CN104488823B - 一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，涉及动物模型构建领域，包括将若干CD仔猪养殖至18～25日龄，均分为感染组A和对照组B，判定CD仔猪体内不存在HPS病原、不含APP病原或APP抗体后，饲养至40～70日龄时，向感染组A中所有CD仔猪气管内接种HPS菌种；向对照组B中所有CD仔猪气管内注射培养基，得到空白组B′，观察并检测攻毒组A′、空白组B′，提取攻毒组A′、空白组B′的肺脏组织的总DNA，判定攻毒组A′的肺脏组织中存在HPS病原的同时，空白组B′的肺脏组织的中不存在HPS病原。本发明能够降低实验成本、简便建模流程，结果的准确度较高，更加符合动物福利的相关要求。

Description

一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法

技术领域

本发明涉及动物模型构建领域，具体涉及一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法。

背景技术

HPS(Haemophilus parasuis，副猪嗜血杆菌)是一种定居在猪上呼吸道部位的革兰氏阴性短小杆菌，HPS的毒力菌株侵入猪体后会使猪产生严重的系统性炎症疾病，临床表现以格拉泽氏病(Disease)，即血纤维蛋白性心包炎、多发性关节炎和脑膜炎；有些感染猪只还表现出急性肺炎和急性败血症。

从上个世纪末至今，HPS感染给世界各国的养猪业造成了严重的损失，HPS已成为猪场最主要的细菌性病原体之一，在我国呈全国性病发趋势。

现阶段没有预防HPS感染的有效措施。通常，在猪感染HPS后大量使用抗生素进行治疗，但一方面抗生素使用会造成养殖成本上升；另一方面大量抗生素的使用会导致排泄物和肉制品中存有抗生素残留，排泄物排入环境中容易造成环境污染，人体摄入含有抗生素的肉制品后，抗生素会在人体内聚集，导致人体抵抗力降低。因此，需要降低猪感染HPS后抗生素的使用量。

目前降低抗生素使用量的途径包括使用疫苗和培育抗病猪种，由于抗病育种可以从根本上解决病原体感染，因此，抗病育种成为未来猪育种产业发展的新方向。研究显示：常规的猪群中，不同的猪个体感染HPS后的表现存在差异，该差异与猪个体的遗传基因有关，该现象为通过遗传改良培育出抗性品系和/或抗性品种提供了充分的依据。

目前，本领域技术人员通过建立感染模型来筛选相关抗病基因，建立可靠的活体感染模型是培育出抗性品系和/或抗性品种的关键。建立感染模型(以下简称建模)具体是指：通过实施攻毒试验，收集攻毒后(含对照)的猪只在临床病征、生长发育、体温变化、血液参数和免疫指标表型数据用以评判建模效果，最终在实验室(或实验动物中心等实验性场地)复制出病原体感染猪只的相关生物学现象。

根据实验猪只的区别，可以将现有的感染模型分为普通级、CD级(Colostrum-Deprived，禁食母猪初乳)、CDCD级(Caesarean-Derivedand Colostrum-Deprived，剖腹产、禁食母猪初乳)和SPF级(Specificpathogen free，无特定病原体)。

普通级感染模型建立时，直接通过母体初乳对仔猪进行喂食，并对仔猪进行多次疫苗免疫，由于母体初乳中含有大量的抗体，可能会导致仔猪机体产生免疫，同时，进行疫苗免疫后也会产生抗体，产生抗体后的仔猪经HPS攻毒后可能会自行康复，难以复制HPS感染；HPS是一种寄居在猪上呼吸道部位的常见菌和机会性致病菌，母猪通常携带有HPS，因此会直接感染猪仔，影响建模效果。总之，普通级感染模型建立过程中存在较多影响因素，尤其是模型不稳定、结果不准确。

CDCD级感染模型建立时，仔猪是通过剖腹产得到的，对母猪实施剖腹产时，需要配备专业能力较强的外科手术医生和严格的无菌手术室，成本较高，难以推广。

SPF级感染模型建立时，需要使用HPS阴性猪，现在，HPS阴性猪群已很难找到，建模成本较高，操作难度较大，可靠性较低，难以推广。

CD级感染模型建立时，仔猪经母猪自然分娩后立即与猪舍隔离，一方面隔绝了CD仔猪出生早期HPS在上呼吸道的定植，另一方面由于禁食初乳最大程度上避免了母体抗体的不利影响；建模期间不需要苛刻的无菌环境，饲养条件也相对宽松，操作较为简单。所以CD仔猪是最适合作为HPS活体感染建模的实验动物，综合比较来看有望使得格拉泽氏病的复制更稳定、更现实、更可靠。

目前，Blanco等人所在的课题组(西班牙CISA)以及与之合作的PIC种猪公司和美国Minnesota大学相关课题组利用CD仔猪进行HPS感染建模。

现有的CD级感染模型建立时存在以下缺陷：

(1)CD仔猪喂养时，先使用牛初乳喂食3天，通常来讲，牛初乳的获得并不方便且需要做灭菌处理，不仅提高了实验成本而且可能会因含有牛肠炎病毒增加CD仔猪腹泻风险，CD仔猪的死亡率较高。

(2)已有模型对21日龄的CD仔猪进行攻毒，由于21日龄的CD仔猪体内器官发育尚不完善，相关实验结果可能难以全面反映猪只感染HPS后的症状，准确度较低；同时，使用与生产上断奶日龄(15～21日龄)相接近的CD仔猪进行实验，不太符合动物福利的相关举措。

(3)现有的CD仔猪至感染前存活率仅为50％～78.9％，存活率较低，实验成本较高。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，能够降低实验成本、简便建模流程，结果的准确度较高，更加符合动物福利的相关要求。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将自然分娩得到的若干禁食母猪初乳CD仔猪进行隔离，饲养至18～25日龄，将未死亡的CD仔猪随机均分为两组：感染组A和对照组B；待感染组A和对照组B的所有CD仔猪生长至30～40日龄时，采集感染组A和对照组B中所有CD仔猪的鼻拭子和非抗凝外周血；判定鼻拭子中不存在副猪嗜血杆菌HPS病原、且非抗凝外周血中不含猪胸膜肺炎放线杆菌APP病原或APP血清抗体，转入步骤二；

步骤二、待感染组A和对照组B的所有CD仔猪生长至40～70日龄时，向感染组A中所有CD仔猪的气管内接种剂量为107CFU～109CFU、分散于培养基中的HPS细菌，得到攻毒组A′；接种HPS细菌的同时，向对照组B中所有CD仔猪气管内注射与HPS剂量相同的培养基，得到空白组B′，转入步骤三；

步骤三、接种HPS细菌1～20天后，分别提取攻毒组A′、空白组B′的肺脏组织的总DNA，当攻毒组A′的肺脏组织的总DNA中存在HPS病原、且空白组B′的肺脏组织的总DNA中不存在HPS病原时，建模成功；当攻毒组A′的肺脏组织的总DNA中不存在HPS病原，或空白组B′的肺脏组织的总DNA中存在HPS病原时，重新执行步骤一～步骤三。

在上述技术方案的基础上，步骤一中所述将自然分娩得到的若干CD仔猪进行隔离，养殖至18～25日龄包括以下步骤：母猪自然分娩时人工助产，防止仔猪分娩后接触母猪、地面、栏舍及其他猪场物品，立即放入温度为33～35℃的无菌保温箱中，待CD仔猪体表干燥、保温箱内站立稳定或行走自如后，使用奶瓶饲喂温度为37℃的温开水约40ml，出生后3～5h内，将CD仔猪转移至实验动物中心负压条件下，温度为28～35℃的仔猪保育栏中；

CD仔猪的1～12日龄均喂食人工乳，其中：1～2日龄每日喂食次数为5次，3～4日龄每日喂食4次，5～14日龄每日喂食3次；每次的喂食量根据日龄的增长逐渐增加；CD仔猪自13日龄起，采用人工乳并辅助颗粒饲料喂食，其中：15～21日龄每日喂食3次，22日龄后自由采食颗粒饲料和饮水，养殖至18～25日龄时，CD仔猪的存活率为80％～85％。

在上述技术方案的基础上，自CD仔猪7日龄起开始训练采食颗粒料，CD仔猪13日龄后强制性在人工乳中添加CD仔猪颗粒料，首次添加量为：每升流食中含人工乳粉112g、颗粒料28g，之后按照颗粒料每日5～10％的比例递加，对应人工乳粉以5～10％的比例减少。

在上述技术方案的基础上，步骤一中将自然分娩得到的若干禁食母猪初乳CD仔猪进行隔离，饲养至18～25日龄，包括以下步骤：将CD仔猪饲养至3日龄后，判定CD仔猪拉稀，根据CD仔猪的体重，自发现日起，连续3天，向对应CD仔猪早晚分别注射50μl/kg的土霉素注射液和头孢噻呋钠注射液，并每天灌食糖盐水，每升糖盐水中含20g葡萄糖、3.5g氯化钠和2.5g碳酸氢钠。

在上述技术方案的基础上，步骤一中所述采集感染组A和对照组B中所有CD仔猪的鼻拭子和非抗凝外周血之后，还包括以下步骤：判定鼻拭子中存在HPS病原、且非抗凝外周血中含有APP病原或者非抗凝外周血含有APP血清抗体，将对应的CD仔猪移除，转到步骤二。

在上述技术方案的基础上，步骤二和步骤三之间还包括以下步骤：观察攻毒组A′、空白组B′中所有CD仔猪的行为举止、呼吸、跛行、关节肿胀、神经症状、咳嗽和进食情况；

采集所有攻毒组A′和空白组B′中CD仔猪的外周血，检测所有外周血的血液参数；攻毒1～20天，后将攻毒组A′、空白组B′中所有CD仔猪麻醉并放血，采集每头CD仔猪的颈部淋巴结、腹股沟淋巴结、腹膜、肠系膜淋巴结、肝、脾、肾、肺脏、心、脑膜和大脑组织；并对腹膜、脾脏、心脏、肺脏、脑膜、大脑组织进行切片并染色观察。

在上述技术方案的基础上，步骤二包括具体以下步骤：待感染组A和对照组B的所有CD仔猪生长至45日龄时，向感染组A中所有CD仔猪气管内接种剂量为109CFU、分散于培养基中的HPS细菌进行攻毒实验；向对照组B中所有CD仔猪气管内注射相同体积的培养基，得到空白组B′。

在上述技术方案的基础上，所述HPS细菌选用血清型为1、5、10、12、13或14的HPS细菌中的任意一种。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明中副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，包括使用人工乳喂食至12日龄；，13～21日龄，采用人工乳辅助颗粒饲料喂食，每日喂食3次，22日龄后，进行颗粒饲料自由采食和饮水。期间，自CD仔猪7日龄起开始训练采食颗粒料。与现有技术中仔猪存活率50％～78.9％，存活率较低，实验成本较高相比，本发明的CD仔猪存活率为80～85％，能够提高仔猪的存活率，有效降低实验成本。

(2)本发明中副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，包括对40～70日龄的CD仔猪进行攻毒实验，与现有技术中使用21日龄的CD仔猪，测定结果准确度较低，与动物福利相违背相比，本申请的CD仔猪发育较完善，能够准确反映实际养殖过程中的猪群感染HPS后的症状，为研究和预防HPS感染提供较好的研究平台，测定结果的准确度较高，符合动物福利理论。

本领域技术人员在进行模型的构建时，通常采用的为21日龄仔猪，即使参考其他文献，由于不同仔猪的生长发育情况不同，本领域技术人员不能仅仅参考其他品种仔猪的攻毒时间，轻易得到本发明的仔猪攻毒时间，即：该时间不是本领域技术人员根据实际情况能够轻易获得的。

(3)本发明中副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，包括判定非抗凝外周血中含有APP或者非抗凝外周血含有APP血清抗体，将对应的CD仔猪移除。本发明根据多次试验得到：APP或相关抗体的存在对HPS感染的影响较大，移除含有APP病原或者非抗凝外周血含有APP血清抗体的CD仔猪，能够提高结果的准确性和建模的成功率。

附图说明

图1为本发明实施例1和3中攻毒前CD猪只体内HPS病原检测的PCR电泳图；

图2为本发明实施例1中HPS攻毒前后通城CD猪外周血总白细胞对比图；

图3为本发明实施例1中HPS攻毒前后通城CD猪外周血主要白细胞亚类对比图；

图4为本发明实施例1中HPS攻毒后通城CD猪对照组与攻毒组猪只体温变化对比图；

图5为本发明实施例1中通城CD猪攻毒组和对比组的腹膜、脾脏、肺脏、心脏、脑膜、大脑组织细胞对比图；

图6为本发明实施例1中通城CD猪攻毒后肺脏组织中HPS的PCR鉴定电泳图；

图7为本发明实施例3中HPS攻毒后杜长大CD猪对照组与攻毒组猪只体温变化对比图。

图4、5、6、7中：所有C表示对照组，所有I表示实验组。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明实施例提供一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，包括以下步骤：

S1：将自然分娩得到的若干CD仔猪进行隔离后、放入温度为33～35℃的无菌保温箱中，待CD仔猪体表干燥、保温箱内站立稳定或行走自如后，使用奶瓶饲喂温度为37℃的温开水约40ml，出生后3～5h内，将CD仔猪转移至实验动物中心负压条件下，温度为28～35℃的保育栏中。

S2：参见表1所示，CD仔猪的1～12日龄均喂食人工乳(45℃温开水冲泡，每升含140g人工乳粉)，其中：1～2日龄每日喂食次数为5次，3～4日龄每日喂食4次，5～14日龄每日喂食3次。每次的喂食量根据日龄的增长逐渐增加。

CD仔猪自13日龄起，采用人工乳并辅助颗粒饲料喂食，其中：15～21日龄每日喂食3次，18～25日龄后自由采食颗粒饲料和饮水，转入步骤S3。

步骤S2期间，所有CD仔猪1日龄时肌肉注射浓度为10％、体积为1ml的右旋糖酐铁注射液；1～3日龄时，根据CD仔猪的体重，每天向每头CD仔猪注射50μl/kg的肌注土霉素注射液。

3日龄后，若有CD仔猪拉稀，则根据对应CD仔猪的体重，自发现日起，连续3天，向对应CD仔猪早晚分别注射50μl/kg的土霉素注射液和头孢噻呋钠注射液，并每天灌食糖盐水，每升糖盐水中含20g葡萄糖、3.5g氯化钠和2.5g碳酸氢钠。攻毒前2周停用任何抗生素药品。

其中，自CD仔猪7日龄起开始训练采食颗粒料；CD仔猪13日龄后强制性在人工乳中添加CD仔猪颗粒料，首次添加量为：每升流食中含人工乳粉112g、颗粒料28g，之后按照颗粒料每日5～10％的比例递加，对应人工乳粉以5～10％的比例减少。

通常，CD仔猪2周龄可主动采食颗粒料，但仍有部分CD仔猪不食，故13～21日龄仍主要以人工乳辅助进行喂食，防止CD仔猪因为进食不足影响健康状况和存活率，本发明实施例中CD仔猪的存活率为80％～85％，高于现有技术中的50％～78.9％。

S3：将未死亡的CD仔猪随机均分为两组：感染组A和对照组B。待感染组A和对照组B的所有CD仔猪生长至30～40日龄时(最优为35日龄)，采集感染组A和对照组B中所有CD仔猪的鼻拭子和非抗凝外周血。

判定鼻拭子中不存在HPS病原、非抗凝外周血中不含APP(Actinobacillus pleuropneumoniae，猪胸膜肺炎放线杆菌)病原或APP血清抗体，转入步骤S5。

其中，HPS病原采用PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)法检测，APP病原或APP血清抗体采用ELISA(enzymelinked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定)法检测。

判定鼻拭子中存在HPS病原、非抗凝外周血中含有APP病原或者非抗凝外周血含有APP血清抗体，将对应的CD仔猪移除。

S4：采集感染组A和对照组B中的所有CD仔猪的外周血2ml，测定血液中的WBC(血液总白细胞)、NEU(中性细胞)、LYM(淋巴细胞)、MONO(单核细胞)、EOS(嗜酸性粒细胞)、BASO(嗜碱性粒细胞)、RBC(红细胞)、HGB(血红蛋白浓度)、HAT(红细胞压积)、MCV(平均红细胞体积)、MCH(平均红细胞血红蛋白含量)、RDW(红细胞分布宽度)和PLT(血小板)，(以下简称血液参数)转入S5。

S5：待感染组A和对照组B的所有CD仔猪生长至40～70日龄(最优为45日龄)时，向感染组A中所有CD仔猪气管内接种剂量为107CFU～109CFU的HPS病原，HPS病原选用血清型为1、5、10、12、13或14的HPS病原中的任意一种，得到攻毒组A′，HPS的培养基选用TSB培养基(Tryptic Soy Broth，胰蛋白胨大豆肉汤培养基)

向对照组B中所有CD仔猪气管内注射相同体积的TSB培养基，得到空白组B′，转入步骤S6。

S6：观察攻毒组A′、空白组B′中所有CD仔猪的行为举止、呼吸、跛行、关节肿胀、神经症状、咳嗽和进食情况。

采集所有攻毒组A′和空白组B′中CD仔猪的外周血，检测所有外周血的血液参数，转入步骤S7。

S7：攻毒1～20天后，将攻毒组A′、空白组B′中所有CD仔猪麻醉并放血，采集每头CD仔猪的颈部淋巴结、腹股沟淋巴结、腹膜、肠系膜淋巴结、肝、脾、肾、肺脏、心、脑膜和大脑组织。并对腹膜、脾脏、心脏、肺脏、脑膜、大脑组织进行切片并染色观察，转入步骤S8。

S8：分别提取攻毒组A′、空白组B′的肺脏组织的总DNA，判断攻毒组A′的肺脏组织的总DNA中存在HPS病原的同时，空白组B′的肺脏组织的总DNA中不存在HPS病原。综合临床病征、组织病理和细菌鉴定判定HPS感染，若是，建模成功；否则，重复执行步骤S1～S8。

表1，CD仔猪饲喂方案

步骤S5之前包括以下步骤：

选择血清型为1、5、10、12、13或14的HPS细菌的培养：

向每800ml双蒸水或纯水中加入40g TSA(胰酪胨大豆琼脂)并定容至1L，搅拌均匀后放置于温度为121℃的条件下进行20～30min的高压蒸汽灭菌，冷却至65℃后，按体积份，加入5％的FBS和0.6％的NAD溶液，NAD溶液的浓度为1％(m/v)，摇匀后倒平板得到TSA平板。

向每800ml双蒸水或纯水中加入30g TSB(胰酪胨大豆肉汤)并定容至1L，搅拌均匀后于温度为121℃的条件下进行20～30min高压蒸汽灭菌，冷却至65℃后，按体积份，加入5％的FBS和0.6％的NAD溶液，NAD溶液的浓度为1％(m/v)，摇匀后得到TSB液体培养基。

向TSB液体培养基中接入HPS细菌，培养12～24h，得到菌液，然后经4000rpm离心10min，去上清液，加入适当体积的新鲜TSB液体培养基和与之等体积的、浓度为15％(m/v)无菌脱脂奶粉溶液并混合均匀，真空冷冻干燥后得到细菌，最后置于-80℃超低温冰箱保存。

HPS细菌的鉴定：挑取少量细菌，TSA固体培养基上划线培养24h，观察TSA固体培养基的表面是否形成针尖大小透明菌落，稍大菌落呈半透明或灰白色。

挑取少量细菌，进行革兰氏染色，判定为革兰氏阴性菌。

下面，通过2个实施例进行详细说明

实施例1，选择通城猪(我国国内纯种猪)作为实验猪

步骤101：将母猪自然分娩得到的若干通城CD仔猪进行隔离后、放入温度为35℃的无菌保温箱中，待通城CD仔猪体表干燥、保温箱内站立稳定或行走自如后，使用奶瓶饲喂温度为37℃的温开水40ml，出生后3h内，将通城CD仔猪转移至负压条件，大环境温度为28℃的保育栏中。

步骤102：本步骤与步骤S2相同，本实施例的饲养条件下，通城CD仔猪的存活率为80％。

步骤103：将未死亡的CD仔猪随机均分为两组：感染组A和对照组B。待感染组A和对照组B的所有CD仔猪生长至35日龄，采集感染组A和对照组B中所有CD仔猪的鼻拭子和非抗凝外周血。

判定鼻拭子中不存在HPS病原、非抗凝外周血中不含APP(Actinobacillus pleuropneumoniae，猪胸膜肺炎放线杆菌)病原或APP血清抗体，转入步骤104。

判定鼻拭子中存在HPS病原、非抗凝外周血中含有APP病原或者非抗凝外周血含有APP血清抗体，将对应的CD仔猪移除。

表2，部分通城CD仔猪APP血清抗体检测结果

图1中A为选用扩增产物为821bp的HPS特异性基因PCR电泳图，B为选用扩增产物为1090bp的HPS特异性基因PCR电泳图。

扩增产物为821bp的PCR引物序列为：5’GGCTTCGTCACCCTCTG3’/5’GTGATGAGGAAGGGTGGTGT3’，Tm(DNA熔解温度)＝60℃

扩增产物为1090bp的PCR引物序列为：HP1F3:tat cgR gag atgaaa gac/HP2F2:gta atg tct aag gac tag/HPRevx:cct cgc ggc ttc gtc，Tm＝56℃。

图1的A、B中，条带1～10为任意10头CD仔猪(将该10头仔猪记为TC03、TC07、TC09、TC14、TC04、TC05、TC06、TC10、TC11和TC13)的鼻拭子中HPS的鉴定结果，“+”为阳性对照条带，“-”为阴性对照条带，“M(Marker，标识)”为标识条带。

由图1可知，攻毒前，本实施例中的CD仔猪未感染HPS。

由表2可知，攻毒前，本实施例中的CD仔猪未感染APP。

步骤104：待感染组A和对照组B中的所有CD仔猪生长至45日龄时，采集所有CD仔猪的外周血，并检测血液参数。

待感染组A和对照组B中所有通城CD仔猪生长至45日龄时，对感染组A中所有CD仔猪气管内接种109CFU(体积为1ml，TSB悬浮)的HPS细菌，得到攻毒组A′；向对照组B中所有CD仔猪气管内注射体积为1ml的TSB液体培养基，得到空白组B′。

步骤105：攻毒后的第1天、第3天采集攻毒组A′和空白组B′中的所有CD仔猪的外周血，并测定血液参数。

参见表3所示，为通城CD仔猪攻毒组A′和空白组B′中部分CD仔猪的血液参数的主要指标检测情况。

表3，实施例1中CD仔猪血液检测结果

表3中，TC0300、TC0700、TC0900、TC1400、TC0400、TC0500、TC0600、TC1000、TC1100、TC1300依次对应标号为TC03、TC07、TC09、TC14、TC04、TC05、TC06、TC10、TC11、TC13的CD仔猪未攻毒时的外周血样品。

TC0301、TC0701、TC0901、TC1401、TC0401、TC0501、TC0601、TC1010、TC1101、TC1301依次对应标号为TC03、TC07、TC09、TC14、TC04、TC05、TC06、TC10、TC11、TC13的CD仔猪攻毒1天后的外周血样品。

TC0302、TC0702、TC0902、TC1402、TC0402、TC0502、TC0602、TC1020、TC1102、TC1302依次对应标号为TC03、TC07、TC09、TC14、TC04、TC05、TC06、TC10、TC11、TC13的CD仔猪攻毒3天后的外周血样品。

参见图2所示，本实施例中HPS攻毒前后通城CD猪外周血总白细胞没有明显变化。

参见图3所示，攻毒组A′中CD仔猪中参与炎症反应的嗜中性粒细胞呈增加趋势，外周血中淋巴细胞和单核细胞数量攻毒后呈现下降的趋势。

由于嗜中性粒细胞属于先天免疫应答的重要细胞，构成了机体细胞免疫的第一道防线，该细胞的大量增殖、活化有利于充分激活宿主免疫应答；单核细胞数量减少可能与组织巨噬细胞侵润有关。

淋巴细胞主要参与获得性免疫，一般来讲获得性免疫应答的激活需要一周或者更长的时间，所以感染后3天不大可能存在淋巴细胞的大量增殖，但是攻毒组A′中CD仔猪的外周血中的淋巴细胞呈减少趋势，说明HPS感染可能通过抑制淋巴细胞增殖实现其免疫逃避的目的；嗜碱性粒细胞主要参与寄生虫感染和过敏反应，HPS感染期间尽管可能会有影响，但结果显示效果甚微。

步骤106：观察攻毒组A′、空白组B′中所有通城CD仔猪的行为举止、呼吸、跛行、关节肿胀、神经症状、咳嗽和进食情况。

步骤107：攻毒组A′中的CD仔猪气管内接种攻毒12h后出现畏寒、扎堆、饮食废绝，严重个体甚至已不愿站立；24h后猪只中出现跛行、关节肿大的典型征状，个别的呈现出急性败血症状或严重的神经症状；36h起感染猪只开始陆续死亡，此期间空白组B′的CD仔猪一直正常。

攻毒组A′中的CD仔猪死亡前称重结果显示，自感染日起至死亡基本无体重增加甚至略有下降，说明猪只感染后生长发育停滞。

参见图4所示，图中的A对应对照组B′，图中的B对应攻毒组A′，直肠测温结果显示，攻毒组A′的CD仔猪感染后，体温明显升高，大多数猪只的体温上升至41.5℃～42℃。

步骤108：判定攻毒组A′中通城CD仔猪出现垂死挣扎，将攻毒组A′中垂死的通城CD仔猪、空白组B′中的所有CD仔猪麻醉并放血后，采集每头通城CD仔猪的颈部淋巴结、腹股沟淋巴结、腹膜、肠系膜淋巴结、肝、脾、肾、肺脏、心、脑膜和大脑组织。其中，腹膜、脾脏、心脏、肺脏、脑膜、大脑组织用于作石蜡组织切片并染色观察。提取肺脏组织总DNA，利用PCR法判定攻毒组A′中通城CD仔猪肺脏中的HPS病原。

参见图5所示，为攻毒组A′中死亡的通城CD仔猪、空白组B′中的通城CD仔猪的颈部淋巴结、腹股沟淋巴结、腹膜、肠系膜淋巴结、肝、脾、肾、肺脏、心、脑膜和大脑组织的对比图。

从图中对比可以看出，攻毒组A′中死亡的通城CD仔猪对应的腹膜、脾脏、心脏、肺脏、脑膜和大脑组织中均可有明显的巨噬细胞浸润，各个组织的形态结构均发生了变化，其中肺脏组织结构变化最为明显，说明HPS进入CD仔猪体内后，主要聚集在肺脏中，侵蚀肺脏细胞。

图6中，C1、C2、C3为空白组B′任意3只CD仔猪肺脏中HPS特异性基因的PCR扩增电泳图；I1、I2、I3为攻毒组A′中任意3只CD仔猪肺脏中HPS特异性基因的PCR扩增电泳图，M为标准分子量(DL2000)，“-”为阴性对照，“+”为HPS阳性对照。而且，进一步通过分菌培养和PCR扩增证明了HPS的存在。

综上，证实攻毒后通城CD仔猪肺脏内含有HPS。由此可知，本实施例HPS病原成功感染了通城CD仔猪，采用本实施例的方法，能够实现HPS病原感染CD仔猪模型的建立。

实施例2，选择杜长大三元杂交猪作为实验猪

步骤201：将母猪自然分娩得到的若干杜长大三元CD仔猪进行隔离后、放入温度为33℃的无菌保温箱中，待通城CD仔猪体表干燥、保温箱内站立稳定或行走自如后，使用奶瓶饲喂温度为37℃的温开水40ml，出生后5h内，将通城CD仔猪转移至负压条件，温度为35℃的保育栏中。

步骤202：本步骤与步骤S2相同，本实施例的饲养条件下，杜长大三元CD仔猪的存活率为85％。

步骤203：将未死亡的CD仔猪随机均分为两组：感染组A和对照组B。待感染组A和对照组B的所有CD仔猪生长至30日龄，采集感染组A和对照组B中所有CD仔猪的鼻拭子和非抗凝外周血。判定鼻拭子中不存在HPS病原、非抗凝外周血中含APP(Actinobacillus pleuropneumoniae，猪胸膜肺炎放线杆菌)病原或APP血清抗体，转入步骤204。

判定鼻拭子中存在HPS病原、APP病原或APP血清抗体，将对应的CD仔猪移除。

步骤204：待感染组A和对比组B的所有杜长大三元CD仔猪生长至70日龄时，向感染组A中若干CD仔猪气管内接种剂量为107CFU的HPS细菌，若干CD仔猪气管内接种HPS 109CFU得到攻毒组A′；向对比组B的所有杜长大三元CD仔猪气管内注射等剂量的TSB液体培养基，得到空白组B′，转入步骤205。

步骤205：攻毒后的第1天、第7天、第11天，分别采集攻毒组A′和空白组B′中的所有CD仔猪的外周血，并测定血液参数。

步骤206：观察攻毒组A′、空白组B′中所有杜长大三元CD仔猪的行为举止、呼吸、跛行、关节肿胀、神经症状、咳嗽和进食情况。

步骤207：攻毒5天后，将攻毒组A′中死亡的杜长大三元CD仔猪、空白组B′中的所有杜长大三元CD仔猪麻醉并放血后，采集每头杜长大三元CD仔猪的颈部淋巴结、腹股沟淋巴结、腹膜、肠系膜淋巴结、肝、脾、肾、肺脏、心、脑膜和大脑组织。将腹膜、脾脏、心脏、肺脏、脑膜、大脑组织进行切片并染色。

步骤208：通过PCR法提取攻毒组A′和空白组B′中杜长大三元CD仔猪肺脏中的DNA，测定得到攻毒组A′的所有CD仔猪肺脏均含有HPS病原，空白组B′的所有CD仔猪肺脏均不含有HPS病原，建模成功。

实施例3对比例，选择杜长大三元CD仔猪

步骤301：本步骤与步骤201相同。

步骤302：本步骤与步骤S2相同，杜长大三元CD仔猪的存活率为83％。

步骤303：本步骤中，除了采集时间为40天，将感染APP病原体的CD仔猪保留外，其他处理方式与步骤203相同。

参见图1所示，图中C为对其中12头(泳道1～12)杜长大三元CD仔猪鼻拭子中HPS的鉴定结果，HPS特异性基因PCR扩增产物为821bp，最后3个泳道依次为HPS阳性对照、阴性对照和Marker条带(标准分子量，DL2000)。

图1的D中，条带1～12为任意12头杜长大三元CD仔猪的鼻拭子中HPS的鉴定结果，HPS特异性基因PCR扩增产物为1090bp，“+”为阳性对照条带，“-”为阴性对照条带，“M(Marker，标识)”为标识条带。

参见表4所示，杜长大三元CD仔猪血清中APP抗体水平(OD值)均高于阳性判定临界值0.508，说明存在APP感染。

参见图1与表4可知，本实施例得到感染组A和对比组B的部分杜长大三元CD仔猪中，感染前不含有HPS，但血清中含有APP抗体(即存在APP感染)。

表4，部分杜长大三元CD仔猪APP血清抗体检测结果

步骤304：本步骤中，将感染组A分为两组，分别注射剂量为10⁷CFU和10⁹CFU的HPS细菌攻毒，作为攻毒组A′；将对照组均分为两组，分别注射剂量与HPS细菌相同的培养基。

步骤305：本步骤与步骤205相同。

步骤306：本步骤与步骤206相同。

测量攻毒组A′、空白组B′中所有杜长大三元CD仔猪体温。

参见图7所示，图中，A对应对照组B′，B对应攻毒组A′，由图7可知：与攻毒前相比，使用10⁷CFU或10⁹CFU HPS细菌攻毒后2周内CD仔猪体温并未发生显著变化。

步骤307：本步骤与步骤207相同。

步骤308：本步骤与步骤208相同。

本实施例中，攻毒组A′、空白组B′中所有杜长大三元CD仔猪攻毒后并未出现典型病征。

参见图7所示，图中，A对应攻毒组A′的CD仔猪体温随时间变化，B对应空白组B′的CD仔猪的体温随时间变化，横坐标中，0之前为未攻毒的时间，0为攻毒当天时间，0之后为攻毒后的时间。

同时感染HPS病原和APP的杜长大三元CD仔猪，其直肠测温结果表明未发生显著改变。

对比通城CD仔猪情况说明APP血清抗体对HPS产生了免疫交叉保护，影响了HPS感染的活体建模。

本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (8)

1.一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将自然分娩得到的若干禁食母猪初乳CD仔猪进行隔离，饲养至18～25日龄，将未死亡的CD仔猪随机均分为两组：感染组A和对照组B；待感染组A和对照组B的所有CD仔猪生长至30～40日龄时，采集感染组A和对照组B中所有CD仔猪的鼻拭子和非抗凝外周血；判定鼻拭子中不存在副猪嗜血杆菌HPS病原、且非抗凝外周血中不含猪胸膜肺炎放线杆菌APP病原或APP血清抗体，转入步骤二；

步骤二、待感染组A和对照组B的所有CD仔猪生长至40～70日龄时，向感染组A中所有CD仔猪的气管内接种剂量为10⁷CFU～10⁹CFU、分散于培养基中的HPS细菌，得到攻毒组A′；接种HPS细菌的同时，向对照组B中所有CD仔猪气管内注射与HPS剂量相同的培养基，得到空白组B′，转入步骤三；

步骤三、接种HPS细菌1～20天后，分别提取攻毒组A′、空白组B′的肺脏组织的总DNA，当攻毒组A′的肺脏组织的总DNA中存在HPS病原、且空白组B′的肺脏组织的总DNA中不存在HPS病原时，建模成功；当攻毒组A′的肺脏组织的总DNA中不存在HPS病原，或空白组B′的肺脏组织的总DNA中存在HPS病原时，重新执行步骤一～步骤三。

2.如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于，步骤一中所述将自然分娩得到的若干CD仔猪进行隔离，养殖至18～25日龄包括以下步骤：母猪自然分娩时人工助产，防止仔猪分娩后接触母猪、地面、栏舍及其他猪场物品，立即放入温度为33～35℃的无菌保温箱中，待CD仔猪体表干燥、保温箱内站立稳定或行走自如后，使用奶瓶饲喂温度为37℃的温开水约40ml，出生后3～5h内，将CD仔猪转移至实验动物中心负压条件下，温度为28～35℃的仔猪保育栏中；

CD仔猪的1～12日龄均喂食人工乳，其中：1～2日龄每日喂食次数为5次，3～4日龄每日喂食4次，5～14日龄每日喂食3次；每次的喂食量根据日龄的增长逐渐增加；CD仔猪自13日龄起，采用人工乳并辅助颗粒饲料喂食，其中：15～21日龄每日喂食3次，22日龄后自由采食颗粒饲料和饮水，养殖至18～25日龄时，CD仔猪的存活率为80％～85％。

3.如权利要求2所述的副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于：自CD仔猪7日龄起开始训练采食颗粒饲料，CD仔猪13日龄后强制性在人工乳中添加CD仔猪颗粒饲料，首次添加量为：每升流食中含人工乳粉112g、颗粒饲料28g，之后按照颗粒饲料每日5～10％的比例递加，对应人工乳粉以5～10％的比例减少。

4.如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于：步骤一中将自然分娩得到的若干禁食母猪初乳CD仔猪进行隔离，饲养至18～25日龄，包括以下步骤：将CD仔猪饲养至3日龄后，判定CD仔猪拉稀，根据CD仔猪的体重，自发现日起，连续3天，向对应CD仔猪早晚分别注射50μl/kg的土霉素注射液和头孢噻呋钠注射液，并每天灌食糖盐水，每升糖盐水中含20g葡萄糖、3.5g氯化钠和2.5g碳酸氢钠。

5.如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于，步骤一中所述采集感染组A和对照组B中所有CD仔猪的鼻拭子和非抗凝外周血之后，还包括以下步骤：判定鼻拭子中存在HPS病原、且非抗凝外周血中含有APP病原或者非抗凝外周血含有APP血清抗体，将对应的CD仔猪移除，转到步骤二。

6.如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于，步骤二和步骤三之间还包括以下步骤：观察攻毒组A′、空白组B′中所有CD仔猪的行为举止、呼吸、跛行、关节肿胀、神经症状、咳嗽和进食情况；

采集所有攻毒组A′和空白组B′中CD仔猪的外周血，检测所有外周血的血液参数；攻毒1～20天后将攻毒组A′、空白组B′中所有CD仔猪麻醉并放血，采集每头CD仔猪的颈部淋巴结、腹股沟淋巴结、腹膜、肠系膜淋巴结、肝、脾、肾、肺脏、心、脑膜和大脑组织；并对腹膜、脾脏、心脏、肺脏、脑膜、大脑组织进行切片并染色观察。

7.如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于，步骤二包括具体以下步骤：待感染组A和对照组B的所有CD仔猪生长至45日龄时，向感染组A中所有CD仔猪气管内接种剂量为10⁹CFU、分散于培养基中的HPS细菌进行攻毒实验；向对照组B中所有CD仔猪气管内注射相同体积的培养基，得到空白组B′。

8.如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于：所述HPS细菌选用血清型为1、5、10、12、13或14的HPS细菌中的任意一种。