆菌的血清型复杂，给免疫防治带来一定的困难，因此，药物防治是目前控制该病的主要手段，但在由于临床治疗和实际养殖过程中滥用抗生素，导致耐药大肠杆菌的大量出现，不仅造成抗菌药物在兽医临床上的治疗失败，而且其耐药基因可通过食物链进人人体，使人体肠道菌产生相应的耐药性，对人类的健康安全构成威胁。近年来饲料端的减抗替抗政策，加剧了临床耐药细菌治疗的难度，因此，目前急需一种绿色高效无污染的新型生物制剂来有效防治由耐药大肠杆菌引发的各类疾病。

噬菌体是自然界中最丰富的生物之一，噬菌体对某些细菌菌株具有高度特异性，不会影响生物体或内源性组织的正常运转，所以噬菌体对人类或动植物没有感染性，也不会污染环境，安全性较高。而且噬菌体的溶菌作用不受细菌耐药性的限制，目前，在人类疾病治疗方面，针对超级细菌如耐甲氧西林的金葡菌、耐多药肺炎链球菌、万古霉素肠球菌和肺炎克雷伯菌等已经实施噬菌体治疗，且已经产生数项治疗成功案例。另外，噬菌体筛选周期短，制备工艺简单，成本低廉，能作为一种具有杀菌作用的生物消毒剂和抗生素替代品，且能够用于耐药细菌的防控治疗。

目前，虽然已经公开多株大肠杆菌噬菌体，但是并不是针对多重耐药大肠杆菌而筛选，如申请人在公开号为CN110129283B的专利里公开了一株鸡短尾大肠杆菌噬菌体PD38，对鸡大肠杆菌病能起到较好的防治效果，申请人在公开号为CN 111269893A的专利里公开了另一株鸡大肠杆菌噬菌体PD07，其与沙门氏菌噬菌体PYC04组成的噬菌体组合物可有效防治鸡输卵管炎。由此可见，目前针对多重耐药大肠杆菌进行有效防治的宽谱大肠杆菌噬菌体极少。

而公开号为CN110846283A的专利中公开了三株噬菌体CL1，CL6及CL7，这三株噬菌体对对不同来源地的猪源耐药性大肠杆菌的裂解率分别可达62.22％，64.44％和66.67％；其对牛源耐药性大肠杆菌的裂解率分别可达67.5％，70.00％和72.50％，对禽源耐药大肠杆菌的裂解率分别可达80.00％，76.00％和74.00％。该文中的耐药性大肠杆菌为常见的至少对一种抗生素具有耐药性的菌株，其并不是针对防治难度极大的多重耐药大肠杆菌而研发，且上述三株噬菌体的裂解谱较窄，应用时主要是通过组合物的方式进行应用。

因此，目前还没有发现对多重耐药性大肠杆菌具有优异的裂解性能的宽谱噬菌体，现有噬菌体类产品难以高效用于防治耐药性大肠杆菌(尤其是多重耐药菌)导致的疾病，因此，现有技术有待进一步改进。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种鸭耐药性大肠杆菌噬菌体PD328及其应用，噬菌体PD328可被用于制备治疗或预防耐药性大肠杆菌感染的疾病的药物、环境消毒剂、饲料和水添加剂、食品保鲜剂和检测试剂盒等，在解决鸭耐药性大肠杆菌感染的同时，避免了由于使用抗生素带来的抗生素残留和病原菌耐药性的问题。

本发明的技术方案具体如下：

第一方面，本发明提供了自山东某场的鸭毛污染物中分离得到的一株具有广谱强裂解性的鸭耐药性大肠杆菌噬菌体，该噬菌体被命名为PD328，于2021年4月12日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22364。

噬菌体PD328具有呈多面体的头部结构和可收缩性的尾部，头部宽87～93nm，长106～113nm，尾部长约127～133nm，根据病毒分类国际委员会(ICTV)的分类方法，本申请的噬菌体形态符合肌尾噬菌体科的特征，属于肌尾噬菌体。

本申请中，噬菌体PD328包括进行点突变或缺失突变或添加突变的同源性高于98％或99％且保持基本相同的杀菌活性的突变株。由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。噬菌体PD328的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状极度相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。

第二方面，本申请还提供一种噬菌体组合物，其包括鸭耐药性大肠杆菌噬菌体PD328和其他噬菌体。在实际应用中，为了进一步拓宽噬菌体制剂的裂解谱，充分发挥不同噬菌体的裂解谱的差异，进行优势互补，可将上述噬菌体PD328和其他噬菌体进行组合使用，如与同为大肠杆菌噬菌体的PD38(见CN110129283B)、PD07(见CN111269893A)等噬菌体中的一种或多种进行组合使用，扩大杀菌谱，尽可能杀灭环境中的所有大肠杆菌，用于大肠杆菌病的防治。优选地，本申请还提供一种噬菌体组合物，包括鸭耐药性大肠杆菌噬菌体PD328、大肠杆菌噬菌体PD38和大肠杆菌噬菌体PD07。从后续裂解实验可看出，这三株的裂解谱较为互补，能进一步扩大单株的裂解谱宽度。

此外，也可将上述噬菌体PD328与其他不同种类的噬菌体(抑制引发同类疾病的不同病原菌)配合，用于同一类疾病的防治，如不同病原菌混合感染的急性败血症。

第三方面，本申请还提供了上述耐药性大肠杆菌噬菌体PD328或上述噬菌体组合物在制备防治鸭耐药性大肠杆菌感染的药物、饲料添加剂、环境消毒剂、食品保鲜剂和检测试剂盒中的用途。所述防治包括预防和治疗。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述组合物来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述组合物而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。

优选地，所述鸭源耐药性大肠杆菌选自山东地区对六类抗菌药的阿莫西林、氟苯尼考、庆大霉素、林可霉素、四环素、头孢噻肟等抗生素具有严重的多重耐药的大肠杆菌临床分离株。这些耐药性病原菌是由于上述抗生素的过量使用产生，因此难以通过抗生素进行有效控制，而本申请的噬菌体PD328对其具有优异的裂解性能，且裂解谱宽，应用范围广。

第四方面，本申请还提供一种噬菌体药物制剂，其有效成分包括前述的大肠杆菌噬菌体PD328或前述的噬菌体组合物；优选的，所述噬菌体药物制剂还包括其他抑菌或杀菌活性成分；所述药物制剂形式为口服给药剂型、外用剂型或肠外给药剂型。

所述噬菌体药物制剂的应用方法为：将噬菌体或其组合物作为治疗药物添加到鸭饮用水或饲料中，或对鸭灌服、皮下注射、肌肉注射，通过上述方式可预防及治疗鸭耐药性大肠杆菌病，并降低心包炎、肝周炎和急性败血症等病的发病率，达到提高鸭的存活率。

可选地，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、各类的培养基等。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂和口服剂型(例如，水性溶液、悬浮液和乳液、丸剂、胶囊、粒剂)和其他中间剂型，如冻干剂。

第五方面，本申请还提供一种环境消毒剂，其有效成分包括如上所述的噬菌体PD328或前述噬菌体组合物；优选地，噬菌体的浓度为10⁷PFU/ml以上。

可选地，消毒剂还包含其他用于鸭场环境中细菌抑制或消灭的活性成分；优选的，可应用环境消毒剂的环境包括饲料、水和养殖环境，所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。

第六方面，本申请还提供上述环境消毒剂在养殖场环境消毒中的应用，具体地，应用方法为：将消毒剂在鸭屠宰场、鸭产品加工车间及器具、鸭养殖环境中使用，防止环境中病原菌的污染。所述养殖环境包括棚舍、料槽、地面、墙壁、粪便和垫料等。包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、养殖业设施、饲养器具或其他环境表面进行消毒去污，并对饲料进行消毒防腐，这种消毒剂可用于代替抗生素或传统消毒产品，而且其对人体及家禽不会造成损害。

第七方面，本申请还提供一种饮用水添加剂或者饲料添加剂，其有效成分包括上述的噬菌体PD328或噬菌体组合物；优选地，噬菌体的浓度为10⁸PFU/ml以上。通过将上述饮用水添加剂或者饲料添加剂加入水或与饲料混拌，对鸭群进行饲喂，从而对鸭场饮用水和饲料进行消毒杀菌，从源头上避免鸭大肠杆菌病的传播，有效进行大肠杆菌病的防治。

可选地，饮用水添加剂还包含其他用于水中细菌抑制或消灭的活性成分；所述饮用水添加剂的形式为液体剂型、粉末剂型或固体剂型，但不仅限于以上三种剂型。

第八方面，本申请还提供一种食品保鲜剂，其包括如上所述的噬菌体PD328或噬菌体组合物，将其喷洒于鸭肉肉质表面，或者将鸭肉产品进行浸泡在加有食品保鲜剂的溶剂，都可抑制鸭产品中大肠杆菌的繁殖，达到保鲜效果。

第九方面，本申请还提供一种检测试剂盒，该试剂盒包括前述的噬菌体PD328。基于噬菌体PD328对宿主菌的裂解特异性，本发明的噬菌体PD328可应用于耐药性鸭大肠杆菌的快速检测，包括但不限于以试纸、试纸盒等形式对耐药性鸭大肠杆菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，有效确保检测的灵敏度。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明针对鸭源耐药性、尤其是多重耐药性大肠杆菌提供了一种噬菌体PD328，不仅对鸭源耐药性、尤其是多重耐药性大肠杆菌表现出强裂解性，且裂解谱宽，能够有效防治多重耐药性大肠杆菌导致的疾病，具有降低鸭群死亡率、大肠杆菌病的发病率、保持肉质的新鲜度以及良好的清除环境中的致病菌的作用。该噬菌体可用作环境消毒剂的活性成分、饲料和水添加剂、食品保鲜剂和检测试剂盒等，在解决耐药性大肠杆菌感染的同时，避免了由于使用抗生素带来的抗生素残留和病原菌耐药性的问题。

2、本发明涉及的上述噬菌体从自然界中获得，易于进行工业化生产，由上述噬菌体制备而的药物或消毒剂不仅可降低成本，还具有绿色环保的优点。

3、本申请的噬菌体作为消毒剂使用时，能够明显降低环境中耐药性大肠杆菌的含量，进而减少鸭群大肠杆菌感染率，效果远优于现有的消毒剂。此外，苯扎溴铵作为消毒剂，其效果受消毒场所清洁度影响，带畜消毒时会引起畜禽应激，对鸭呼吸道造成一定的毒性，而噬菌体具有安全、无残留、高效等特点，不具有消毒剂苯扎溴铵的上述缺点，可做为一种新型生物环境消毒剂进行推广应用。

附图说明

图1为噬菌体PD328的噬菌斑图片；

图2为噬菌体PD328的电镜图片；

图3为噬菌体PD328的热稳定性测试结果；

图4为噬菌体PD328的pH值稳定性测试结果；

图5为噬菌体PD328的一步生长曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1鸭耐药大肠杆菌的分离筛选

1、实验方法：

大肠杆菌分离鉴定：于山东省潍坊(15份)、临沂(30份)、烟台(15份)地区的鸭场共采集60份疑似鸭大肠杆菌病的肝脏及脑部组织病料，无菌处理采集的病料于麦康凯培养基上划线分离细菌，将麦康凯琼脂平板，37℃培养16h，观察菌落生长情况。挑取典型的菌落进行纯化，革兰氏染色、镜检以及系列生化鉴定，确定为大肠杆菌分离株进行保存备用。

大肠杆菌耐药性测定：将测试大肠杆菌分离株接种于普通营养琼脂平板，于37℃培养16-24h，挑取3～4个单菌落，用4mL生理盐水配成0.5麦氏浊度菌悬液，然后用无菌棉签将菌悬液接种至MH琼脂平板上，每个平板放置3～4个药敏纸片，37℃培养20h，测量抑菌圈直径。药敏结果判定按照美国临床检验标准委员会(NCCLS)的标准判断敏感、中介或耐药。筛选出耐药和多重耐药大肠杆菌分离株。

2、实验结果：

大肠杆菌分离鉴定结果：60份病料中分离鉴定出45株细菌，其中潍坊区分离到13株，编号WF-Ec01～WF-Ec13，烟台区分离到10株，编号YT-Ec01～YT-Ec10，临沂区分离到22株，编号LY-Ec01～LY-Ec22。经生化试验鉴定分析，均符合大肠杆菌的特征，证明此45株分离株为大肠杆菌，分离率为75％。

45株大肠杆菌临床分离株药敏结果：45株鸭大肠杆菌临床分离株对阿莫西林、林可霉素、四环素、氟苯尼考和头孢噻肟耐药率＞50％，耐药性较严重。其中5株菌表现6重耐药(LY-Ec02、LY-Ec09、LY-Ec15、WF-Ec05、YT-Ec10)，3重以上耐药率86.67％。

表1 45株大肠杆菌临床分离株药敏结果

实施例2鸭耐药大肠杆菌噬菌体的分离筛选

1、实验方法：取适量采自山东多个养殖场的鸭毛脏污样品。将鸭毛脏污样品混合并剪碎浸泡于肉汤培养基中，并向培养基中加入准备好的5株6重耐药大肠杆菌分离株菌液。将混合物置于恒温摇床37℃，170rpm培养约16h，取培养液经0.22μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体增殖液；将噬菌体原液通过10倍比稀释，取合适梯度噬菌体稀释液分别和5株耐药大肠杆菌菌液逐一1:1混合均匀，37℃孵育5min后，吸取200μL混合液置于上层琼脂(琼脂浓度为0.7％)中，混匀后迅速倾倒下层琼脂(琼脂浓度为1.5％)平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃培养箱倒置培养4～6h后，获得形成噬菌斑的双层平板。

在形成噬菌斑的双层琼脂培养基挑取单个噬菌斑，并置于1mL的NB肉汤中于恒温摇床37℃，170rpm培养约30min得到噬菌体浸出液。取噬菌体浸出液与对应成斑的耐药大肠杆菌(后面称为宿主菌)增殖液1:1混合均匀(37℃孵育5min)，吸取200μL置于上层琼脂，混匀后迅速倾倒下层琼脂平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃培养箱倒置培养4～6h后，再次获得形成噬菌斑的双层平板。在形成噬菌斑的双层培养基上用灭菌镊子挑取单个噬菌斑置于1mL的LB肉汤中，于恒温摇床37℃，170rpm培养约30min得到噬菌体浸出液。重复以上步骤3次，得到纯化后的噬菌体浸出液，取等量纯化后的噬菌体浸出液与宿主菌增殖液于5mL液体NB培养基中，37℃，170rpm振荡培养，直至液体变清亮，将清亮液体11000rpm离心10min，取上清，使用0.22μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体增殖液，并分别测定噬菌体效价。

将分离到的耐药大肠杆菌噬菌体对45株鸭源大肠杆菌分离株采用双层平板法进行裂解谱测定。选择裂解率和效价均较高的噬菌体作为最终的筛选噬菌体株。

2、实验结果：按照上述实验方法，使用5株6重耐药大肠杆菌分离株筛选到5株耐药大肠杆菌噬菌体，编号PD325-PD329。5株耐药大肠杆菌噬菌体均在双层琼脂培养基平板上形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰可见，直径约0.5mm～1.25mm。经过效价测和裂解谱测定，最终选择出效价(3.50×10⁹pfu/mL)和裂解率(91.11％)均较高、综合性能最优异的鸭耐药大肠杆菌噬菌体PD328。

实施例3耐药大肠杆菌噬菌体PD328的形态学观察和鉴定

1、实验方法：取20μL噬菌体样本滴在带有碳涂布膜的铜网上，待其自然沉淀15min，用滤纸稍吸干后，再用2％(W/V)磷钨酸(PTA)染色1～2min，滤纸稍吸干，待干燥后，采用透射电子显微镜下进行观察拍照。

2、实验结果：如图2所示，噬菌体PD328具有呈多面体的头部结构和可收缩性的尾部，头部宽87～93nm，长106～113nm，尾部长约127～133nm，根据病毒分类国际委员会(ICTV)的分类方法，本申请的噬菌体形态符合肌尾噬菌体科的特征，属于肌尾噬菌体。

实施例4噬菌体PD328的全基因组分析

提取噬菌体PD328的基因组，进行全基因组测序和序列分析，该噬菌体的基因组序列在NCBI的GenBank号为ON922918，序列分析结果如下：

(1)PD328基因组全长59158kb，G+C含量为43.80％。全基因组RAST在线注释结果显示该基因组含有85个开放阅读框(ORFs)。在这85个开放阅读框(ORFs)中，发现结构蛋白有19种，主要包括噬菌体的结构和包装蛋白(头蛋白、尾蛋白、尾纤维蛋白、颈蛋白、衣壳蛋白和末端酶大亚基等)、噬菌体的裂解有关蛋白(裂解酶)、DNA复制和修饰有关的蛋白质(限制性内切核酸酶、DNA结合蛋白、含内含子的DNA聚合酶前体、HNH核酸内切酶、DEAD/DEAH盒解旋酶等)、其他功能性蛋白(重复感染免疫蛋白)。同时在85个ORFs中，有84个起始密码子为ATG，1个起始密码子为TTG。经软件tRNAscan-SE分析该基因组不含tRNA基因。经在线工具CGE server分析该基因组不含耐药基因及毒力基因。经PHASTER分析该基因组不含溶原性相关基因。

(2)噬菌体PD328的基因组中：与噬菌体宿主识别相关的尾部纤维(tail fibersprotein)蛋白基因序列见序列表序列1；高度保守的末端酶大亚基(terminase largesubunit)蛋白基因的序列见序列表中序列2；DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的序列见序列表中序列3，相关信息具体见下表2。

表2基因序列信息表

实施例5耐药大肠杆菌噬菌体PD328的温度稳定性

1、实验方法：

将加有相同体积的3×10¹⁰pfu/mL的噬菌体PD328增殖液的各个容器分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下，每一温度两个平行样，各保温20min、40min和60min后，待作用结束后取样，并立即将各个样品置于冰浴中冷却，再进行10倍比稀释，取合适稀释梯度测定其效价。以温度为横坐标，以噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制噬菌体的热稳定性曲线。

2、实验结果及分析：

如图3所示，噬菌体PD328在40℃、50℃和60℃作用60min后基本上保持原活性，70℃作用60min后，效价仍保持在1×10⁸pfu/mL以上，而在80℃作用60min，噬菌体数量约为1.25×10⁵pfu/mL，仍保持较强活性。可知耐药性大肠杆菌噬菌体PD328的热稳定性较高。

实施例6耐药大肠杆菌噬菌体PD328的pH稳定性

1、实验方法：

取无菌试管中加入不同pH值(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的NB肉汤4.5mL，各三支，然后将试管置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μL的3×10¹⁰pfu/mL噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后，立即向混合液中加入适量的1mol/L的HCl或者NaOH使混合液的pH值约为7，进行10倍比稀释，取合适稀释梯度测定效价，每个pH值试管设定2个重复。以pH值为横坐标，噬菌体效价的对数值为纵坐标绘制噬菌体pH值稳定性曲线。

2、实验结果及分析

从图4可知，噬菌体PD328在pH6.0～10.0范围内，其效价保持在10¹⁰pfu/mL，活性稳定；在pH 3.0时作用1h，效价在10⁵pfu/mL，能够抵抗一定的强酸环境；在pH11时作用3h效价在10⁶pfu/mL，pH12时作用3h，效价在10⁴pfu/mL，因此，噬菌体PD328能够抵抗一定的强碱环境。综上，噬菌体PD328具有较强的耐酸碱特性。

实施例7大肠杆菌噬菌体PD328的一步生长曲线

1、实验方法：

将感染复数为10的噬菌体增殖液和宿主菌新鲜增殖液各1mL，充分混匀(此时开始计时)，37℃孵育5min，13000rpm离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用5mL NB肉汤洗涤1次(13000rpm离心30s)，弃上清。用预热的NB肉汤混悬沉淀(总体积为5mL)并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养，在0时刻和每隔5min取出150μL，10000rpm离心1min，用NB肉汤做10倍倍比稀释后采用双层平板法测噬菌体效价，做3个平行，结果取平均值，以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，得到噬菌体PD328的潜伏期、爆发期，计算出爆发量。

爆发量＝噬菌体爆发末期的总个数/爆发初期细菌的总个数

2、实验结果及分析

从图5的结果可知，噬菌体PD328感染宿主菌后，噬菌体裂解周期时长约为110min，潜伏期约为20min，噬菌体的爆发期约为70min；在随后的60min内，噬菌体数量基本不变，进入稳定期，此时效价可达1.06×10⁹pfu/mL，噬菌体PD328的爆发量为106。

实施例8耐药大肠杆菌噬菌体PD328裂解谱的测定

1、实验方法：

选择于山东地区分离鉴定保存的鸭源多重耐药性大肠杆菌分离株45株作为裂解对象，其编号分别为WF-Ec01～WF-Ec13，YT-Ec01～YT-Ec10，LY-Ec01～LY-Ec22，菌株具体信息见表3-1。通过双层平板法测定PD328对这45株大肠杆菌的裂解率，同时使用本公司已授权专利CN110129283B中PD38(鸡源)和本公司另一件已授权专利CN111269893A公开的噬菌体PD07(鸡源)对上述大肠杆菌进行裂解谱测定，比较三株不同大肠杆菌噬菌体对上述45株多重耐药大肠杆菌的裂解差异性。

2、实验结果及分析

从下表3-2的裂解谱实验结果可知，鸭耐药性大肠杆菌噬菌体PD328能够裂解45株山东区鸭源耐药性大肠杆菌中的41株，裂解率高达91.11％；而大肠杆菌噬菌体PD38仅能够裂解45株山东区鸭源耐药性大肠杆菌中的30株，裂解率为66.67％；大肠杆菌噬菌体PD07仅能够裂解45株山东区鸭源耐药性大肠杆菌中的32株，裂解率为71.11％；显然，鸭耐药性大肠杆菌噬菌体PD328对鸭源耐药性大肠杆菌的裂解率远高于噬菌体PD38和PD07，鸭耐药性大肠杆菌噬菌体PD328对鸭源多重耐药性大肠杆菌表现出更优异的裂解性能、更宽的裂解谱。

表3-1 45株耐药鸭大肠杆菌详细信息

注：R表示耐药；I表示中介；S表示敏感。

表3-2三株噬菌体对45株鸭耐药性大肠杆菌的裂解谱

实施例9鸭耐药性大肠杆菌噬菌体PD328对非宿主性细菌的裂解试验

1、实验方法

选取10株沙门氏菌、5株葡萄球菌、5株变形杆菌和5株魏氏梭菌株，共25株不同类型的非宿主性细菌，按照实施例8中裂解谱的测定方法进行鸭耐药性大肠杆菌噬菌体PD328裂解谱测定实验。

2、实验结果及分析

鸭耐药性大肠杆噬菌体PD328与25株非宿主性细菌的双层平板中并未发现透亮噬菌斑，表明噬菌体PD328均无法识别上述10株大肠杆菌、5株葡萄球菌、5株变形杆菌和5株魏氏梭菌株非宿主性细菌，这说明供试噬菌体具有极强的宿主特异性，且对微生物群落无损伤作用，可用于制备检测试剂盒。

实施例10鸭耐药性大肠杆菌噬菌体PD328环境消毒试验

1、实验方法

山东某白羽肉种鸭场，该养鸭场常用抗菌药物有氟苯尼考、林可霉素、阿莫西林等，已经产生严重耐药现象。现用筛选的鸭耐药性大肠杆菌噬菌体PD328制剂以及鸭场常用消毒剂苯扎溴铵对该鸭场进行环境消毒试验效果验证。

噬菌体消毒剂的制备：取噬菌体液与宿主菌于NB肉汤培养基中1:1混合，37℃，170rpm培养4～6h，至液体清亮，可见细菌碎片。取清亮液体过滤去除细菌碎片残渣，测定噬菌体效价为1×10⁹pfu/ml，将噬菌体液体稀释100倍(可用培养基或无菌水等溶剂进行稀释)，制备成效价为1×10⁷pfu/mL消毒液，密封2～8℃保存，备用。

(1)空气消毒方式：

采用自然沉降法对消毒前后的鸭场空气进行采样，以中央点及墙角4点共5点作为测试点，采样点距地面0.5m，墙角四点离墙1m，每点放置9cm直径大小的SS平板。消毒前每个采样点使用2个SS平板，打开培养皿盖子，采样10min，使用鸭场自带的雾线进行噬菌体制剂消毒(10mL/m³，噬菌体效价1×10⁷pfu/mL)和苯扎溴铵消毒(苯扎溴铵1:25稀释)，消毒30min后，五个采样点再各放置2个SS平板，打开培养皿盖子，采样10min。将消毒前后的采样培养皿放置37℃恒温培养箱，培养12～24h，对培养细菌进行计数。

按奥氏公式记数菌落总数C＝50000N/AT，式中C:每立方米菌落总数(CFU/m³)；N:每皿菌落数；A:培养皿面积(cm²)；T:采样时间(min)。

(2)料槽消毒和漏缝地板消毒方式

按照DB11T1429-2017动物养殖场消毒效果评价规范对料槽和漏缝地板进行消毒采样。消毒前采样：吸取0.5mL的无菌PBS分装与灭菌的离心管中，用灭菌棉球蘸取PBS后涂抹采样面(采样面积10×10cm²),反复涂抹后放置于无菌离心管中，4℃保存，随机采集5个点。

使用鸭场自带的雾线分别进行噬菌体消毒(10mL/m³，噬菌体效价1×10⁷pfu/mL)和苯扎溴铵消毒(苯扎溴铵1:25稀释)，消毒30min后，按照消毒前采样方法随机选取5个点进行消毒后采样。参照GB 4789.2-2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定统计料槽和漏缝地板细菌总数，同时计算消亡率。

消亡率＝(消毒前样本平均菌数-消毒后样本平均菌数)/消毒前样本平均菌数×100％

2、实验结果及分析

如表4-1、4-2、4-3所示，经过鸭耐药性大肠杆菌噬菌体PD328消毒后，鸭舍的空气、料槽以及漏缝地板中的大肠杆菌消亡率在76％-93％，尤其是对漏缝地板的消毒效果最佳；这说明噬菌体PD328具有显著的杀菌消毒效果。PD328消毒比苯扎溴铵消毒的消亡率高40％以上，这说明本申请的噬菌体能够明显降低环境中耐药性大肠杆菌的含量，进而减少鸭群大肠杆菌感染率，效果远优于现有的消毒剂。此外，苯扎溴铵作为消毒剂，其效果受消毒场所清洁度影响，带畜消毒时会引起畜禽应激，对鸭呼吸道造成一定的毒性，而噬菌体具有安全、无残留、高效等特点，不具有上述苯扎溴铵的缺点，可做为一种新型生物环境消毒剂进行推广应用。

表4-1空气消毒前后的菌落计数

表4-2料槽消毒前后的菌落计数

表4-3漏缝地板消毒前后的菌落计数

实施例11鸭耐药性大肠杆菌噬菌体PD328对鸭耐药性大肠杆菌的治疗试验1、实验方法：

山东某5000羽养鸭场9日龄雏鸭突然出现精神萎靡不振，采食减少，严重腹泻，排出黄绿色粥样稀粪便，死亡率增加。场内兽医经临床症状和剖检病变以及病原分离判定为大肠杆菌感染，该场使用阿莫西林、庆大霉素等抗生素治疗病情并未好转。针对该场大肠杆菌病的爆发，使用本发明中噬菌体PD328进行治疗。治疗方式为向鸭场的饮用水中加入噬菌体PD328药物制剂(制备方法参照实施例10中的方法，只是稀释倍数不同)，使噬菌体的效价约1×10⁸pfu/mL，每日饮水一次，连续饮用7天。于第8天观察记录使用噬菌体治疗前后该鸭场鸭群腹泻、死亡等结果。

2、实验结果及分析

使用噬菌体PD328治疗7天后，鸭群的死亡数量由治疗前的55只/天降低至2只/天，鸭群腹泻粪便由粥样稀粪变为正常，腹泻得到明显改善。上述结果说明，使用噬菌体PD328后该鸭场大肠杆菌病得到有效控制。

表5噬菌体PD328治疗前后结果

时间	死亡数	稀粪比例
			治疗前1天	55	85％
治疗第1天	48	78％
			治疗第2天	35	62％
治疗第3天	24	50％
			治疗第4天	13	36％
治疗第5天	9	20％
			治疗第6天	2	14％
治疗第7天	2	10％

实施例12噬菌体的安全性试验

1、实验方法：

选取1日龄SPF鸭40只，分为噬菌体组和对照组，噬菌体组口服PD328 1×10⁹PFU噬菌体1mL，连续口服7天。对照组口服同等剂量无菌生理盐水。饲养14天后对SPF鸭进行剖检观察心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑部、肠道病变，饲养过程中观察精神、采食等状态。

2、实验结果及分析

在整个给药期间，噬菌体组和对照组没有观察到疾病或毒性症状，精神状态和采食正常。经过详细的临床剖检观察，无论是噬菌体组还是对照组，动物的主要器官以及肠道均正常。说明噬菌体PD328安全性较高，对动物机体无不良影响。

实施例13噬菌体PD328的存活稳定性试验

1、实验方法：

各取lml噬菌体PD328的纯培养液分装于无菌EP管中，分别于4℃、25℃、37℃下放置，定期经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。

2、实验结果及分析：

如表6所示，4℃条件下，噬菌体PD328可存放360d；25℃条件下，噬菌体PD328可存放360d，依旧保持8.47×10⁸pfu/ml较高效价；37℃下，噬菌体存放360d，效价降低为8.74×10⁵pfu/ml。且上述三种条件存放350天后，噬菌体对宿主菌的侵染力均大于95％。表明噬菌体PD328在4℃或25℃下保存360天效价较稳定，在37℃保存随着时间延长会引起效价明显降低。

表6噬菌体PD328于不同保存温度下的存活稳定性

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种鸭耐药性大肠杆菌噬菌体，其特征在于，被命名为PD328，其保藏编号为CGMCCNo.22364。

2.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的鸭耐药性大肠杆菌噬菌体和其他噬菌体。

3.如权利要求1所述的鸭耐药性大肠杆菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物在制备防治鸭耐药大肠杆菌感染的药物、饲料添加剂、环境消毒剂、食品保鲜剂和检测试剂盒中的应用。

4.一种噬菌体药物制剂，其有效成分包括如权利要求1所述的鸭耐药性大肠杆菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物；优选的，所述噬菌体药物制剂还包括其他抑菌或杀菌活性成分；所述药物制剂形式为口服给药剂型、外用剂型或肠外给药剂型。

5.一种饲料添加剂或饮用水添加剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的鸭耐药性大肠杆菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物。

6.一种环境消毒剂，其特征在于，有效成分包括如权利要求1所述的鸭耐药性大肠杆菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物；优选地，还包含其他用于环境中细菌抑制或消灭的活性成分；优选地，噬菌体的使用浓度为1×10⁷PFU/ml以上。

7.如权利要求6所述的环境消毒剂在鸭场环境消毒中的应用，其特征在于，所述环境消毒剂可通过喷雾、浸泡对养殖环境、饲养器具进行耐药性大肠杆菌的消毒，所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。

8.一种食品保鲜剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的鸭耐药性大肠杆菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物。

9.一种检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的鸭耐药性大肠杆菌噬菌体或如权利要求2所述的噬菌体组合物。

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