CN102037929A - 一种猪链球菌2型本动物感染模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪链球菌2型本动物感染模型的构建方法。本发明提供的的方法，包括如下步骤：在仔猪的口腔上颚扁桃体部位喷雾接种猪链球菌2型，得到猪链球菌2型本动物感染模型。本发明有效的克服了现有诸多技术问题，成功构建了一种猪链球菌2型本动物感染模型。本发明构建的动物模型可应用于如下领域：探索不同毒力菌株与猪链球菌疾病进程的关系；全程监测猪链球菌感染动物发病的临床症状、白细胞、超敏反应C蛋白、细胞因子的动态变化；探索hs-CRP和细胞因子等监测指标与致病机理的关系；探索猪链球菌2型致病机理；进行疫苗开发和效果评价；进行抗猪链球菌2型细菌药物的筛选和药品效果评价。

Description

一种猪链球菌2型本动物感染模型的构建方法

技术领域

本发明涉及一种猪链球菌2型本动物感染模型的构建方法。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是一种重要的人兽共患病原菌，可侵害各年龄阶段的猪，病猪通常以败血症、脑膜炎、关节炎、淋巴结炎为主要特征。根据猪链球菌的荚膜多糖抗原(CPS)可将其分为35个血清型，其中能引起人和动物发病的致病性猪链球菌血清型主要是1型(SS1)、2型(SS2)、7型(SS7)和9型(SS9)。SS2和SS7都是能够同时感染人和猪的病原菌，该病也属于国家重点防范的人畜共患病之一。

目前国内外对猪链球菌病原、诊断及流行病学等方面的研究已经取得了非常大的进展，但未开发出合适的猪链球菌2型动物模型。动物模型的建立，是研究SS2感染机制、开发和评价疫苗及治疗性药品的基础。国内外有利用小鼠、豚鼠、兔、及斑马鱼等来研究SS2的动物感染模型。但这些动物不能良好地复制出和本源动物或人感染的典型临床症状，不能广泛应用于SS2研究中。而且容易导致对SS2毒力判断的失误，例如临床上对猪表现为低致病力或无致病力的菌株，却可对小鼠表现出强致病力，导致小鼠的死亡。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪链球菌2型本动物感染模型的构建方法。

本发明提供的构建猪链球菌2型本动物感染模型的方法，包括如下步骤：在仔猪的口腔上颚扁桃体部位喷雾(喷洒)接种猪链球菌2型，得到猪链球菌2型本动物感染模型。

所述仔猪可为杜×大×长三元杂交猪(即杜洛克猪、大白猪和长白猪的三元杂交猪)仔猪。

所述猪链球菌2型的接种量具体可为10¹⁰cfu(CFU)。

所述仔猪可具体为7周龄的雄性杜×大×长三元杂交猪仔猪。

所述方法还可包括将进行所述接种后的仔猪进行实时荧光PCR鉴定的步骤；所述实时荧光PCR鉴定所用的引物对由序列表的序列1所示的DNA和序列表的序列2所示的DNA组成。

接种后第3至5天作为猪链球菌2型本动物感染模型较好。

本发明有效克服了现有诸多技术问题，成功构建了一种猪链球菌2型本动物感染模型。本发明构建的动物模型可应用于如下领域：模拟人脑膜炎、STSS病程及康复后的遗症；探索不同毒力菌株与猪链球菌疾病进程的关系；全程监测猪链球菌感染动物发病的临床症状、白细胞、超敏反应C蛋白、细胞因子的动态变化；探索hs-CRP和细胞因子等监测指标与致病机理的关系；探索猪链球菌2型致病机理；进行疫苗开发和效果评价；进行抗猪链球菌2型细菌药物的筛选和药品效果评价。

附图说明

图1为应用特异性引物PCR扩增猪链球菌2型基因组DNA的电泳图；1、2：PCR扩增产物；3：DL5000(从下至上依次为100，250，500，750，1000，2000，3000，5000bp)。

图2为猪链球菌2型特异性SYBR GreenI实时荧光定量PCR标准曲线图；A：标准曲线图；B：荧光曲线；C：溶解曲线。

图3为大脑组织病理切片(HE染色，左为40×，右为局部放大)。

图4为肝脏组织病理切片(HE染色，左为20×，右为40×)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所有动物试验按照《中国科学院微生物研究所实验动物规范标准与管理制度》及《不同等级实验动物的饲养管理与实验操作》的要求进行。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买所得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

杜×大×长三元杂交猪(即杜×大×长三元杂交猪即杜洛克猪、大白猪和长白猪的三元杂交猪)：购自北京大兴种猪种禽厂。

猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2，又称猪链球菌血清2型或荚膜2型)：购自中国兽医药品监察所，产品目录号为CVCC1940。

实施例1、猪链球菌2型本动物感染模型的构建

实验动物为7周龄的杜×大×长三元杂交猪仔猪(雄性，体重5.3±0.5kg)。

一、筛选用于建模的实验动物

将实验动物于负压动物房隔离饲养，取血液采用武汉科前动物生物制品有限责任公司“猪链球菌2型ELISA抗体检测盒”进行检测，检测结果为阴性的实验动物用于建模。

二、模型的构建

将步骤一筛选得到的实验动物随机分为2组，每组40头，每头猪分别处理如下：

第一组(实验组)：口腔上颚扁桃体部位喷雾接种1ml浓度为10¹⁰cfu/ml的猪链球菌2型菌液，接种后的动物即为模型动物(猪链球菌2型本动物感染模型)；

第二组(阴性对照组)：口腔上颚扁桃体部位喷洒接种1ml肉汤培养基，接种后的动物为对照动物。

实施例2、猪链球菌2型本动物感染模型的鉴定

分别将实施例1接种后的实验动物(模型动物和对照动物)进行实施例2的各项鉴定。第1天，指的是自接种开始第一个24小时，如果取样检测，为第24小时取样；第2天，指的是自接种开始第二个24小时，如果取样检测，为第24小时取样；第3天，指的是自接种开始第三个24小时，如果取样检测，为第24小时取样；以此类推。

一、临床症状

自接种开始，每天观察实验动物的临床症状。

1、眼观表症

(1)实验组

接种后，实验动物的发病过程按临床症状分为三个阶段：发病初期(第1至2天)、发病明显期(第3至5天)和发病后期(第6至14天)三个部分。

发病初期实验动物均出现如下轻微症状：关节症状、关节肿大、跛行、喜卧等临床症状。

发病明显期实验动物均出现如下典型临床症状：神志不清，目光呆滞，角膜反射消失；皮肤出现红斑；个别实验动物出现典型神经症状后，不久出现呼吸窘迫状而死亡(5头猪死亡)。

发病后期(恢复期)实验动物均具有如下症状：关节肿胀，走路摇晃不稳、震颤等行动障碍症状。

(2)阴性对照组

均无任何感染猪链球菌2型的临床症状。

2、体重变化

每天称量实验动物的体重，以下体重为该组的平均体重。

(1)实验组

接种后体重明显下降，第4-5天体重降至最低点(4.8kg)，然后逐渐缓慢升高，第12天体重(6.2kg)超过接种前体重。

(2)阴性对照组

接种后体重平稳升高，第4-5天体重为6.1kg，第12天体重为7.2kg。

3、体温变化

每天测量实验动物的体温，以下体温为该组的平均体温。

(1)实验组

接种后体温波动较大，第3天升至最高点(41.8℃)，第8-9天体温逐渐恢复至正常(39.4-39.6℃)。

(2)阴性对照组

接种后体温基本平稳，波动不大，维持在正常水平。

二、荧光定量PCR

第7天，将各个实验动物分别进行荧光定量PCR检测，步骤如下：

1、样品DNA的提取

将拭子深入口腔上颚扁桃体处旋转涂抹进行采样(也可以将拭子深入鼻腔旋转几次进行采样)。提取样本的基因组DNA。

2、Realtime PCR检测

(1)猪链球菌2型特异性引物序列

分析Genbank登录SS序列，在SS2保守的CPS2J基因序列区域设计特异引物对(靶序列见序列表的序列3)如下：

SS2-CPS2J-F：5’-GAATACGCAGAGCAAGATGGTAGAAT-3’；

SS2-CPS2J-R：5’-AAGTAGCAAGTAACCCTCCCGACAA-3’。

提取猪链球菌2型的基因组DNA，用上述引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图1。结果表明，上述引物对可以有效检测猪链球菌2型。

(2)标准曲线的制备

分别将不同浓度的猪链球菌2型菌液(10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹CPF/ml)提取基因组DNA，制作Realtime PCR标准曲线(见图2A)，标准曲线函数为：Y＝-2.67×log₁₀X+23.13，Y为到达阈值所需的循环数，X为猪链球菌2型的浓度。Ct值28.56以下判为阳性；28.56-30.00为疑似；30.00以上为阴性。

(3)Realtime PCR检测

按照表1的顺序和用量加入Realtime PCR各反应组分，然后进行Realtime PCR。PCR反应条件：94℃2min；94℃10s，57℃15s，72℃15s，40个循环。

表1Realtime PCR反应体系

2×SYBR Mix(含有4.0mM Mg2+)	25μl
		SS2-CPS2J-F(10pmol/μl)	1μl
SS2-CPS2J-R(10pmol/μl)	1μl
		Taq DNA Polymerase	0.3μl
ddH2O	18.7μl
		步骤1提取的基因组DNA	4μl
总计	50μl

部分实验组样本的荧光曲线见图2B，溶解曲线见图2C。

第一组的35头猪均为阳性。第二组的40头猪均为阴性。

三、病理学检测

第7天，每组随机选取2头实验动物进行剖检。将剖检组织用10％福尔马林固定，石蜡包埋，常规病理组织切片处理后，HE染色，镜检。

实验组的病理学检测结果如下：

鼻：黏膜下层血管淤血、出血，有血栓形成；局部可见黏膜上皮细胞坏死脱落。

气管：黏膜下出血，有大量炎性细胞浸润；上皮细胞变性坏死脱落。

肺：肺泡可见出血、炎性分泌物、淋巴细胞浸润，细支气管周围可见少量淋巴细胞浸润。

脑：软脑膜下血管淤血，有微血栓形成，局部可见胶质细胞嗜神经现象；其中一个样本的脑部组织病理切片见图3。

心肌：心肌纤维间可见出血。

扁桃体：隐窝处黏膜上皮细胞坏死脱落，有浆液性炎性分泌物，淋巴组织局部可见出血。

淋巴结：髓质血管充血、淤血；局部可见淋巴细胞坏死排空现象。

脾脏：红髓和被膜下可见严重出血。

小肠：小肠绒毛断裂，绒毛黏膜上皮细胞坏死脱落，绒毛之间有大量炎性细胞浸润。

肝脏：中央静脉淤血甚至血栓形成；肝窦扩张，水肿，淤血；其中一个样本的肝部组织病理切片见图4。

胰腺：小叶间导管管腔可见脱落的上皮细胞浸润，小叶间静脉淤血。

肾脏：肾小球坏死排空；肾小管间质出血/淤血。

关节：关节处结缔组织可见大量炎性细胞浸润，血管淤血、有血栓形成；血管中有嗜酸性粒细胞。

肌肉：肌纤维呈波浪状，肌纤维间可见出血。

阴性对照组的病理学检测结果如下：各个组织均未发生明显病理变化。

四、各脏器细菌的分离与鉴定

分别于第1、3、5、7、9、11天进行剖检(每次每组随机选取3头实验动物)，采集各个脏器(鼻、气管、肺、扁桃体、淋巴结、心脏、肝脏、脾脏、小肠、肾脏、关节、脑)进行细菌分离培养鉴定，结果见表2。

表2感染猪链球菌2型仔猪各脏器细菌的分布情况

“+”代表细菌培养鉴定的阳性，“-”代表细菌培养鉴定的阴性；

e关节肿胀，跛行；f典型神经症状，震颤、角弓反张、呈划水状；g走路摇晃、不稳，关节肿胀。

实验组：第1天组织脏器中主要在鼻粘膜、气管、扁桃体、淋巴结、关节、心脏和脾脏检测到了猪链球菌2型的存在；第3天和第5天，猪链球菌2型几乎分布于检测的所有组织脏器中；第7天，猪链球菌2型在感染猪体内有减少的趋势，个别猪的个别脏器已经检不出；第9天，猪链球菌2型在感染猪体内进一步减少，气管、心脏、肝脏、脾脏、小肠已经检测不到；第11天，仅在鼻黏膜和扁桃体能稳定的分离到猪链球菌2型。结果表明，接种后第3至5天作为猪链球菌2型本动物感染模型较好。

阴性对照组：在任何时间的任何组织，均未检测到猪链球菌2型。

结果显示：实验组中，第1天至第11天，均可在鼻黏膜和扁桃体检测到猪链球菌2型的存在，推测猪链球菌2型感染后会寄宿在猪的鼻粘膜和扁桃体，与自然条件下猪链球菌2型寄宿于上呼吸道，特别是鼻粘膜和扁桃体的事实相符。

五、血液指标检测

每天采集血液(每次每组随机选取3头实验动物)，分别进行细菌分离培养鉴定、白细胞变化的监测、超敏C反应蛋白变化的监测。

1、细菌分离培养鉴定

实验组血液中猪链球菌2型的计数结果见表3。

表3感染猪链球菌2型仔猪血液中细菌计数结果(自接种时刻开始计时)

时间点	CFU/mL	时间点	CFU/mL
				2.5h	40，220，1840	72h	32000，23400，78000
6h	600，1600，2800	96h	36000，32000，64200
				9h	10080，6600，18000	120h	2900，20000，25000
12h	8200，18000，28600	144h	226，2240，500
				24h	18000，42000，32000	168h	240，568，400
48h	38800，32000，64000	192h	0，0，0

第二列和第四列的每个单元格中的3个数据分别为3个样本的数据，以逗号隔开。

阴性对照组在任何时间均未检测到猪链球菌2型。

2、白细胞变化的监测

阴性对照组：维持在14.48-20.87之间。

实验组：接种后第1天，白细胞即出现上升趋势；最高值出现在第3天(为51.27×10⁹/L)；第4天开始下降，第10天基本恢复至阴性对照组水平。

3、超敏C反应蛋白(hs-CRP)变化的监测

实验组：接种1天后，hs-CRP增高，超出正常值5mg/L的范围；接种后第9天hs-CRP降至正常值5mg/L范围以内。

阴性对照组：维持在正常值5mg/L范围以内。

整体分析显示，感染猪链球菌2型后hs-CRP的变化的程度和敏感度，大于白细胞的变化。

以上鉴定结果表明：实施例1构建的猪链球菌2型本动物感染模型在接种猪链球菌2型7日后，荧光定量PCR可从猪血液中扩增出猪链球菌2型基因，肝脏、脑等部位剖检病理学观察也见到了炎性病变，即猪链球菌2型在动物模型中能够有效实现细菌的体内复制。

Claims (5)

1.一种构建猪链球菌2型本动物感染模型的方法，包括如下步骤：在仔猪的口腔上颚扁桃体部位喷雾接种猪链球菌2型，得到猪链球菌2型本动物感染模型。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述仔猪为杜×大×长三元杂交猪仔猪。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述猪链球菌2型的接种量为10¹⁰cfu。

4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述仔猪为7周龄的雄性仔猪。

5.如权利要求1或至4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将进行所述接种后的仔猪进行实时荧光PCR鉴定的步骤；所述实时荧光PCR鉴定所用的引物对由序列表的序列1所示的DNA和序列表的序列2所示的DNA组成。

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