CN103014144A

CN103014144A - 检测猪链球菌2型的基因芯片的制备及其应用方法

Info

Publication number: CN103014144A
Application number: CN2012100646823A
Authority: CN
Inventors: 李文刚; 刘玲玲; 唐桂芬; 张春霞; 吴凤笋; 程亚楼
Original assignee: ZHENGZHOU HUSBANDRY ENGINEERING HIGHER TRAINING SCHOOL
Current assignee: ZHENGZHOU HUSBANDRY ENGINEERING HIGHER TRAINING SCHOOL
Priority date: 2012-03-13
Filing date: 2012-03-13
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2032-03-13
Also published as: CN103014144B

Abstract

本发明涉及用于检测猪链球菌2型的基因芯片的制备及其应用方法，可有效解决现有检测设备及方法耗时长，投入大的问题，其技术方案是：设计并合成引物和探针，用灭菌水溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪按预先设定好的程序在醛基化基片上接触式点样，制备用于检测猪链球菌2型的基因芯片，其使用方法是，提取待测猪链球菌2型细菌的基因组DNA，采用不对称PCR制备杂交用PCR产物，与制备好的基因芯片杂交，经洗涤与干燥后，将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析结果，本发明操作简便易行，省去了已点样芯片的水化处理和预杂交步骤，杂交只需半小时，大大节省了时间，采用5μm/L的探针浓度就可以达到信号强度，检测成本低，可用于大规模检测。

Description

检测猪链球菌2型的基因芯片的制备及其应用方法

发明领域

本发明涉及生物医学领域，特别是一种用于检测猪链球菌2型的基因芯片的制备及其应用方法。

背景技术

现有的猪链球菌检测方法有微生物学方法、血清学鉴定及PCR检测等。微生物学检测方法是根据细菌的形态、培养特性和生化特性等进行鉴定。链球菌在显微镜下呈圆形或卵圆形，直径小于0.2μm，常成双排列或成链状。革兰氏染色阳性，除D群个别细菌外，均无鞭毛，多数有荚膜。血琼脂平板上可长成直径0.1～1.0mm，灰白色、表面光滑、边缘整齐的小菌落，多数致病菌株具有溶血能力，溶血环的大小和类型因菌株而异。血清学的鉴定方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、协同凝集试验、毛细沉淀或平板凝聚试验, 其中ELISA与协同凝集试验的应用最为广泛。PCR检测方法有很强的特异性和高度的敏感性。

基因芯片作为检测手段，有高灵敏性、高度精确性、高信息量等优点，被应用于多种微生物的检测中，已建立有针对猪病致病菌的基因芯片的检测方法，但需要对已点样的芯片进行水化和预杂交处理，且所需杂交探针的浓度较高，检测成本高。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种用于检测猪链球菌2型的基因芯片的制备及其应用方法，可有效解决现有检测设备及方法耗时长，投入大的问题。

本发明的技术方案是：设计并合成引物和探针，用灭菌水溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪按预先设定好的程序在醛基化基片（公知市售产品）上接触式点样，制备用于检测猪链球菌2型的基因芯片。

本发明还提供了用于检测猪链球菌2型的基因芯片的使用方法，包括以下步骤：提取待测猪链球菌2型细菌的基因组DNA，采用不对称PCR制备杂交用PCR产物，与制备好的基因芯片杂交，经洗涤与干燥后，将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析结果。

本发明操作简便易行，省去了已点样芯片的水化处理和预杂交步骤，杂交只需半小时，大大节省了时间，达到了快速检测的目的，采用5μm/L的探针浓度就可以达到较高的信号强度，降低了检测成本，可用于大规模检测。

附图说明

图1为本发明2型猪链球菌基因芯片点样示意图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明具体实施方式作进一步详细说明。

一种用于检测猪链球菌2型的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）设计引物和探针：以猪链球菌2型（菌株号为S735，GenBank序列号为AF118389）的cps2J基因序列为靶序列，设计特异性引物和探针，上游引物：5’-TGGAATACGCA GAGCAA GAT-3’，下游引物：5’Cy3-AGCAAGTAACCCTCCCGACA-3’，探针：5’NH2-TTTTTTTTTTTTT TTT-ACGG TATCAAAAATAGCACAGCAAA-3’，在下游引物5’端用Cy3进行荧光标记，探针的5’端进行氨基化修饰，修饰氨基和探针之间加上16个T；

（2）对引物和探针进行合成：将步骤（1）所设计的引物和探针，交公司进行合成（这是公知的合成途径）；

（3）基因芯片的制备：用灭菌水溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪按预先设定好的程序在醛基化基片（公知市售产品）上接触式点样，点样完毕后将芯片静置于25-30℃烘箱干燥过夜8-12小时。

一种用于检测猪链球菌2型的基因芯片的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取待测猪链球菌2型细菌的基因组DNA；

（2）杂交用PCR产物的制备：采用不对称PCR，先预混合反应体系中除下游引物以外的所有成份，最后在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增，所述的反应体系为：10×Buffer为2.5μl，上游引物（20μM/L）为0.2μl，下游引物（20μM/L）为0.5μl，dNTP(10mmol/μl)为2.0μl，模板DNA 1.0μl，ExTaq^TM酶为0.3μl，ddH₂O为18.5μl，总体积为25μl ，PCR扩增反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性45，56℃退火45s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10 min；

（3）杂交用PCR产物与权利要求1所述的基因芯片杂交：将杂交用PCR扩增产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即取出冰浴5min，取PCR扩增产物20μl和杂交缓冲液180μl加于离心管中，混匀后取该混合液加到芯片的点样区，尽量避免产生气泡，将芯片放入杂交盒内，置于42℃水浴锅中避光杂交30min；

（4）基因芯片的洗涤与干燥：基因芯片的洗涤应在暗室中完成，杂交完毕的芯片放置在玻片架上，立即用洗液1、洗液2、洗液3各洗涤2min，离心干燥；

（5）基因芯片的结果分析：将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析Cy3荧光信号的强度和比值。

所述的引物浓度为20μm/L。

所述探针浓度为5μm/L —20μm/L。

点样环境参数为相对湿度55-65%，温度15-30℃，各探针点间距为1.5mm，点样阵列根据实验要求设定。

所述的杂交芯片洗涤所用洗液1为1×SSC/0.2%SDS；洗液2为0.1×SSC/0.2%SDS；洗液3为0.1×SSC。

所述的基因芯片杂交结果判定的依据如下：

（1）模板DNA的PCR扩增效果良好；

（2）信号强度中位值≥1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰；

（3）检测基因芯片杂交结果判断时引入样点信号阈值概念SNR，它是信号强度中位值与噪音中位值之比，当它们的比值大于或等于1.5时，表明杂交信号良好，即SNR≥1.5。

经试验证明，此方法灵敏可靠。应用效果好，有关资料如下：

1材料与方法

1.1材料

1.1.1标准菌株来源

猪链球菌2型菌株（S735）由河南农业大学惠赠。

1.1.2芯片材料

基因芯片基片采用醛基化载玻片，购自上海百傲生物科技有限公司。

1.1.3试验仪器

基因芯片点样仪美国Bio-Dot公司

MILIPORE-21JO纯水机美国MILIPORE公司

YEAR2000 PCR仪英国Whatman Biometra公司

DBT-07凝胶成像系统英国UVITEC公司

MLTRA PR080型超高速冷冻离心机德国HermLer公司

TGL-16C台式高速低温离心机德国Eppendorf公司

基因芯片扫描仪法国Innopsys公司

-80℃超低温冰柜 Thermo公司

UVI紫外凝胶成像系统 UVItec ST John^,s innovation centre

YJ-875净化工作台苏州净化设备公司

SHA-C水浴恒温振荡器江苏恒丰仪器厂

DYY-31A型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂

DBT-07凝胶成像系统英国UVITEC公司

PCR扩增仪 Biometra公司

1．1.4主要试剂和溶液

TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 大连宝生物工程有限公司

ExTaq^TM酶、DNA Marker DL2000 大连宝生物工程有限公司

细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）北京索莱宝科技有限公司

Proteinase K, Tritirachium album CALBIOCHEM

BIOWEST AGAROSE SPECIFICATIONS

杂交缓冲液上海百傲生物科技有限公司

LB增菌液（加有5%的小牛血清）、5×电泳储存液（5×TBE）、1.0%琼脂糖凝胶、100×Denhardt、20×SSC、10%SDS、基因芯片点样缓冲液、洗脱液均由本实验室配制，见附件1。

1.2方法

1.2.1细菌的培养

用接种环在无菌条件下取保存的细菌菌株，接种于绵羊血琼脂平板上，37℃培养24小时，挑取血平板上的单个菌落接种于5ml加入5%小牛血清的LB液体培养基中，37℃，180rmp，培养16小时；置于-4℃保存备用。

1.2.2细菌基因组DNA（即模板DNA）的提取及注意事项

1.2.2.1提取细菌基因组DNA的步骤

对上述培养的细菌采用北京索莱宝科技有限公司的细菌基因组DNA提取（离心柱型）试剂盒提取，具体步骤如下：

（1）取细菌培养液1.5ml，12000rmp离心1min，尽量吸尽上清。

（2）向菌体沉淀中加入200ul溶液A，振荡至菌体充分悬浮，或用加样枪缓慢反复吹打数次，加入20ul终浓度为20mg/ml的溶菌酶，加入20ul 10mg/ml的RnaseA,37℃放置15min。

（3）向管中加入20ul 10mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，65℃消化30-60min，期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。消化完全的标志是：液体清亮及粘稠。

（4）向管中加入200ul溶液B,充分混匀。如出现白色沉淀，可放65℃15-30min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的DNA量少及不纯，还有可能导致上柱后堵柱子。

（5）向管中加入200ul无水乙醇，颠倒混匀（此时可能会出现絮状沉淀），不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，静置2min。

（6）12000rmp离心2min，弃掉废液，将吸附柱放入收集管中。

（7）向吸附柱中加入700ul漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇！），12000rmp离心1min，弃掉废液, 将吸附柱放入收集管中。

（8）向吸附柱中加入500ul漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇！），12000rmp离心1min，弃掉废液, 将吸附柱重新放入收集管中。

（9）12000rmp离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。

（10）将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rmp离心2min。

（11）将离心所得洗脱液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rmp离心2min，

即可得到高质量的细菌基因组DNA。

1.2.2.2提取过程中的注意事项

（1）细菌培养液应避免反复冻融，最好用新培养的，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。

（2）若溶液A或溶液B中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，不影响实验结果。

（3）如果菌体沉淀消化不彻底，后imd离心步骤中可能会出现堵柱子的现象，可适当延长离心时间。

（4）洗脱缓冲液的体积最好不少于50ul，体积过小会影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右（可用NaOH将水的pH值调至此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率；回收的DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

1.2.3引物的设计与合成

参照文献，以猪链球菌2型（菌株号为S735，GenBank序列号为AF118389）的cps2J基因序列为靶序列，利用Primer Premier 5．0软件设计特异性引物和探针。上游引物：5’-TGGAATACGCAGAGCAAGAT-3’，下游引物：5’Cy3-AGCAAGTAACCCTCCCGACA-3’；探针：5’NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT-ACGGTATCAAAAATAGCACAGCAAA-3’。在下游引物5’端用Cy3进行荧光标记，探针的5’端进行氨基化修饰，修饰氨基和探针之间加上16个T。引物和探针均由上海生工公司合成。先用灭菌水将合成好的冻干引物稀释成100μM/L的母液, 再稀释为20μM/L 的浓度置于-20℃冻存备用。

1.2.4基因芯片的制备

先用灭菌水将合成好的冻干探针稀释成100um/L的母液，再依次稀释成5um/L（5ul探针+45ul灭菌水+50ul点样缓冲液）、10um/L（10ul探针+40ul灭菌水+50ul点样缓冲液）、20um/L（20ul探针+30ul灭菌水+50ul点样缓冲液）。在96孔U形板的A1孔加入100ul点样缓冲液作空白对照，B1、C1、D1孔分别加入100ul 5um/L、10um/L、20um/L的探针，使用美国Bio-Dot公司的 AD1500基因芯片点样仪按预先设定好的程序在醛基化基片上接触式点样。点样环境参数为相对湿度55-65%，温度15-30℃，各探针点间距为1.5mm，点样阵列根据实验要求设定为四个矩阵，每个矩阵点样为7×3，点样完毕的芯片静置于30℃烘箱干燥过夜备用。芯片点样示意图见图1；

1.2.5杂交用PCR产物的制备与鉴定

对反应条件和参数逐个进行优化，确立最佳浓度和扩增反应条件，杂交用产物需采用不对称PCR。反应总体积为25ul，其组成如下：

10×Buffer 2.5ul

dNTP(10mmol/ul) 2.0ul

上游引物（20μM/L） 0.2ul

下游引物（20μM/L） 0.5ul

模板DNA 1.0ul

ExTaq^TM酶 0.3ul

ddH₂O 18.5ul

Total 25.0ul

试验时先预混合上述反应体系中除下游引物以外的所有成份，最后在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增。

PCR扩增反应条件为：95℃预变性5 min，（95℃变性45s， 56℃退火45s， 72℃延伸1 min，共35个循环） 72℃延伸10 min。

取PCR扩增产物5ul与1ul 6×Lording Buffer，用10ul移液器混合均匀后，将枪头小心深入到加样孔中，注意不要伸到孔底部，以免穿透加样孔而导致样品外溢，缓慢推出使样品垂直落入加样孔中。

加样结束后，盖上电泳槽盖，调节电压为5v/cm(80v)，关闭电泳室灯光，避光电泳20min。待电泳结束后，小心取出凝胶放置于UVI凝胶成像系统中，观察结果并拍照保存。

1.2.6基因芯片的杂交

将PCR扩增产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即取出冰浴5min，取PCR扩增产物20ul和杂交缓冲液180ul加于离心管中，混匀后取该混合液加到芯片的点样区，尽量避免产生气泡，将芯片放入杂交盒内，置于42℃水浴锅中避光杂交30min。

1.2.7基因芯片的洗涤和干燥

芯片的洗涤应在暗室中完成。杂交完毕的芯片放置在玻片架上，立即用洗液1、洗液2、洗液3各洗涤2min，离心干燥后即可用于扫描分析。

1.2.8基因芯片的扫描及扫描结果分析

将芯片置于InnoScan 700A高性能激光共聚焦扫描仪上扫描，如果背景较高可用洗液3（1×SSC）再洗涤一次，以TIF格式保存图像，然后再另存为为JPG格式图片。用MAPIX软件分析Cy3荧光信号的强度和比值，用以下三个条件作为基因芯片杂交结果判定的依据：

（1）模板DNA的PCR扩增效果良好；

（2）信号强度中位值≥1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰(清晰程度和杂交条件有很大关系)；

本发明工艺简单，能对猪链球菌2型进行快速、灵敏的检测，经试验取得了满意的效果，有关试验结果如下：

1、PCR扩增结果

以2型猪链球菌基因组DNA为模板，与其特异性引物进行不对称PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析扩增片段大小约为209bp，与预计目的片段相同，特异性较好。

2.2 基因芯片杂交结果

不对称PCR扩增产物置于PCR仪上95℃变性10min后，立即冰浴5min，取该产物20ul和杂交缓冲液180ul加于离心管中充分混合均匀，将该混合液全部加到芯片点样区，将芯片放入杂交盒内，置于42℃水浴锅避光杂交30min。杂交结果经扫描仪扫描，各杂交斑点的SNR值均大于1.5。

结果表明，采用5μm/L的探针浓度就可以达到较高的信号强度，从而降低了检测成本，可用于大规模检测。

Claims

1.一种用于检测猪链球菌2型的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）设计引物和探针：以猪链球菌2型的cps2J基因序列为靶序列，设计特异性引物和探针，上游引物：5’-TGGAATACGCAGAGCAAGAT-3’，下游引物：5’Cy3-AGCAAGTAACCCTCCCG ACA-3’，探针：5’NH₂-TTTTTTTTTTTTTTTT-ACGGTATCAAAAATAGCACAGCAAA-3’，在下游引物5’端用Cy3进行荧光标记，探针的5’端进行氨基化修饰，修饰氨基和探针之间加上16个T；

（2）按常规方法对引物和探针进行合成；

（3）基因芯片的制备：用灭菌水溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪（按预先设定好的程序）在醛基化基片上接触式点样，点样完毕后将芯片静置于25-30℃烘箱干燥过夜8-12小时。

2.根据权利要求1所述的用于检测猪链球菌2型的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述的引物浓度为20μM/L。

3.根据权利要求1所述的用于检测猪链球菌2型的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述探针浓度为5μM/L —20μM/L。

4.根据权利要求1所述的用于检测猪链球菌2型的基因芯片的制备方法，其特征在于，点样环境参数为相对湿度55-65%，温度15-30℃，各探针点间距为1.5mm，点样阵列根据实验要求设定。

5.一种用于检测猪链球菌2型的基因芯片的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测猪链球菌2型细菌的基因组DNA；

（2）杂交用PCR产物的制备：采用不对称PCR，先预混合反应体系中除下游引物以外的所有成份，最后在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增，所述的反应体系为：10×Buffer为2.5μl，上游引物（20μM/L）为0.2μl，下游引物（20μM/L）为0.5μl，dNTP(10mmol/μl)为2.0μl，模板DNA 1.0μl，ExTaq^TM酶为0.3μl，ddH₂O为18.5μl，PCR扩增反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性45，56℃退火45s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10 min；

（5）基因芯片的结果分析：将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析Cy3荧光信号的强度和比值，基因芯片杂交结果判定的依据如下：模板DNA的PCR扩增效果良好；信号强度中位值≥1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰；检测基因芯片杂交结果判断时引入样点信号阈值概念SNR，它是信号强度中位值与噪音中位值之比，当它们的比值大于或等于1.5时，表明杂交信号良好，即SNR≥1.5。

6.根据权利要求2所述的用于检测猪链球菌2型的基因芯片的使用方法，其特征在于，所述的杂交芯片洗涤所用洗液1为1×SSC和0.2%SDS；洗液2为0.1×SSC和0.2%SDS；洗液3为0.1×SSC。