CN101792819A - 高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高通量可目视化对人乳头瘤病毒(HPV)进行快速分型检测的方法，该方法中使用胶体金标记核酸探针，通过银染来提高金信号，可通过目视直接进行信号判断，无需昂贵的信号检测设备。操作简便，省时，灵敏度高，检测结果稳定，准确性好。解决了目前检测结果不能通过肉眼直接看到，需要通过相应的仪器检测的缺点。该HPV分型检测的基因芯片集成系统，能够对感染HPV病毒亚型进行快速排查，检测对象将涵盖我国常见高发且危害严重的多种HPV亚型。通过对芯片的设计，达到一次试验可检测多个病人的高通量临检要求。该方法可广泛用于临床诊断和女性体检，还可用于宫颈癌、湿疣等疾病的早期筛查，对于HPV的临床诊断和宫颈癌的早期预防有重要的意义。

Description

高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法

技术领域

本发明属于与基因检测相关的领域，涉及一种高通量可目视化对人乳头瘤病毒(HPV)进行快速分型检测的方法，特别涉及一种可通过目视直接进行信号判断而无需昂贵的信号检测设备的经济型诊断方法。

背景技术

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，死亡率仅次于乳腺癌，位于妇女癌症死亡的第二位。我国每年宫颈癌新发病例约13.15万，占世界宫颈癌新发病例总数的28.8％。此外由于条件限制而漏检的疾患则远不止此数。所以，早期发现和治疗是提高宫颈癌患者生存率的关键。目前HPV还不能在体外培养，大多数HPV感染的患者没有显微镜诊断的依据，另外血清学检测也不敏感，多数为阴性。因此检测HPV感染主要依赖DNA序列的分子水平检测及分型(HPV基因组检测)。HPV病毒的各型基因序列与其生物学行为存在着高度相关性，不同基因型的HPV具有不同的致病危险性。HPV DNA的检测和分型对了解相关病情、判断预后及指导治疗具有重要价值，特别是对女性生殖道肿瘤的癌情预报具有重要意义。

基因芯片可以一次性对大量标本进行检测分析，具有通量高、速度快、信息量大、所需样品少、污染少等特点，解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、通量低的缺点。其示踪的探针有酶、荧光、放射性同位素、化学发光物质等，但是这些示踪物质普遍都存在易失活，易污染的缺点。

目前用基因芯片检测人乳头瘤病毒的方法中，其示踪的探针大多是酶、荧光、放射性同位素、化学发光物质等，检测结果不能通过肉眼直接看到，需要通过相应的仪器检测，如荧光检测仪等，这样检测的成本就大大增加，并且造成检测步骤繁琐等缺点。

胶体金作为一种新兴的示踪物具有易保存，无污染的优点，胶体金最早应用于免疫细胞化学方面。随着分子生物学的迅速发展，胶体金标记技术也逐步发展成为研究基因功能的重要手段。近年来，越来越多的科学家选择胶体金来取代上述标记物，美国西北大学的Mirkin等报道了一系列在基因芯片上使用胶体金标记核酸探针，通过银染来提高检测信号，达到更高灵敏度的方法。

目前，尚未有将胶体金标记核酸探针用于检测人乳头瘤病毒的方法中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量可目视化人乳头瘤病毒(HPV)基因芯片快速分型检测方法，其解决了背景技术中人乳头瘤病毒基因芯片检测方法中由于示踪的探针大多是酶、荧光、放射性同位素、化学发光物质等，检测结果不能通过肉眼直接看到，需要通过昂贵的仪器检测，检测成本高的技术问题。

本发明的原理是：确定临床常见的HPV病毒作为检测对象，引用常用的通用引物(GP5，GP6)，此通用引物根据病毒多种不同亚型的保守区域设计，可扩增出短片断(150bp左右)PCR产物。依据每种短片断PCR产物序列，筛选出多条高度特异、长度相同、Tm值和G+C％含量接近的检测探针，同时设计非限制性引物的反义链作为捕获探针，检测探针将固定在醛基化修饰的片基上，制备成低密度30-mer寡核苷酸诊断基因芯片，捕获探针经巯基化修饰后与胶体金链接。对已知或疑似HPV感染样品组织进行处理，通过不对称PCR，获得大量与检测探针和捕获探针序列互补的ssDNA，通过样本与探针的固液相体系杂交，经银染使杂交结果足够放大形成肉眼可见的颜色信号，可通过肉眼观察或扫描仪记录结果，从而实现HPV目视化基因芯片检测与分型。

本发明的技术方案是：

高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法，该方法的实现步骤包括：

(1)制备芯片

(1.1)设计检测探针

根据人乳头瘤病毒的13种亚型设计检测探针，从左至右为5’-3’，探针序列如下：

HPV 6   5’-ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAA-3’

HPV 11  5’-ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAA-3’

HPV 16  5’-GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA-3’

HPV 18  5’-TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA-3’

HPV 31  5’-TGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATAC-3’

HPV 33  5’-TTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTAC-3’

HPV 35  5’-GTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGA-3’

HPV 45  5’-ACACAAAATCCTGTGCCAAGTACAT-3’

HPV 51  5’-AGCACTGCCACTGCTGCGGTTTCCCCAACA-3’

HPV 52  5’-TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAA-3’

HPV 53  5’-TCTATGTCTACATATAATTCAAAGCAAAT-3’

HPV 56  5’-GTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATG-3’

HPV 58  5’-ATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC-3’

检测探针的5’端均采用NH₂-C6修饰；

(1.2)芯片点制

先进行片基表面醛基化修饰处理，然后将检测探针按照设计好的阵列固定在片基上，再进行芯片点样后处理，得寡核苷酸芯片；

(2)待测样本的处理

(2.1)引物的设计合成

设计合成与人乳头瘤病毒病原对应的引物，即通用引物GP5和GP6，序列如下：

GP5---5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3’

GP6---5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3’

(2.2)制备不对称PCR扩增产物

用引物对待检样本进行不对称PCR，生成不对称PCR扩增产物，该产物是与固定在芯片上的检测探针特异性互补的单链DNA产物；

(3)胶体金标记经修饰的捕获探针

(3.1)设计合成捕获探针

以通用引物GP6的互补链作为捕获探针，该探针的序列如下：

5′-GAA TAT GAT TTA CAG TTT ATT TTT CTT TTT TTT TT-3′

在该捕获探针的3′端做SH-C₆修饰；

(3.2)用胶体金标记经SH-C₆修饰的捕获探针；

(4)芯片杂交

取不对称PCR扩增产物和经胶体金标记的捕获探针置于芯片表面，放置杂交盒内进行杂交反应，反应完毕后清洗芯片；

(5)银染显色

取银显影液均匀涂布在芯片杂交区域上，避光反应后，冲洗掉显影液，室温离心甩干后肉眼观察，或用平面扫描仪对玻片进行信号扫描，利用软件进行数据分析。

上述步骤(3.2)捕获探针的胶体金标记，其具体实现方法是：

(3.2.1)将经SH-C₆修饰的捕获探针1OD溶解在1ml双蒸水中，取30ul加入1ml胶体金(浓度约4nm)，室温放置16小时；

(3.2.2)加入500ul 0.3M NaCl，10mM PBS，再放置40小时，离心，弃上清，深红色沉淀用0.1MNaCl，10mM PBS(pH7.0)溶液洗涤，去除未标记的寡核苷酸；

(3.2.3)洗涤后的深红色沉淀经14000rpm离心30min，然后用0.3M NaCl，10mM PBS(pH7.0)1ml重悬，4℃放置备用。

上述步骤(4)芯片杂交的具体实现方法是：将不对称PCR扩增产物，1×杂交液和胶体金标记的捕获探针以1∶8∶1的体积比混合，取混合样品置于芯片表面的杂交盒内52℃杂交45min；取出芯片，立即浸入洗液中清洗，最后常温下将芯片离心甩干；所述杂交液是pH7.0，0.3M的PBS；洗液是pH7.0，1.2M的PBN，PBN成分是0.3M NaNO₃和10mM PBS(pH7.0)。

上述胶体金的粒径为10±2nm，最大吸收峰在520nm。

上述步骤(1.2)芯片点制的具体实现方法是：

(1.2.1)片基处理：用APTES溶液对片基进行处理，再与戊二醛反应，离心甩干经扫描后选取背景均一且背景值较低的醛基化片基，室温干燥保存以备用；

(1.2.2)芯片点样：用生物芯片点样仪将检测探针片段有序地按阵列设计打印在片基上；

(1.2.3)后处理：将点制好的芯片干燥后封闭，封闭方法为：将芯片放入1％BSA中，42℃封闭1h，然后用0.1M的PBS清洗，室温下快速甩干，4℃保存备用。

上述步骤(2.2)待检样本先经过预处理，具体实现方法是：样本用病毒裂解液裂解后煮沸，离心，收集上清，上清液作为待检液。

上述生物芯片点样仪用晶芯smart arrayer 48生物芯片点样仪为宜。

上述病毒裂解液的成分是10mM NaOH，0.45％Tween-20，0.45％Triton-100，调pH至8.0。

本发明具有以下优点：

1、该方法使用胶体金标记核酸探针，通过银染来提高金信号，可通过目视直接进行信号判断，无需昂贵的信号检测设备。

2、HPV分型检测的基因芯片集成系统，能够对感染HPV病毒亚型进行快速排查，检测对象将涵盖我国常见高发且危害严重的多种HPV亚型。通过对芯片的设计，达到一次试验可检测多个病人的高通量临检要求。

3、操作简便，省时。

4、灵敏度高，检测结果稳定，准确性好。

5、该方法可广泛用于临床诊断和女性体检，还可用于宫颈癌、湿疣等疾病的早期筛查，对于HPV的临床诊断和宫颈癌的早期预防有重要的意义。

附图说明

图1为目视化芯片阵列示意图。其中图1(a)为HPV芯片整体图，共设计八个杂交区域可同时检测八个样本；图1(b)为左图单个区域的放大图，区域探针设计为6×5的阵列，其中，A1，A2为空白对照，A3，A4为HPV6探针，A5，A6为HPV11探针，B1，B2为HPV16探针，B3，B4为HPV18探针，B5，B6为HPV31探针，C1，C2为HPV33探针，C3，C4为HPV35探针，C5，C6为HPV45探针，D1，D2为HPV51探针，D3，D4为HPV52探针；D5，D6为HPV53探针，E1，E2为HPV56探针，E3，E4为HPV58探针，E5，E6为阳性质控探针。

图2是HPV 13亚型普通PCR产物鉴定结果图。其中M为DNA Marker(DL2000)；B为阴性对照；Lane1-13依次为：HPV 6，HPV11，HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV45，HPV51，HPV52，HPV53，HPV56，HPV58PCR产物。

图3是引物比例梯度不对称PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。其中M为DNAMarker(DL 2000)；从左至右依次是引物(GP5/GP6)比例为1∶1，1∶10，1∶20，1∶40，1∶60，1∶80，1∶100的不对称PCR产物，产物经12％聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。

图4是单一质粒芯片杂交结果图。图中1号区域为HPV18亚型杂交结果；2号区域为HPV16亚型杂交结果。

图5是混合质粒芯片杂交结果图。图中1，2区域均为HPV16，18亚型混合杂交结果。

图6是临床样本芯片杂交结果图。具体是临床样本1，2，3，4号的PCR杂交结果，从图中可以看出：1号样本为HPV16亚型感染，2号样本为HPV16亚型感染，3号样本为HPV6亚型感染，4号样本为HPV16亚型感染。

图7是临床样本芯片杂交结果图。具体是临床样本5，6，7，8号的芯片杂交结果，从图中可以看出：5号样本没有HPV病毒感染，6号样本为HPV6亚型感染，7号样本为HPV11亚型感染，8号样本为HPV6和11亚型混合感染。

具体实施方式

本发明采用的高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法，实现步骤如下：

本发明制备芯片中的检测探针和芯片点制均可采用公知技术。

(1)制备芯片

(1.1)设计检测探针

根据人乳头瘤病毒的13种亚型设计检测探针，探针序列如下：

HPV 6     ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAA

HPV 11    ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAA

HPV 16    GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA

HPV 18    TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA

HPV 31    TGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATAC

HPV 33    TTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTAC

HPV 35    GTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGA

HPV 45    ACACAAAATCCTGTGCCAAGTACAT

HPV 51    AGCACTGCCACTGCTGCGGTTTCCCCAACA

HPV 52    TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAA

HPV 53    TCTATGTCTACATATAATTCAAAGCAAAT

HPV 56    GTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATG

HPV 58    ATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC

上述序列从左至右为5’-3’，检测探针的5’端均采用NH₂-C6修饰；

(1.2)芯片点制

先进行片基表面修饰处理，然后将检测探针按照设计好的阵列固定在片基上，再进行芯片点样后处理，得寡核苷酸芯片；

片基采用硅烷化玻片，参照实验室醛基化芯片片基制备的标准化操作方案，用APTES溶液对片基进行处理，再与戊二醛反应，离心甩干经扫描后选取背景均一且背景值较低的醛基化片基，室温干燥保存以备用；

用生物芯片点样仪将检测探针片段有序地按阵列设计打印在片基上；将点制好的芯片干燥后封闭，封闭方法为：将醛基化片基放入1％BSA中，42℃封闭1h，然后用0.1M的PBS清洗，室温下快速甩干，4℃保存备用。

生物芯片点样仪可以用晶芯smart arrayer 48生物芯片点样仪。

(2)待测样本的处理

待检样本取已知或疑似病料样品组织，该组织需要先经过预处理，具体实现方法是：样本用病毒裂解液裂解后煮沸，离心，收集上清，上清液作为待检液。病毒裂解液裂是实验室自制，其成分是10mM NaOH，0.45％Tween-20，0.45％Triton-100，pH调至8.0。

(2.1)引物的设计合成

设计合成与人乳头瘤病毒病原对应的引物，即通用引物GP5和GP6，序列如下：

GP5---5’-TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC-3’

GP6---5’-GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C-3’

(2.2)制备不对称PCR扩增产物

用引物对待检样本进行不对称PCR扩增，生成不对称PCR扩增产物，该产物是与寡核苷酸探针特异性互补的单链DNA产物；

(3)胶体金标记经修饰的捕获探针

(3.1)设计合成捕获探针

以通用引物GP6的互补链作为捕获探针，该探针的序列如下：

5′-GAA TAT GAT TTA CAG TTT ATT TTT CTT TTT TTT TT-3′在该捕获探针的3′端做SH-C₆修饰；

(3.2)用胶体金标记经SH-C₆修饰的捕获探针，其具体实现方法是：

(3.2.1)将经SH-C₆修饰的捕获探针溶解在双蒸水中，再加入胶体金，室温放置16小时；

(3.2.2)加入PBS，再放置40小时，离心，弃上清，深红色沉淀用PBS溶液洗涤，去除未标记的寡核苷酸；

(3.2.3)洗涤后的深红色沉淀经离心后，用PBS重悬，4℃放置备用。

上述胶体金的粒径为10±2nm，最大吸收峰在520nm处。胶体金可以是自制的也可以购买商品化的产品。

自制粒径为10±2nm的胶体金的方法是：

1)取250ml三角瓶，加入79ml双蒸水和1ml 1％氯化金，预热至60～70℃；

2)取50ml烧杯，加入4ml 1％柠檬酸钠，0.7ml 1％单宁酸，0.2ml 0.1MK₂CO₃，混合后加双蒸水至20ml预热至60～70℃。

3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温10分钟，自然冷却，制得胶体金。

4)制备的胶体金用透射电镜扫描，可知粒径在10±2nm且分散均匀。

(4)芯片杂交

将不对称PCR扩增产物和经胶体金标记的捕获探针置于芯片表面的杂交盒内进行杂交反应，反应完毕后清洗；

芯片杂交的具体实现方法是：将不对称PCR扩增产物，1×杂交液和胶体金标记的捕获探针以1∶8∶1的体积比混合，取混合样品置于芯片表面的杂交盒内60℃杂交60min；取出芯片，立即浸入洗液中清洗，最后常温下将芯片离心甩干；所述杂交液是pH7.0，0.3M PBS；洗液是pH7.0，1.2M的PBN。

(5)银染显色

将银显影液均匀涂布在芯片杂交区域上，避光反应后，冲洗掉显影液，室温离心甩干后肉眼观察，或用平面扫描仪对玻片进行信号扫描，利用软件进行数据分析。

验证试验：

以HPV6，11，16，18，31，33，35，45，51，52，53，56，58这13种质粒为病毒模板，用本发明的方法来验证试验分型检测结果可通过目视直接进行信号判断。

该实验使用的材料是：

病毒模板：实验室拥有HPV6，11，16，18，31，33，35，45，51，52，53，56，58；13种质粒。除HPV58型质粒的宿主细胞为JM109外，其余10型的宿主细胞均为DH5α。

主要试剂：Taq DNA polymerse、dNTP均购自天根公司；DNA MarkerDL2000均购自大连宝生物(TaKaRa)公司；BSA购自Invitrogen公司；3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)购自Sigama公司，芯片玻片片基购自美国Goldseal公司；封闭液(PBS缓冲溶液、BSA溶液、0.3M氯化钠溶液)均为本实验室自配。

主要仪器：Eppendorf 5415D微量高速离心机、Eppendorf 5804R高速冷冻离心机、Mastercycler gradient基因扩增仪购自德国Eppendorf公司；生物芯片点样仪-

smart arrayer 48购自北京博奥生物芯片有限公司；基因芯片扫描仪Genepix 4000B购自美国Axon公司；紫外分光光度仪8453购自Agilent公司；UVP G800凝胶成像系统、杂交箱HL-2000均购自美国UVP公司。

方法：

检测探针由上海生工生物技术有限责任公司合成，序列如下：

HPV 6     ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAA

HPV 11    ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAA

HPV 16    GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA

HPV 18    TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA

HPV 31    TGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATAC

HPV 33    TTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTAC

HPV 35    GTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGA

HPV 45    ACACAAAATCCTGTGCCAAGTACAT

HPV 51    AGCACTGCCACTGCTGCGGTTTCCCCAACA

HPV 52    TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAA

HPV 53    TCTATGTCTACATATAATTCAAAGCAAAT

HPV 56    GTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATG

HPV 58    ATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC

上述探针从左至右为5’-3’，5’端均采用NH₂-C6修饰。

参照实验室醛基化芯片片基制备的标准化操作方案，用APTES溶液对Goldseal硅烷化玻片进行处理，然后与戊二醛反应，离心甩干经扫描后选取背景均一且背景值较低的醛基化片基，室温干燥保存以备用。

HPV芯片设计为6×5的阵列(见图1)，每个探针横向重复打印2个点。阵列中的A1，A2位点为空白对照(1×点样缓冲液)，E5，E6为病毒检测的阳性质控探针(根据人β-球蛋白基因设计，序列为5’-CACAACTGTGTTCACTAGC-3’)，起监视体系的作用，其他点分别代表待检测病毒基因的检测探针，从左到右依次为HPV6，11，16，18，31，33，35，45，51，52，53，56，58亚型探针。

用晶芯smart arrayer 48生物芯片点样仪将探针片段有序地按阵列设计打印。将点制好的芯片120℃干烤2h后，进行封闭，用以封闭芯片上活跃的基团从而杂交时减少非特异性杂交。封闭方法为：将醛基化玻片放入1％BSA中，42℃封闭1h，然后用0.1M的PBS清洗2次，室温下600rpm 10min快速甩干，随机抽取3张进行扫描检验封闭效果，之后4℃保存备用。

引物采用通用引物：

GP5---5’-TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC-3’

GP6---5’-GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C-3’

同时设计GP6的反义链P1作为和胶体金连接的探针，即捕获探针。

P1---5′-GAA TAT GAT TTA CAG TTT ATT TTT CTT TTT TTT TT-3′

为了能与胶体金连接在P1的3′端作SH-C₆修饰。

单链DNA片段的制备

(1)普通PCR验证

普通PCR扩增的反应体系为25ul，含有5ul 10×PCR buffer，2ul 2.5mmol/LdNTP，2ul模板，20umol/L的GP5、GP6各0.625ul，0.5ulTaqDNA聚合酶(3U/ul)，加ddH₂O至终体积25ul。PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，43℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。收集PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳观察结果，如图2所示，从电泳结果可知各亚型扩增产物大小正确，符合所用这对通用引物之间的DNA片断长度150bp，无非特异性条带出现，同时设立的阴性对照未扩增出任何条带，证明反应体系无污染。

(2)不对称PCR引物比例的优化

经过对上述引物不对称梯度实验后，我们选择1∶20作为后期实验的引物比例。PCR体系为：Virus模板(50ng/ul)2ul、10χreaction buffer 5ul、dNTP每种浓度为2.5mM(dATP 0.5ul、dGTP 0.5ul、dCTP 0.5ul、dTTP 0.3ul)、Primer：sense

primer(1uM)0.625ul、anti-sense(20uM)0.625ul，两者比例为1∶20，Tag DNApolymerse(3U/L)0.5ul，无菌水补至25ul。不对称PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，43℃30s，72℃30s，40个循环；72℃5min。以HPV 16亚型为例，上下游引物(GP5/GP6)比例依次为1∶1，1∶10，1∶20，1∶40，1∶60，1∶80，1∶100做不对称PCR，产物用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定结果如图3所示，从图中可以看出随着上下游引物比例的降低，单链产物和双链产物都在减少。在1∶10，1∶20时单链产物最多，因此后期选择1∶20作为不对称PCR的引物比例。

胶体金标记探针的制备

胶体金的制备

胶体金是按以下步骤制备的：

(1)取250ml三角瓶，加入79ml双蒸水和1ml 1％氯化金，预热至60～70℃；

(2)取50ml烧杯，加入4ml 1％柠檬酸钠，0.7ml 1％单宁酸，0.2ml 0.1MK₂CO₃，混合后加双蒸水至20ml预热至60～70℃。

(3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温10分钟，自然冷却，制得胶体金。

探针的胶体金标记

(1)将巯基探针1OD溶解在200ul双蒸水中，再取30ul加入到1ml胶体金中，室温放置16小时；

(2)加入500ul 0.3M PBS，再放置40小时，随后18000rpm离心45min，弃上清，深红色沉淀用0.1M PBS溶液洗涤，去除未标记的寡核苷酸；

(3)18000rpm离心30min，后用0.3M PBS重悬。4℃放置备用。

芯片杂交

(1)杂交

将不对称PCR样品，1×杂交液(0.3M PBS，pH 7.0)和胶体金标记的捕获探针以1∶8∶1的体积比混合。取混合样品至芯片表面，置于杂交盒内52℃杂交。杂交时间45min

(2)芯片清洗

取出芯片，立即浸入洗液I(0.3M PBN，pH 7.0)中清洗2次，每次2min，常温下将芯片离心甩干。

(3)银染显色

将银显影液均匀涂布在芯片杂交区域上，避光反应10min，冲洗掉显影液，室温离心甩干用平面扫描仪对玻片进行信号扫描，利用软件进行数据分析。

单一质粒芯片杂交结果：

取HPV16，18亚型质粒的不对称PCR产物与胶体金标记探针反应后，分别与芯片进行杂交，反应完清洗后用银染液染色。结果如图4所示，芯片1号区域18亚型探针处显示特异性阳性信号，其它位点无非特异性杂交；芯片2号区域16亚型探针处显示特异性阳性信号，其它位点无非特异性杂交。

混合质粒芯片杂交结果：

将HPV16，18亚型质粒的不对称PCR产物等量混合，加入胶体金标记探针然后与芯片杂交，清洗银染后检测。结果如图5所示，芯片1，2区域16和18亚型探针处显示有特异性阳性信号，其它位点无非特异性杂交。

通过上述验证试验可知：本发明涉及的方法可快速、特异地对HPV进行检测与分型，该方法适用于临床检测。

临床样本检测试验：

样本由陕西省人民医院提供的女性宫颈糜烂分泌物，用本发明的方法对该临床样本进行分型检测。

(1)女性宫颈糜烂分泌物的处理方法：

将分泌物的洗脱液12000g离心10min，弃去上清液，保留管底的细胞块。向管中加入50-100ul裂解液，振荡悬浮沉淀，煮沸5-10min，13000g离心10min，保留上清液做模板用。

(2)不对称PCR

取(1)中上清液，做不对称PCR，扩增体系为：模板2ul，10×reactionbuffer(Mg²⁺free)2.5μL，MgCl₂溶液2.5μL，dNTP四种组分浓度均为2.5mM(dATP 0.5μL、dGTP 0.5μL、dCTP 0.5μL、dTTP 0.5μL)，GP5(1uM)0.625ul，GP6(20uM)0.625ul，(上下游引物比例为1∶20)，Tag DNA polymerse(3U/L)0.5ul，无菌水补至25ul。循环为条件：95℃5min；95℃30s，43℃30s，72℃30s，40个循环；72℃5min。

(3)芯片杂交

将不对称PCR扩增产物和经胶体金标记的捕获探针置于芯片表面的杂交盒内进行杂交反应，反应完毕后清洗；

芯片杂交的具体实现方法是：将不对称PCR扩增产物，1×杂交液和胶体金标记的捕获探针以1∶8∶1的体积比混合，取混合样品置于芯片表面的杂交盒内52℃杂交45min；取出芯片，立即浸入洗液中清洗，最后常温下将芯片离心甩干；所述杂交液是pH 7.0，0.3M的PBS；洗液是pH 7.0，0.3M的PBN。

(4)银染显色

将银显影液均匀涂布在芯片杂交区域上，避光反应10min后，冲洗掉显影液，室温离心甩干后肉眼观察，用平面扫描仪对玻片进行信号扫描，PCR产物芯片杂交结果如图6和图7所示。图6是临床样本1，2，3，4号的PCR杂交结果，从图中可以看出：1号样本为HPV16亚型感染，2号样本为HPV16亚型感染，3号样本为HPV6亚型感染，4号样本为HPV16亚型感染。

图7是临床样本5，6，7，8号的芯片杂交结果，从图中可以看出：5号样本为HPV6和11亚型混合感染，6号样本为HPV11亚型感染，7号样本为HPV6亚型感染，8号样本没有HPV病毒感染。

Claims (8)

1.高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法，其特征在于：该方法的实现步骤包括：

(1)制备芯片

(1.1)设计检测探针

根据人乳头瘤病毒的13种亚型设计检测探针，从左至右为5’-3’，探针序列如下：

HPV 6     5’-ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAA-3’

HPV 11    5’-ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAA-3’

HPV 16    5’-GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA-3’

HPV 18    5’-TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA-3’

HPV 31    5’-TGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATAC-3’

HPV 33    5’-TTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTAC-3’

HPV 35    5’-GTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGA-3’

HPV 45    5’-ACACAAAATCCTGTGCCAAGTACAT-3’

HPV 51    5’-AGCACTGCCACTGCTGCGGTTTCCCCAACA-3’

HPV 52    5’-TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAA-3’

HPV 53    5’-TCTATGTCTACATATAATTCAAAGCAAAT-3’

HPV 56    5’-GTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATG-3’

HPV 58    5’-ATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC-3’

检测探针的5’端均采用NH₂-C6修饰；

(1.2)芯片点制

先进行片基表面醛基化修饰处理，然后将检测探针按照设计好的阵列固定在片基上，再进行芯片点样后处理，得寡核苷酸芯片；

(2)待检测样本的处理

(2.1)引物的选用

选用人乳头瘤病毒病原对应的引物，即通用引物GP5和GP6，序列如下：

GP5---5’-TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC-3’

GP6---5’-GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C-3’

(2.2)制备不对称PCR扩增产物

用引物对待检样本进行不对称PCR，生成不对称PCR扩增产物，该产物是与固定在芯片上的检测探针特异性互补的单链DNA产物；

(3)胶体金标记经修饰的捕获探针

(3.1)设计合成捕获探针

以通用引物GP6的互补链作为捕获探针，该探针的序列如下：

5′-GAA TAT GAT TTA CAG TTT ATT TTT CTT TTT TTT TT-3′

在该捕获探针的3′端做SH-C₆修饰；

(3.2)用胶体金标记经SH-C₆修饰的捕获探针；

(4)芯片杂交

取不对称PCR扩增产物和经胶体金标记的捕获探针置于芯片表面，放置杂交盒内进行杂交反应，反应完毕后清洗芯片；

(5)银染显色

取银显影液均匀涂布在芯片杂交区域上，避光反应后，去除多余的显影液，室温离心甩干后肉眼观察，或用平面扫描仪对玻片进行信号扫描，利用软件进行数据分析。

2.根据权利要求1所述的高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法，其特征在于：(3.2)捕获探针的胶体金标记，其具体实现方法是：

(3.2.1)将经SH-C₆修饰的捕获探针1OD溶解在1ml双蒸水中，取30ul加入1ml胶体金，使浓度为4nm，室温放置16小时；

(3.2.2)加入500ul 0.3M NaCl，10mM PBS，再放置40小时，离心，弃上清，深红色沉淀用0.1M NaCl和pH7.0，10mM的PBS溶液洗涤，去除未标记的寡核苷酸；

(3.2.3)洗涤后的深红色沉淀经14000rpm离心30min，然后用0.3M NaCl和pH 7.0，10mM的PBS 1ml重悬，4℃放置备用。

3.根据权利要求1所述的高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法，其特征在于：步骤(4)芯片杂交的具体实现方法是：将不对称PCR扩增产物，杂交液和胶体金标记的捕获探针以1∶8∶1的体积比混合，取混合样品加在芯片表面置杂交盒内52℃杂交45min；取出芯片，立即浸入洗液中清洗，最后常温下将芯片离心甩干；所述杂交液是pH7.0，0.3M的PBS；洗液是pH7.0，1.2M的PBN，PBN成分是0.3M NaNO₃和pH7.0，10mM的PBS。

4.根据权利要求1或2或3所述的高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法，其特征在于：所述胶体金的粒径为10±2nm，最大吸收峰在520nm处。

5.根据权利要求1所述的高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法，其特征在于：(1.2)芯片点制的具体实现方法是：

(1.2.1)片基处理：用APTES溶液对片基进行处理，再与戊二醛反应，离心甩干经扫描后选取背景均一且背景值较低的醛基化片基，室温干燥保存备用；

(1.2.2)芯片点样：用生物芯片点样仪将检测探针片段有序地按阵列设计打印在片基上；

(1.2.3)后处理：将点制好的芯片干燥后封闭，封闭方法为：将芯片放入1％BSA中，42℃封闭1h，然后用0.1M的PBS清洗，室温下快速甩干，4℃保存备用。

6.根据权利要求1所述的高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法，其特征在于：(2.2)待检测样本先经过预处理，具体实现方法是：样本用病毒裂解液裂解后煮沸，离心，收集上清，上清液作为待检液。

7.根据权利要求5所述的高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法，其特征在于：所述生物芯片点样仪是晶芯smart arrayer 48生物芯片点样仪。

8.根据权利要求6所述的高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法，其特征在于：病毒裂解液的成分是10mM NaOH，0.45％Tween-20，0.45％Triton-100，调pH至8.0。

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