CN117004578B - 一种高通量分离及纯化多宿主噬菌体的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及微生物分离技术领域，提供了一种高通量分离及纯化多宿主噬菌体的方法。所述方法包括如下步骤：制备环境样本富集液、制备环境样本浓缩液、点滴法高通量筛选噬菌体、平板划线法纯化噬菌体。本发明能够高效的分离检测环境中对应不同宿主菌的噬菌体，分离纯化效率高且筛选的宿主范围广；本发明具有操作简便、快速等优点，该方法将加快从环境中分离新的噬菌体的速度，为噬菌体的应用提供帮助。
Description
技术领域
本发明属于微生物分离技术领域，具体涉及一种高通量分离及纯化多宿主噬菌体的方法。
背景技术
噬菌体是一种能够特异性感染细菌的病毒。最早是在1915年由英国科学家Frederick Twort和法国科学家Félixd’Hérelle发现。早在1920年，科学家已经开始开展噬菌体治疗的相关研究，已有公司开始研发并销售噬菌体制剂。但噬菌体的安全性以及疗效性未得到认可，当抗生素耐药性问题席卷全球时，噬菌体作为一种新型的抗菌制剂再次进入人们的视野。噬菌体可以特异性裂解细菌，治疗效果高效且安全，至今为止，噬菌体治疗已有百年历史，在未来也有广阔的应用前景。噬菌体分布广泛，预估噬菌体颗粒在自然界中约有1031个，是细菌数目的10倍，但目前新的噬菌体筛选速度仍不能满足人们的应用需求。
目前筛选噬菌体均从环境中取样，传统的环境样品处理方法会在环境样本中加入所需宿主菌进行增菌培养，但该方法可能导致优势宿主菌及其相应噬菌体的增殖，而忽略了样本中其他类型的噬菌体；进行不同宿主筛选时，每份样本需单独与相应宿主菌培养，再通过双层平板法培养噬菌斑进行筛选，该方法效率低下且不能从大量样品中进行快速筛选。高通量考马斯亮蓝法可通过酶标仪高通量检测样品吸光度变化来确定含噬菌体的样本，但该方法容易造成假阳性，且需要利用双层平板法获得噬菌斑进行进一步鉴定及纯化。此外，对噬菌体进行纯化时，传统的纯化方法需将噬菌体转移至缓冲液中，稀释后再培养单一噬菌斑，通过多次传代使噬菌体形态均一，该方法步骤繁琐，大大降低了噬菌体的筛选效率。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种高通量分离及纯化多宿主噬菌体的方法，以解决现有分离纯化方法效率低、假阳性、过程繁琐等问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种高通量分离及纯化多宿主噬菌体的方法，包括以下步骤：
制备环境样本富集液：将污水与LB液体培养基等体积混合，过夜培养，加入NaCl搅拌溶解后冰浴，离心，取上清液作为环境样本富集液待用；
制备环境样本浓缩液：在所述环境样本富集液中加入PEG溶液，搅拌溶解后沉淀，离心去除上清，加入PBS对沉淀进行重悬，滤膜过滤后获得环境样本浓缩液，转移至96孔深孔板中密封保存；
点滴法高通量筛选噬菌体：将不同宿主菌培养至对数期，与LB半固体培养基混合，利用液体处理系统将所述环境样本浓缩液点滴至含有宿主菌的LB半固体培养基上，培养，观察噬菌斑并获得对应多种宿主的噬菌体；
平板划线法纯化噬菌体：用接种环蘸取单个所述噬菌斑，在所述含有宿主菌的LB半固体培养基上划线培养，重复4~5次后得到纯化噬菌体。
优选的，所述将污水与LB液体培养基等体积混合，其中LB液体培养基的浓度是标准LB液体培养基的2倍。
优选地，所述过夜培养的条件为37 ℃，220 rpm。
优选地，所述NaCl的终浓度为1 M。
优选地，所述搅拌溶解后沉淀的时间为1h~4h。
优选地，所述离心的条件为4 ℃，11000 g离心10 min。
进一步的，所述将不同宿主菌培养至对数期包括：挑取不同单菌落至LB液体培养基中，过夜培养宿主菌液，再按比例转接到新鲜LB液体培养基中，培养至对数期。
优选的，所述比例为宿主菌液与新鲜LB液体培养基的比是1:20。
进一步的，所述噬菌斑用双层平板法验证其形态。
进一步的，所述噬菌斑用双层平板法验证其形态包括：将所述噬菌斑挑至PBS溶液进行稀释得到稀释液，取所述稀释液及所述宿主菌液与上层0.5%琼脂混合后倒至下层LB平板上，培养得到形态均一的噬菌斑。
进一步的，所述宿主菌包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌中的至少一种。
进一步的，所述得到纯化噬菌体后还包括对所述纯化噬菌体进行宿主谱检测。
进一步的，对所述纯化噬菌体进行宿主谱检测是将所述纯化噬菌体扩大培养后点滴至含有待测菌株的LB半固体培养基上，培养得到不同形态的噬菌斑，利用软件绘制宿主谱热图。
进一步的，所述待测菌株包括大肠杆菌、沙门菌中的至少一种。
进一步的，所述液体处理系统具体为NEMO全功能液体处理系统。
综上所述，本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明提供了一种高通量分离及纯化多宿主噬菌体的方法，在环境样本富集时不添加宿主菌，直接进行浓缩，结合平板点滴法，可一次性从大量环境样本中针对多种不同宿主菌进行噬菌体筛选；
（2）本发明利用平板法进行筛选，可直接观察噬菌斑大小判断噬菌体裂解酶能力；
（3）本发明可直接挑取单个噬菌斑进行传代，通过划线法可快速培养单一噬菌斑进行纯化。
附图说明
图1为本发明实施例提供的高通量分离及纯化多宿主噬菌体的方法流程示意图；
图2为本发明实施例提供的高通量分离及纯化多宿主噬菌体的整体流程示意图；
图3为本发明实施例提供的利用点滴法培养不同宿主菌所产生的噬菌斑结果图，其中A为大肠杆菌产生的噬菌斑结果图，B为铜绿假单胞菌产生的噬菌斑结果图，C为沙门菌产生的噬菌斑结果图，D为鲍曼不动杆菌产生的噬菌斑结果图，E肺炎克雷伯菌产生的噬菌斑结果图，F为嗜麦芽窄食单胞菌产生的噬菌斑结果图；
图4为本发明实施例提供的平板划线法培养大肠杆菌噬菌体的噬菌斑结果图，其中55~63对应96孔板中的55~63孔；
图5为本发明实施例提供的双层平板法培养大肠杆菌噬菌体的噬菌斑结果图；
图6为本发明实施例提供的大肠杆菌噬菌体的宿主谱检测结果图；
图7为本发明实施例提供的沙门菌噬菌体的宿主谱检测结果图。
具体实施方式
为了更加清楚地阐述本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的范例。
噬菌体是一种以细菌为宿主的病毒，在自然界的分布非常广泛，为地球上数量最多的微生物，大约是细菌的十倍。因为噬菌体以细菌为宿主，噬菌体常常伴随着细菌而存在，因而充满细菌的环境，如泥土、污水、动物的内脏里，都可以找到并分离、纯化相对应的噬菌体。
噬菌体颗粒感染一个细菌细胞后可迅速生成几百个子代噬菌体颗粒，每个子代颗粒又可感染细菌细胞，再生成几百个子代噬菌体颗粒。如此重复只需4次，一个噬菌体颗粒便可使几十亿个细菌感染而死亡。当把细菌涂布在培养基上，长成一层菌苔时，一个噬菌体感染其中一个细菌时，便会同上面所说的那样，把该细菌周围的成千上万个细菌感染致死，在培养基的菌苔上出现一个由于细菌被噬菌体裂解后造成的空斑，称为噬菌斑。
噬菌体具有极高的特异性，只针对某一种，甚至某一菌株进行侵染。因此，本发明通过从深圳市第三人民医院不同地点采集污水样本，对样本进行处理，如图1所示，包括，（1）制备环境样本富集液：将污水与LB液体培养基等体积混合，过夜培养，加入NaCl搅拌溶解后冰浴，离心，取上清液作为环境样本富集液待用；（2）制备环境样本浓缩液：在所述环境样本富集液中加入PEG溶液，搅拌溶解后沉淀，离心去除上清，加入PBS对沉淀进行重悬，滤膜过滤后获得环境样本浓缩液，转移至96孔深孔板中密封保存；（3）点滴法高通量筛选噬菌体：将不同宿主菌培养至对数期，与LB半固体培养基混合，利用液体处理系统将所述环境样本浓缩液点滴至含有宿主菌的LB半固体培养基上，培养，观察噬菌斑并获得对应多种宿主的噬菌体；（4）平板划线法纯化噬菌体：用接种环蘸取单个所述噬菌斑，在所述含有宿主菌的LB半固体培养基上划线培养，重复4~5次后得到纯化噬菌体。本发明能够高效的分离检测环境中对应不同宿主菌的噬菌体，分离纯化效率高且筛选的宿主范围广。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
如图2所示，本实施例提供了一种高通量分离及纯化多宿主噬菌体的方法，该方法包括如下步骤：
采集环境样本：从深圳市第三人民医院不同地点采集污水样本96份保存；
制备环境样本富集液：将96份污水与2×LB液体培养基等体积混合，37 ℃过夜培养，加入终浓度为1 MNaCl搅拌溶解后冰浴1 h，离心，取上清液作为环境样本富集液待用；
制备环境样本浓缩液：在环境样本富集液中加入10% PEG，搅拌溶解后沉淀至少1h，离心去除上清，加入PBS对沉淀进行重悬，用0.22μm滤膜过滤至96孔深孔板中，每孔对应一份环境样本浓缩液，用封板膜密封后4℃保存；
点滴法高通量筛选噬菌体：挑取不同单菌落至LB液体培养基中，培养至对数生长期后与0.5% LB培养基混合并倒至方形培养皿，利用液体处理系统将环境样本浓缩液点滴至含有宿主菌的LB半固体培养基上，培养6 h~8 h，观察噬菌斑并获得对应多种宿主的噬菌体；
平板划线法纯化噬菌体：用接种环蘸取单个噬菌斑，在含有宿主菌的LB半固体培养基上划线培养，重复4~5次后得到纯化噬菌体；
双层平板法验证噬菌斑形态：将噬菌斑挑至1mLPBS溶液进行稀释得到稀释液，取100μL稀释液及200 μL宿主菌液与上层0.5%琼脂混合后倒至下层LB平板上，培养得到形态均一的噬菌斑；
噬菌体的宿主谱检测：将噬菌体与宿主菌进行混合孵育培养，将混合培养液用0.22 μm滤膜过滤后获得噬菌体增殖液并取1mL至96孔深孔板中保存；取待测菌株500 µL与15 mL 0.5%半固体LB培养基混合，倒至方形培养皿，利用NEMO全功能液体处理系统将96孔深孔板中的纯化噬菌体点滴至含有宿主菌的LB半固体培养基上，培养6 h~8 h，观察噬菌斑形态并统计，利用graphpad软件绘制宿主谱热图。
实施例2
本实施例提供了环境样本的富集及浓缩方法，包括：
（1）采集环境样本：从深圳市第三人民医院不同地点采集污水样本96份，命名为W1~W96，每份样本50 mL，4℃保存。
（2）环境样本富集：取96份污水样本各15 mL，分别与15 mL 2×LB液体培养基等体积混合，37 ℃，220 rpm过夜培养，加入终浓度为1 M的NaCl搅拌溶解，冰浴1 h，11000 g，10min，4 ℃离心去除菌体，取上清。
（3）环境样本浓缩：在环境样本富集液中加入10% PEG，搅拌溶解后沉淀至少1 h，11000g，10 min，4 ℃离心去除上清，将沉淀用1 mL PBS重悬，0.22 μm滤膜过滤至96孔深孔板中，每孔对应一份环境样本浓缩液，用封板膜密封后4 ℃保存。
实施例3
本实施例提供了针对不同宿主菌的噬菌体的分离方法，包括：
表1 噬菌体筛选情况
（1）宿主菌的培养：分别挑取如表1所示单菌落至LB液体培养基中，过夜培养宿主菌液，再按1:20转接至新鲜LB中培养2 h~3 h至对数生长期，取500 µL所述宿主菌液与15mL 0.5%半固体LB培养基混合，倒至方形培养皿。
（2）点滴法培养噬菌斑：利用NEMO全功能液体处理系统，从96孔深孔板中批量吸取4 µL环境浓缩液，点滴至含有宿主菌的LB半固体培养基上，培养6 h~8 h，其产生的噬菌斑如图3所示。统计噬菌斑数目，如表1所示，从96份环境样本中筛选到87株以DH5α为宿主的噬菌体，85株以Pae3为宿主的噬菌体，35株以Sal8为宿主的噬菌体，2株以Aba7为宿主的噬菌体，92株以Kpn4为宿主的噬菌体，52株以Sma4为宿主的噬菌体。
实施例4
本实施例提供了噬菌体的纯化及验证方法。
（1）平板划线多次传代纯化：取大肠杆菌噬菌体的宿主菌500 µL与15 mL 0.5%半固体LB培养基混合，倒至方形培养皿，用接种环蘸取实施例3中所产生的大肠杆菌噬菌体的单一噬菌斑，在LB半固体培养基上划线，培养6 h~8 h，如图4所示，取96孔板中的55~63孔进行观察，可在平板上形成单个噬菌斑，重复上述步骤4~5次后可得到纯化噬菌体。
（2）双层平板法验证噬菌斑形态：将噬菌体单斑挑至1 mL PBS，用PBS稀释103、104、105，取100 µL稀释液及200 µL宿主菌液，与0.5%琼脂混合后倒至下层LB平板上，如图5所示，用此方法纯化的一株大肠杆菌噬菌体稀释104、105时可在双层平板上形成形态均一的噬菌斑。
实施例5
本实施例提供了噬菌体的宿主谱检测方法。
（1）噬菌体扩大培养：取6 mL对数生长前期大肠杆菌噬菌体宿主菌DH5α和6 mL对数生长前期沙门菌噬菌体宿主菌Sal8，分别加入87株大肠杆菌噬菌体及35株沙门菌噬菌体，37℃，150 rpm孵育2 h~3 h至菌液变清，将混合培养液用0.22μm滤膜过滤后获得约5mL噬菌体增殖液，取1mL至96孔深孔板中，每孔对应一种纯化噬菌体，用封板膜密封后4℃保存。
（2）大肠杆菌噬菌体宿主谱检测：取如表2所示的16株大肠杆菌待测菌株500 µL与15 mL 0.5%半固体LB培养基混合，倒至方形培养皿，利用NEMO全功能液体处理系统将96孔深孔板中的大肠杆菌噬菌体点滴至含有宿主菌的LB半固体培养基上，培养6 h~8 h，观察噬菌斑形态并统计，利用graphpad软件绘制宿主谱热图。如图6所示，深色表示产生清晰噬菌斑，浅色表示产生模糊噬菌斑，白色表示无噬菌斑。本实验分离的87株大肠杆菌噬菌体可侵染15株待测大肠杆菌菌株，宿主覆盖度约为94%。
（3）沙门菌噬菌体宿主谱检测：取如表2所示31株沙门菌待测菌株500 µL与15 mL0.5%半固体LB培养基混合，倒至方形培养皿，利用NEMO全功能液体处理系统将96孔深孔板中的沙门菌噬菌体点滴至含有宿主菌的LB半固体培养基上，培养6 h~8 h，观察噬菌斑形态并统计。如图7所示，本实验分离的35株沙门菌噬菌体可侵染27株待测沙门菌菌株，宿主覆盖度约为87%。
表2用于宿主谱检测的待测菌株
综上所述：本发明实施例在环境样本富集时不添加宿主菌，直接进行浓缩，可一次性从大量环境样本中针对多种不同宿主菌进行噬菌体筛选，且本发明实施例可直接挑取单个噬菌斑进行传代，通过划线法可快速培养单一噬菌斑进行纯化。成功从96份环境样本中筛选到87株大肠杆菌噬菌体，85株铜绿假单胞菌噬菌体，35株沙门菌噬菌体，2株鲍曼不动杆菌噬菌体，92株克雷伯氏菌噬菌体，52株嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体。并根据宿主谱检测，从环境样本中筛选得到的87株大肠杆菌噬菌体侵染16株待测大肠杆菌菌株，结果可侵染15株待测大肠杆菌菌株，宿主覆盖度约为94%，35株沙门菌噬菌体侵染31株待测沙门菌菌株，结果可侵染27株待测沙门菌菌株，宿主覆盖度约为87%。本发明适用于从大量环境中针对特定宿主菌高通量筛选其功能性噬菌体，解决了现有技术步骤繁琐、效率低下的问题。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种高通量分离及纯化多宿主噬菌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备环境样本富集液：将污水与LB液体培养基等体积混合，37℃、220rpm过夜培养，加入终浓度为1M的NaCl搅拌溶解后冰浴1h，11000g、4℃离心10min，取上清液作为环境样本富集液待用；
制备环境样本浓缩液：在所述环境样本富集液中加入10% PEG溶液，搅拌溶解后沉淀，11000g、4℃离心10min去除上清，加入PBS对沉淀进行重悬，0.22μm滤膜过滤后获得环境样本浓缩液，转移至96孔深孔板中4℃密封保存；
点滴法高通量筛选噬菌体：将不同宿主菌培养至对数期，与LB半固体培养基混合，利用NEMO全功能液体处理系统将所述环境样本浓缩液点滴至含有宿主菌的LB半固体培养基上，培养6-8h，观察噬菌斑并获得对应的宿主的噬菌体；
平板划线法纯化噬菌体：用接种环蘸取单个所述噬菌斑，在所述含有宿主菌的LB半固体培养基上划线培养6-8h，重复4~5次后得到纯化噬菌体；
所述宿主菌选自大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌。
2.根据权利要求1所述的一种高通量分离及纯化多宿主噬菌体的方法，其特征在于，所述将不同宿主菌培养至对数期包括：挑取不同单菌落至LB液体培养基中，过夜培养宿主菌液，再按比例转接到新鲜LB液体培养基中，培养至对数期。
3.根据权利要求1所述的一种高通量分离及纯化多宿主噬菌体的方法，其特征在于，所述得到纯化噬菌体后还包括对所述纯化噬菌体进行宿主谱检测。
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