CN115948348B - 一种宽谱禽源沙门菌噬菌体及其应用和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种宽谱禽源沙门菌噬菌体及其应用和组合物。本发明宽谱禽源沙门菌噬菌体为噬菌体Sal P34，保藏编号为CGMCC No.45252，属于有尾噬菌体目，长尾噬菌体科；其核酸类型为双链DNA，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明的Sal P 34噬菌体对禽源沙门菌的宿主范围广、裂解性强，对温度和pH的稳定性强，不携带毒力基因和耐药基因，并且易于增殖与富集，作为家禽沙门菌病治疗剂具有商品化开发潜力。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种宽谱禽源沙门菌噬菌体及其应用和组合物。
背景技术
沙门菌是引起现代规模化养殖场鸡群发病的主要病原菌之一，其引起的鸡沙门菌病在各地养殖场普遍存在，且可垂直传播，严重危害养禽业的健康发展及动物源性食品安全。禽源沙门菌主要有：鸡白痢沙门菌、禽伤寒沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌等，其中肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌为人畜共患的病原，摄入沙门菌污染的肉、蛋、乳等动物源性食品可引起人类肠炎和食物中毒，具有重要的公共卫生意义。
长期以来，家禽沙门菌病的治疗药物以抗生素为主，由于抗生素的不合理使用，细菌耐药性不断增强，多重耐药菌的比例居高不下，导致抗生素对细菌性疾病的治疗效果下降，且抗生素残留对食品安全、公共卫生安全等构成威胁，同时，抗生素还可破坏肠道菌群平衡、降低动物免疫机能以及抗生素剂量超标引起的动物中毒、环境污染等，为保障食品安全，肉鸡养殖后期、蛋鸡产蛋期等禁止或限制抗生素的使用，给细菌病的防控带来困难，因此寻找一种高效、安全、无残留的杀菌制剂成为当务之急。
噬菌体是细菌的天敌，作为一种天然的抗菌剂，噬菌体具有抗生素无法比拟的优势，且噬菌体用于临床治疗已有悠久的历史，取得了较好效果，具有抗细菌感染的广阔应用前景。在家禽、牲畜养殖领域，噬菌体可用于减少或防治动物的细菌感染，还可用于控制养殖环境中的细菌密度。
专利号为CN202010924602.1的中国专利公开了保藏编号为CCTCCNO：M2020205的鸡白痢沙门氏菌噬菌体SG8P3。但在目前的实际应用中，由于沙门氏菌血清型众多，单一噬菌体由于其裂解特异性限制了其杀菌范围，研制一种广谱型沙门氏菌噬菌体，拓宽噬菌体杀菌范围、增加杀菌活性一直是本领域亟待解决的技术难题。鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种宽谱禽源沙门菌噬菌体及其应用和组合物。
本发明提供了一种宽谱禽源沙门菌噬菌体，宽谱禽源沙门菌噬菌体为噬菌体SalP34，保藏编号为CGMCC No.45252。
可选的，噬菌体Sal P34属于有尾噬菌体目，长尾噬菌体科；优选的，所述噬菌体Sal P34的头部为二十面体，头部的横径为56～59nm，头部的长径为59～61nm；噬菌体SalP34的尾部为细长圆柱状，所述尾部的长度为108～110nm，尾部的直径为10～12nm；噬菌体Sal P34的末端具有纤突结构。
可选的，噬菌体Sal P34的核酸类型为双链DNA，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
可选的，述噬菌体Sal P34在碱性条件下耐受性良好，最适pH值为6～12。
可选的，噬菌体Sal P34具有良好热稳定性，在50℃水浴60分钟后效价仍能保持109pfu/mL，70℃水浴40分钟后效价能保持104pfu/mL。
可选的，噬菌体Sal P34在MOI＝0.01条件下培养4小时，效价为3.0×1010pfu/mL。
本发明还提供了一种含有上述噬菌体的试剂或试剂盒。可选的，试剂或试剂盒选自生物杀菌剂、禽类养殖环境的清洁剂或消毒剂。
本发明提供了上述宽谱禽源沙门菌噬菌体在制备治疗禽沙门菌病的药物中的用途。
本发明还提供了一种用于防治禽源沙门菌的杀菌组合物，包括有效量的上述噬菌体Sal P34。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明的Sal P 34噬菌体对禽源沙门菌的宿主范围广、裂解性强，对温度和pH的敏感性差，并且具有易于增殖与富集，作为家禽沙门菌病治疗剂具有商品化开发潜力。
附图说明
图1为本发明实施例中噬菌体Sal P34所形成的噬菌斑；
图2为本发明实施例中噬菌体Sal P34的电镜照片；
图3为本发明噬菌体Sal P34的温度稳定性实验结果；
图4为本发明噬菌体Sal P34的酸碱稳定性实验结果；
图5为本发明噬菌体Sal P34的一步生长曲线；
图6为本发明噬菌体核酸类型电泳图，其中，M：15kb DNA Ladder；1.噬菌体SalP34的核酸；2-4分别为经DNaseΙ、RNase A和Mung Nuclease处理的噬菌体Sal P34的核酸。
保藏信息
本发明噬菌体Sal P34于2022年8月3日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45252。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例提出一种宽谱禽源沙门菌噬菌体，命名为噬菌体Sal P34(vB_SalP_LDW34)，保藏编号为CGMCC No.45252。根据电子显微镜观察，噬菌体Sal P34的头部为二十面体，头部的横径为56～59nm，优选为58nm；头部的长径为59～61nm，优选为60nm；噬菌体Sal P34的尾部为细长圆柱状，尾部的长度为108～110nm，优选为109nm；尾部的直径为10～12nm，优选为11nm；噬菌体Sal P34的末端具有纤突结构。根据国际病毒分类委员会第9次报告，可判断噬菌体Sal P34属于有尾噬菌体目，长尾噬菌体科。电镜照片如图2所示。本发明实施例的噬菌体Sal P34的核酸类型为双链DNA，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明实施例的噬菌体Sal P34宿主谱广，对于肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌均可形成噬菌斑。
通过检测，在81株禽源沙门菌中，噬菌体Sal P34在其上能形成噬菌斑的有69株，约占85.2％，包括21株肠炎沙门菌(21/29，72.4％)、18株鼠伤寒沙门菌(18/21，85.7％)和30株鸡白痢沙门菌(30/31，96.7％)。并且杀菌力强，其中噬菌斑透亮的(+3或+4)有48株，约占59.3％，包括17株肠炎沙门菌、16株鼠伤寒沙门菌和15株鸡白痢沙门菌，在所检肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌双层平板上能形成透亮噬菌斑的比例分别为17/29(58.6％)、16/21(76.2％)和15/31(48.4％)。
本发明实施例的噬菌体Sal P34的环境耐受程度较好，在碱性条件下耐受性良好，pH<5条件下效价显著降低，说明噬菌体Sal P34耐碱不耐酸，最适pH值为6～12。并且还具有良好热稳定性，在50℃水浴60分钟效价仍能保持109pfu/mL，70℃水浴40分钟后效价能保持104pfu/mL。
本发明实施例的噬菌体Sal P34易于增殖与富集，潜伏期为10分钟，随后效价稳定增长，暴发期持续时间为60分钟，之后为平台期，裂解量约为112pfu/cell。最佳感染复数MOI为0.01，在该条件下培养4小时，效价为3.0×1010pfu/mL。
经动物实验证实，本发明实施例的噬菌体Sal P34可有效抑制沙门菌感染引起的肠道、肝脏、心脏等的病理变化，降低雏鸡死亡率或避免死亡的发生。
本发明实施例的还涉及一种含有上述噬菌体的试剂或试剂盒。本领域技术人员可以根据本发明公开内容和本领域常识来制备本发明含有上述噬菌体或噬菌体组合物的试剂或试剂盒。例如可制备得到含有上述噬菌体的家禽沙门菌感染或沙门菌病的治疗剂，生物杀菌剂、禽类养殖环境的清洁剂或消毒剂。通过采用上述技术方案，可以用作为日常的杀菌剂，可以特异性地杀灭环境中的沙门菌，改善环境中的微生物分布；也可以用作在畜禽产品养殖、运输及保存的生物杀菌剂，用于防治在畜禽养殖、运输及保存过程中致病性的沙门氏菌污染；也可以与其它杀菌剂混合使用，喷洒于食品生产车间，防治食品加工过程中沙门菌的污染。
本发明实施例还涉及上述宽谱禽源沙门菌噬菌体在制备治疗禽源沙门菌引起疾病的药物中的用途。首先，可以作为由沙门氏菌引起的细菌感染提供潜在的治疗药物，可以用于预防或治疗因沙门菌引起的细菌感染。其次，还可以作为饲料添加剂添加于饲料中，可特异性、持续性防治饲料中沙门菌的生存和繁殖，防治饲料存储及动物养殖中沙门菌的污染。
本发明实施例的还涉及一种用于防治禽源沙门菌的杀菌组合物，包括有效量的噬菌体Sal P34。本发明的噬菌体也可以继续与其他噬菌体制备成组合物，用于更加广谱的抗菌或抑菌应用中去。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的菌株及噬菌体均由聊城大学噬菌体研究中心分离、鉴定和保存。
实施例1
本实施例用于说明禽源沙门菌噬菌体Sal P34的分离、纯化和保存：
1.1禽源沙门菌噬菌体Sal P34的分离
采用双层平板点滴法分离噬菌体。取从山东聊城某养鸡场采集的污水约1mL，加到盛有5mL LB液体培养基的试管中，37℃恒温摇床培养4小时，10000r/min离心5min，将上清液用0.22μm滤膜过滤除菌。取实验室保存的禽源沙门菌200μL与5mL冷却至55℃左右的LB半固体培养基混合于离心管中，倒入LB固体平板培养基上，静置待其凝固，制成双层平板。取以上过滤除菌的上清液10μL点滴于双层平板，37℃恒温培养6小时，观察噬菌斑的产生情况。
1.2禽源沙门菌噬菌体Sal P34的纯化
在长有噬菌斑的双层平板上，使用无菌枪头扣取大而透亮的单个噬菌斑，置SM缓冲液中静置12小时，0.22μm滤膜过滤，取滤液5μL点滴于其宿主菌制备的双层平板，37℃恒温培养6小时，重复扣取单个噬菌斑进行纯化4～6次，在双层平板上形成形态、大小一致的噬菌斑，如图1所示，得到纯化的噬菌体Sal P34。
1.3噬菌体的保存
将噬菌体增殖液与50％甘油按6：4比例混合，分装于2mL的冻存管，置-80℃冰箱保存，或制成冻干粉，置4℃冰箱保存。
将噬菌体Sal P34于2022年8月3日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.45252。
实施例2
本实施例用于说明噬菌体的电镜观察结果：
通过平板扩增法制备噬菌体高效价裂解液。取生长至对数期的宿主菌菌液400μL，与噬菌体裂解液以最佳感染复数比例混合，制备双层平板，37℃恒温培养12小时，向培养皿中加入SM缓冲液10mL，100rpm摇床4小时，收集洗脱液，12000r/min离心5min，0.22μm滤膜过滤，即得噬菌体高效价裂解液。经双层平板法测定，该噬菌体裂解液效价为2.6×1014pfu/mL，将其用2％磷钨酸(w/v，pH7.0)进行负染色，在透射电镜下观察噬菌体的形态，在100kV的加速电压下拍照，电镜照片如图2所示。
由图2可知，噬菌体Sal P34头部为二十面体，横径约57nm，长径约60nm，尾部为细长的圆柱状，长约109nm、直径约11nm，末端具有明显的纤突结构，根据国际病毒分类委员会第9次报告，可判断该噬菌体属于有尾噬菌体目，长尾噬菌体科。
实施例3
本实施例用于说明噬菌体Sal P34宿主谱的测定：
选用实验室鉴定保存的81株禽源沙门菌(包括21株鼠伤寒沙门菌、31株鸡白痢沙门菌和29株肠炎沙门菌)，采用双层平板点滴法，测定噬菌体Sal P34的宿主谱。
将10mL左右的LB固体培养基倒入无菌平皿，室温凝固，作为底层培养基。将预先灭菌的LB半固体培养基置50℃恒温水浴，取50℃水浴中的半固体培养基3mL加入10mL无菌离心管，冷却至46℃左右加入200μL沙门菌菌液，迅速混匀倒入固体平板上，至少放置15min，待其凝固。将81株禽源沙门菌分别做双层平板。
分别取噬菌体Sal P34 10μL点滴于以上各双层平板，37℃恒温过夜培养，观察是否有噬菌斑及噬菌斑的大小及透亮程度。按照点滴斑的状态进行分类和记录：
+4，噬菌斑大而透亮，细菌完全裂解；
+3，噬菌斑透亮，但有微弱的朦胧背景；
+2，裂解不完全，点样区域浊度较大；
+1，点样区域存在一些个别噬菌体斑块；
-，没有噬菌斑。结果如表1所示。
表1：噬菌体Sal P34的宿主谱测定结果
由表1可知，在检测的81株禽源沙门菌中，噬菌体Sal P34在其上能形成噬菌斑的有69株，约占85.2％，包括21株肠炎沙门菌(21/29，72.4％)、18株鼠伤寒沙门菌(18/21，85.7％)和30株鸡白痢沙门菌(30/31，96.7％)说明其宿主谱广。其中噬菌斑透亮的(+3或+4)有48株，约占59.3％，包括17株肠炎沙门菌、16株鼠伤寒沙门菌和15株鸡白痢沙门菌，在所检肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌双层平板上能形成透亮噬菌斑的比例分别为17/29(58.6％)、16/21(76.2％)和15/31(48.4％)。
噬菌体Sal P34对禽源沙门菌不同血清型菌株的覆盖率见表2。
表2：噬菌体Sal P34对禽源沙门菌不同血清型菌株的覆盖率
| 沙门菌血清型 | 敏感菌株/检测菌株 | 覆盖率 |
| 肠炎沙门菌 | 21/29 | 72.4％ |
| 鼠伤寒沙门菌 | 18/21 | 85.7％ |
| 鸡白痢沙门菌 | 30/31 | 96.7％ |
实施例4
本实施例用于说明噬菌体Sal P34效价的测定：
利用双层平板法测定噬菌体效价。将10mL左右的LB固体培养基倒入无菌平皿，室温凝固，作为底层培养基，将预先灭菌的LB半固体培养基置50℃恒温水浴。
取9个1.5mL无菌离心管，根据稀释倍数对其进行编号。向每个管中加900μL的无菌生理盐水，向第一个离心管中加入纯化后的噬菌体滤液100μL，混匀；更换移液器吸头取100μL至第2管，依次对噬菌体滤液进行10倍梯度稀释。
分别取不同稀释度的噬菌体稀释液100μL与100μL禽源沙门菌S46的菌液于10mL无菌离心管中混合，37℃孵育5min，向混合液中加入4～5mL 50℃的LB半固体培养基，然后立即倒入底部为LB固体培养基的平板中，至少放置15min，制备双层平板，37℃培养18～24小时，噬菌斑计数。选取噬菌斑数量在20～300个的平板进行计数，效价(pfu/mL)＝噬菌斑平均个数×10×稀释倍数。通过双层平板法测得噬菌体Sal P34的效价为6.1×109pfu/mL。
实施例5
本实施例用于说明噬菌体Sal P34最佳感染复数的测定：
感染复数(multiplicity of infection，MOI)是指在特定的时间内可吸附的噬菌体与宿主菌的数量比值。实际应用过程中，通常以在一定培养条件下获得噬菌体效价最高时噬菌体与宿主菌的数量比值为最佳MOI。
调整宿主菌浓度至108CFU/mL，按照MOI分别为10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001等的比例，用无菌LB液体培养基将噬菌体Sal P34裂解液进行10倍梯度稀释。取噬菌体稀释液和宿主菌培养液各100μL，加入到预先保温的5mL LB液体培养基中，37℃，180r/min震荡培养4小时。将混合培养物12000r/min离心2min，0.22μm滤膜过滤，得到裂解液。采用双层平板法测定噬菌体裂解液效价，重复三次，裂解液效价最高的感染复数即为该噬菌体的最佳感染复数。结果如表3所示。
表3：噬菌体最佳感染复数测定结果
| 感染复数 | 10 | 1 | 0.1 | 0.01 | 0.001 | 0.0001 |
| 噬菌体效价(pfu/mL) | 6.2×107 | 5.4×108 | 7.2×109 | 3.0×1010 | 5.2×109 | 6.5×108 |
由表3可知，噬菌体Sal P34的最佳感染复数为0.01。
实施例6
本实施例用于说明噬菌体Sal P34温度稳定性的测定：
将5管噬菌体裂解液(500μL/管)分别放入40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅中，在20min、40min、60min时各取样一次，采用双层平板法测量噬菌体效价，重复三次。
取15只灭菌的1.5mL离心管，每管加入Sal P34噬菌体裂解液500μL，3管为一组，分别放入40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅中，在20min、40min、60min时从不同温度的水浴锅中各取出一管，采用双层平板法测定噬菌体效价，重复三次。实验结果如图3所示。
由图3可知，噬菌体具有一定的温度稳定性，在50℃水浴60min效价能保持109pfu/mL，60℃作用20min效价保持在108pfu/mL，70℃水浴40min后效价能保持104pfu/mL，60min后效价为0，80℃条件下20min效价为0。
实施例7
本实施例用于说明噬菌体Sal P34酸碱稳定性的测定：
使用浓度为1mol/L的HCl和NaOH调整LB液体培养基的pH值分别为1～13，取不同pH值的LB液体培养基900μL加入噬菌体100μL，混合均匀，37℃水浴1小时，双层平板法测定不同pH处理下噬菌体效价。实验结果如图4所示。
噬菌体Sal P34在pH<5条件下效价显著降低，pH为1时噬菌体失活，pH＝6～12时，效价无显著变化，见图4。说明噬菌体Sal P34耐碱不耐酸。
实施例8
本实施例用于说明噬菌体Sal P34一步生长曲线的测定：
将噬菌体Sal P34裂解液与宿主菌S46的菌液按最佳感染复数比例混合，置于37℃水浴5min，12000r/min离心5min，弃上清，37℃预热的LB液体培养基洗涤2次，加入37℃预热的LB液体培养基1mL，重悬沉淀，将其加入到100mL 37℃预热的LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养，每10min取样一次，采用双层平板法测量噬菌体效价，持续120min，重复三次。
以时间为横轴，以噬菌体效价为纵轴，绘制噬菌体一步生长曲线，具体如图5所示。根据以下公式计算裂解量：裂解量＝最终噬菌体效价/初始宿主菌数量。
噬菌体SalP34的潜伏期为10分钟，随后效价稳定增长，爆发期持续时间为60分钟，之后为平台期，裂解量约为112pfu/cell。
实施例9
本实施例用于说明噬菌体Sal P34核酸类型的鉴定：
使用苯酚-氯仿法提取噬菌体核酸，取600μL噬菌体SalP34的裂解液于1.5mL离心管，依次加入3μL DNaseΙ和RNase A至终浓度均为1μL/mL，混匀，37℃水浴2小时。
加入24μL的0.5％ EDTA，混匀，80℃灭活15min。加入1.5μL的20mg/mL蛋白酶K，30μL的10％ SDS，混匀，56℃水浴1小时。加入等体积的Tris平衡酚，混匀，抽提核酸，12000rpm离心10min，将上层水相转移到新的离心管。加入等体积的DNA/RNA提取液，混匀，12000rpm离心10min，将上层水相转移到新的离心管。加入等体积的氯仿，混匀，12000rpm离心10min，将上层水相转移到新的离心管。加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃放置3小时，13000rpm离心20min，缓慢倒掉上清，收集沉淀。加入1mL预冷的75％乙醇，静置10min，12000rpm离心10min，缓慢倒掉乙醇，收集沉淀。室温干燥10min，用无核酸酶双蒸水溶解核酸沉淀。分别加入DNaseΙ和RNase A Mung Nuclease与噬菌体核酸在37℃下酶切1小时，酶切产物利用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。电泳结果见图6。
如图6可知，噬菌体SalP34的核酸经DNaseΙ酶切后完全降解，而RNase A和MungNuclease酶切并未对其造成影响，说明该噬菌体核酸类型为双链DNA。将噬菌体DNA送至生物公司进行测序，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例10
本实施例用于说明噬菌体Sal P34基因组的测定：
10.1噬菌体的预处理
将双层平板扩增法获得的高效价噬菌体于10000g、4℃离心20min，收集上清，加入DNase I和RNase A至终浓度为1μg/mL，室温放置30min；加入NaCl至终浓度为1mol/L(58.5g/L)，混匀，冰浴1～2小时；于4℃、10000g离心15～20min，收集上清。
10.2噬菌体的浓缩与梯度离心
按每100mL 10g的量加PEG-8000，搅拌使其溶解，冰浴过夜4℃、10000g离心15～20min，弃上清，将离心管倒置5min，使残余液体流干；用1mL SM缓冲液重悬沉淀；加入等体积的氯仿抽提(去除PEG)：震荡30s，然后4℃、5000g离心15min，回收上层含噬菌体的水相，再加等体积的氯仿抽提，重复3～5次，直至上层液相澄清，最后将回收的噬菌体浓缩液置于4℃保存。
10.3CsCl梯度离心
将噬菌体浓缩液缓慢加入CsCl梯度液，35000g水平离心3小时；将浓缩好的噬菌体转入透析袋，于4℃透析过夜，除去CsCl，得到纯化的噬菌体颗粒。
10.4测序
送测序公司进行序列测定，测得噬菌体Sal P34的基因组全长为43359bp，经分析，不具有毒力基因和耐药基因。
实施例11
本实施例用于说明噬菌体Sal P34对SPF鸡沙门菌感染的治疗试验：
1日龄SPF雏鸡与雏鸡饲料购自济南斯帕法斯家禽有限公司，饲养在相对湿度40％～70％，温度为27～32℃的隔离器中，饲喂雏鸡饲料。营养琼脂培养基、麦康凯培养基、LB液体培养基等，均购自北京陆桥技术有限责任公司；阿莫西林，购自陕西鲁康医药有限公司(批号：1122102077)；新霉素，购自宜昌三峡药业有限公司(批号：202006222)；细菌基因组DNA快速提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；阿莫西林、新霉素等药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司。
11.1噬菌体Sal P34的无菌检验
取5μL噬菌体SalP34裂解液，点滴于LB固体平板上，待其吸收后倒置于37℃恒温培养24小时，观察有无菌落生长。
裂解液点滴于LB固体平板，37℃恒温培养24小时，在平板上未发现菌落生长，说明噬菌体裂解液是无菌的，可用于治疗试验。
11.2感染用菌株LD50测定
感染用菌株S64为肠炎沙门菌，对菌悬液进行定量，调整菌悬液浓度为1×1011cfu/mL，并进行10倍梯度稀释至1×107cfu/mL。
5日龄SPF鸡50只，随机分为A、B、C、D、E组，每组10只，分别通过腹腔注射1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107的菌悬液100μL。观察雏鸡发病及死亡情况并记录，对死亡鸡进行剖检，观察病理变化，连续观察7d，各组死亡情况见表4。
表4：不同剂量感染各组死亡情况
| 组别 | 剂量 | 存活数 | 存活率 | 死亡数 | 死亡率 |
| A组 | 1×1010 | 0 | 0％ | 10 | 100％ |
| B组 | 1×109 | 2 | 20％ | 8 | 80％ |
| C组 | 1×108 | 6 | 60％ | 4 | 40％ |
| D组 | 1×107 | 8 | 80％ | 2 | 20％ |
| E组 | 1×106 | 10 | 100％ | 0 | 0％ |
根据改良寇氏法计算出肠炎沙门氏菌S64对SPF鸡的LD50为1.26×108cfu/mL。
11.3肠炎沙门菌S64的药敏试验
采用纸片扩散法测定S64对常用抗生素的敏感性，结果见表5。
表5：肠炎沙门菌S64对抗生素的敏感情况
| 药敏纸片 | 抑菌圈直径mm | 敏感性 | 药敏纸片 | 抑菌圈直径mm | 敏感性 |
| 阿莫西林 | 0 | R | 强力霉素 | 0 | R |
| 氟苯尼考 | 25 | S | 阿奇霉素 | 20 | S |
| 多粘菌素B | 10 | I | 妥布霉素 | 20 | S |
| 林可霉素 | 12 | I | 亚胺培南 | 20 | S |
| 新霉素 | 20 | S | 克林霉素 | 0 | R |
11.4噬菌体Sal P34对SPF鸡沙门菌感染的治疗试验
选用沙门菌S64的敏感药氟苯尼考和新霉素作为药物治疗对照。
100只5日龄SPF鸡随机分为空白对照组、感染不治疗组、噬菌体治疗组、氟苯尼考治疗组和新霉素治疗组，每组20只；
感染不治疗组、噬菌体治疗组、氟苯尼考治疗组和新霉素治疗组每只腹腔注射S46肠炎沙门菌1×108CFU，空白不感染组腹腔注射相同剂量的生理盐水；
每组在治疗前断水2小时，接种细菌2小时后，噬菌体治疗组通过饮水每只给予噬菌体Sal P34 106PFU，空白不感染组和感染不治疗组给予相同剂量的生理盐水，氟苯尼考治疗组和新霉素治疗组按照药物说明常规用量，各组每天给药1次，连用3天。
观察7天，观察各组发病及死亡情况，取死亡雏鸡剖检观察病变；各处理组鸡存活情况如表6所示。
表6：各处理组鸡存活情况
由表6可知，噬菌体治疗组、氟苯尼考治疗组均未发生死亡，具有良好治疗效果。对感染不治疗组、新霉素治疗组死亡鸡进行剖检，取肠道、肝脏、肾脏、心脏组织进行组织学检查，发现死亡鸡出现肠细胞坏死，粘膜固有层出血；肝脏内有大小不同的坏死灶；心脏炎性细胞浸润，形成肉芽肿；肾脏无明显病变。
感染7天后，对空白不感染组、噬菌体治疗组和氟苯尼考治疗组的鸡剖检，取肠道、肝脏、肾脏、心脏组织进行组织学检查，各组织器官未发现明显病理变化。
以上结果表明，Sal P 34噬菌体可有效抑制沙门菌感染引起的肠道、肝脏、心脏等的病理变化，降低雏鸡死亡率或避免死亡的发生。
本发明实施例所提供的Sal P 34噬菌体对禽源沙门菌的宿主范围广、裂解性强，对温度和pH具有易于增殖与富集，作为家禽沙门菌病治疗剂具有商品化开发潜力。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (11)
1.一种宽谱禽源沙门菌噬菌体，其特征在于，所述宽谱禽源沙门菌噬菌体为噬菌体SalP34，保藏编号为CGMCC No.45252。
2.根据权利要求1所述的宽谱禽源沙门菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体SalP34属于有尾噬菌体目，长尾噬菌体科。
3.根据权利要求2所述的宽谱禽源沙门菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体SalP34的头部为二十面体，所述头部的横径为56～59nm，所述头部的长径为59～61nm；所述噬菌体SalP34的尾部为细长圆柱状，所述尾部的长度为108～110nm，所述尾部的直径为10～12nm；所述噬菌体SalP34的末端具有纤突结构。
4.根据权利要求1所述的宽谱禽源沙门菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体SalP34的核酸类型为双链DNA，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.根据权利要求1所述的宽谱禽源沙门菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体SalP34在碱性条件下耐受性良好，最适pH值为6～12。
6.根据权利要求1所述的宽谱禽源沙门菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体Sal P34具有良好热稳定性，在50℃水浴60分钟后效价仍能保持109pfu/mL，70℃水浴40分钟后效价能保持104pfu/mL。
7.根据权利要求1所述的宽谱禽源沙门菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体SalP34在MOI＝0.01条件下培养4小时，效价为3.0×1010pfu/mL。
8.一种含有权利要求1～7任一项所述噬菌体的试剂或试剂盒。
9.根据权利要求8所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒选自生物杀菌剂、禽类养殖环境的清洁剂或消毒剂。
10.如权利要求1～7任一项所述的宽谱禽源沙门菌噬菌体在制备治疗禽源沙门菌引起的疾病的药物中的用途。
11.一种用于防治禽源沙门菌的杀菌组合物，其特征在于，包括有效量的如权利要求1～7任一项所述的噬菌体SalP34。
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