CN102181550B - 一种检测多种病原微生物的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种检测多种病原微生物的方法和试剂盒。本发明所述检测多种病原微生物的方法，以蛋白作为桥梁将各靶基因特异探针固定在固体支持物上，可以扩大固相支持物表面和探针之间的距离，增加探针固定的面积，减少杂交的空间位阻，从而同时固定多条探针。固定有各靶基因特异探针的固体支持物与带有生物素标记的待测样品DNA杂交，然后利用亲和素介导的酶底物信号放大系统检测信号，每一个样品可以一次同时进行多种病原微生物的检测，样品需求量小，是一种简单、快捷，灵敏度高，易于推广的疾病筛查方法。本发明所述试剂盒成本低、适用范围广，可满足于疾病的临床诊断和大规模筛查。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种检测多种病原微生物的方法和试剂盒。
背景技术
人类乳头瘤病毒、艾滋病毒、丙型肝炎病毒、E-B病毒、登革热病毒、结核分支杆菌和疟原虫等许多病原微生物往往具有多种不同的基因型，易造成多重感染，引起不同的病变。有些病原微生物根据基因型的不同，其致病性也不同，可以分为高危型和低危型。如人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)，属乳头多瘤空泡病毒科乳头瘤病毒属，是一类感染人类皮肤粘膜上皮细胞DNA病毒，易感染人类表皮和粘膜鳞状上皮，引起人全身各部位的皮肤或者粘膜鳞状上皮增生性病变，例如皮肤寻常疣，扁平疣，外生殖器的尖锐湿疣等等。根据HPV的同源性，目前已发现120多种亚型，其中有42种亚型涉及人类的泌尿生殖道感染，引起泌尿生殖道皮肤粘膜发生良性的尖锐湿疣或感染部位发生癌变，根据致癌性的高低分为高危型HPV和低危型HPV。高危型HPV被认为与宫颈癌和宫颈上皮内瘤病变有关，低危型HPV被认为与外生殖器尖锐湿疣等良性病变有关。此外，感染不同基因型病原体的患者对临床治疗的药物反应不一致，如丙型病毒性肝炎的研究发现，在对干扰素的应答中，HCV-1型病毒最不敏感，治疗时间要长于其它基因型。因此，对感染人类的各种疾病的基因型进行检测具有重要意义。
目前针对具有多种不同基因型的疾病多采用基因芯片技术进行基因型检测。基因芯片技术是将病原体不同基因型特异的寡核苷酸或cDNA作为探针固定于固相支持物上，借助碱基互补，与经PCR或RTPCR扩增、分别以Cy3、Cy5标记的样本靶分子进行杂交，经激光共聚焦扫描仪检出杂交信号强度，通过计算机分析获得信息，检测病原体多种基因型，并对病原体进行分型。
然而一些疾病并不需要对病原体进行分型检测，如HPV检测。研究发现宫颈癌的发生与HPV的持续感染密切相关，90％宫颈癌病变或者癌前病变组织都可以检测到HPV。全世界学者们经过近20年的大量研究，探明HPV持续感染是宫颈癌的直接病因，其中高危型HPV与宫颈癌密切相关。高危型HPV检测作为细胞学和病理学的辅助诊断方法，可以在细胞学异常出现之前就可确认发生宫颈癌的高发人群，并且确证细胞学和组织病理学的检测结果，为临床的诊断和治疗提供可靠的依据。然而无论是单型HPV的持续感染还是多型HPV的持续感染都有发展为宫颈癌的可能，并且至今没有针对HPV亚型的特效药，具体分型对临床的诊断及处理没有太大的临床意义。
此外，采用基因芯片技术检测，不同基因型特异的寡核苷酸探针固定在固体支持物不同位置上，检测时，待测样品需要分别与各基因型探针结合，样品需求量大，耗时费力，不适用于临床诊断和大规模筛查工作。因此，提供一种样品需求小的检测多种病原微生物的方法具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是针对现有方法的缺陷，提供一种样品需求量小的检测多种病原微生物的方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测多种病原微生物的方法，包括
步骤1、蛋白与固体支持物共价结合固定在固体支持物上，然后末端修饰活性有机基团的各靶基因特异探针通过交联剂与蛋白共价结合固定在固体支持物上，得到固定有各靶基因特异探针的固体支持物；
步骤2、提取待测样品DNA，用末端带有生物素标记的各靶基因引物扩增待测样品DNA，然后与固定有各靶基因特异探针的固体支持物杂交，亲和素介导的酶底物信号放大系统检测样品DNA。
优选的，所述蛋白为牛血清白蛋白。
优选的，所述交联剂为戊二醛或1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚(EDC)。
在具体实施方案中，本发明所述各靶基因为人乳头瘤病毒各高危基因，因此，本发明还提供了提供一种检测人乳头瘤病毒各高危基因的方法，包括：
步骤1、蛋白与固体支持物共价结合固定在固体支持物上，然后末端修饰活性有机基团的人乳头瘤病毒各高危基因特异探针通过交联剂与蛋白共价结合固定在固体支持物上，得到固定有人乳头瘤病毒各高危基因特异探针的固体支持物；
步骤2、提取待测样品DNA，用末端带有生物素标记的各靶基因引物扩增待测样品DNA，然后与固定有人乳头瘤病毒各高危基因特异探针的固体支持物杂交，亲和素介导的酶底物信号放大系统检测样品DNA。
优选的，所述人乳头瘤病毒各高危基因特异探针序列包括：
(1)识别高危型HPV16的序列：SEQ ID NO：1所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，
(2)识别高危型HPV18的序列：SEQ ID NO：3所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，
(3)识别高危型HPV31的序列：SEQ ID NO：5所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，
(4)识别高危型HPV33的序列：SEQ ID NO：7所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列，
(5)识别高危型HPV35的序列：SEQ ID NO：9所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：10所示核苷酸序列，
(6)识别高危型HPV39的序列：SEQ ID NO：11所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：12所示核苷酸序列，
(7)识别高危型HPV45的序列：SEQ ID NO：13所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：14所示核苷酸序列，
(8)识别高危型HPV51的序列：SEQ ID NO：15所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：16所示核苷酸序列，
(9)识别高危型HPV52的序列：SEQ ID NO：17所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：18所示核苷酸序列，
(10)识别高危型HPV56的序列：SEQ ID NO：19所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：20所示核苷酸序列，
(11)识别高危型HPV58的序列：SEQ ID NO：21所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：22所示核苷酸序列，
(12)识别高危型HPV59的序列：SEQ ID NO：23所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：24所示核苷酸序列，
(13)识别高危型HPV68的序列：SEQ ID NO：25所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：26所示核苷酸序列。
优选的，所述人乳头瘤病毒各高危基因特异探针还包括连接在探针序列末端的oligo dT或poly A。
优选的，所述扩增人乳头瘤病毒各高危基因引物包括SEQ ID NOs：27～31所示核苷酸序列的5条上游引物和具有SEQ ID NOs：32～35所示核苷酸序列的4条下游引物。
本发明还提供了一种检测多种病原微生物的试剂盒，包括固定有各靶基因特异探针的固体支持物。
本发明还提供了一种检测人乳头瘤病毒各高危基因的试剂盒，包括固定有人乳头瘤病毒各高危基因特异探针的固体支持物。
优选的，所述检测人乳头瘤病毒各高危基因的试剂盒所述人乳头瘤病毒各高危基因特异探针序列包括：
(1)识别高危型HPV16的序列：SEQ ID NO：1所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，
(2)识别高危型HPV18的序列：SEQ ID NO：3所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，
(3)识别高危型HPV31的序列：SEQ ID NO：5所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，
(4)识别高危型HPV33的序列：SEQ ID NO：7所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列，
(5)识别高危型HPV35的序列：SEQ ID NO：9所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：10所示核苷酸序列，
(6)识别高危型HPV39的序列：SEQ ID NO：11所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：12所示核苷酸序列，
(7)识别高危型HPV45的序列：SEQ ID NO：13所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：14所示核苷酸序列，
(8)识别高危型HPV51的序列：SEQ ID NO：15所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：16所示核苷酸序列，
(9)识别高危型HPV52的序列：SEQ ID NO：17所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：18所示核苷酸序列，
(10)识别高危型HPV56的序列：SEQ ID NO：19所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：20所示核苷酸序列，
(11)识别高危型HPV58的序列：SEQ ID NO：21所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：22所示核苷酸序列，
(12)识别高危型HPV59的序列：SEQ ID NO：23所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：24所示核苷酸序列，
(13)识别高危型HPV68的序列：SEQ ID NO：25所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：26所示核苷酸序列。
优选的，所述检测人乳头瘤病毒各高危基因的试剂盒还包括末端带有生物素标记的人乳头瘤病毒各高危基因引物。
优选的，所述检测人乳头瘤病毒各高危基因的试剂盒所述人乳头瘤病毒各高危基因引物包括SEQ ID NOs：27～31所示核苷酸序列的5条上游引物和具有SEQ ID NOs：32～35所示核苷酸序列的4条下游引物。
本发明所述检测多种病原微生物的方法，以蛋白作为桥梁将各靶基因特异探针固定在固体支持物上，利用蛋白作为固体支持物与探针杂交的桥梁，可以扩大固相支持物表面和探针之间的距离，增加探针固定的面积，减少杂交的空间位阻，从而同时固定多条探针，固定有各靶基因特异探针的固体支持物与足量的带有生物素标记的待测样品DNA杂交，然后利用亲和素介导的酶底物信号放大系统检测信号，每一个样品可以一次同时进行多种病原微生物检测，样品需求量小，是一种简单、快捷，灵敏度高，易于推广的疾病筛查方法。本发明所述试剂盒成本低、适用范围广，可满足于疾病的临床诊断和大规模筛查。
附图说明
图1示实施例5采用SEQ ID NOs：27～31所示核苷酸序列的5条上游引物和SEQ ID NOs：32～35所示核苷酸序列的4条下游引物扩增13种高危型HPV的凝胶电泳图，图中160bp左右片段为扩增产物，75bp左右片段为引物二聚体，数字表示HPV亚型，从左至右每个泳道分别为HPV68，59，58，56，52，51，45，39，35，33，31，18，16，16和空白对照。
图2示实施例6检测人乳头瘤病毒29种不同亚型HPV的结果图。图中从左至右检测的HPV亚型分别为：HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，6，11，26，40，42，43，44，53，54，55，57，66，69，73，82。图中结果显示检测的前13个HPV高危基因型为阳性，信号强度远高于其它HPV亚型。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种多种病原微生物的方法和试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法和试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和试剂盒进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测多种病原微生物的方法，包括
步骤1、蛋白与固体支持物共价结合固定在固体支持物上，然后末端修饰活性有机基团的各靶基因特异探针通过交联剂与蛋白共价结合固定在固体支持物上，得到固定有各靶基因特异探针的固体支持物；
步骤2、提取待测样品DNA，用末端带有生物素标记的各靶基因引物扩增待测样品DNA，然后与固定有各靶基因特异探针的固体支持物杂交，亲和素介导的酶底物信号放大系统检测样品DNA。
本发明所述检测方法以蛋白作为桥梁将多种病原微生物靶基因特异探针固定在固体支持物上，利用蛋白作为固体支持物与探针杂交的桥梁，扩大固相支持物表面和探针之间的距离，增加探针固定的面积，减少杂交的空间位阻，从而同时固定多条探针，同时检测多种病原微生物，减少待测样品使用量。
蛋白与固体支持物共价结合具有多种方式，优选为，可以通过不同的化学方法，使氨基、醛基、巯基或环氧基等活性有机基团附着在固体支持物表面，蛋白通过与固体支持物表面的有机活性基团发生共价反应而与固体支持物结合。其中，本发明所述蛋白优选为牛血清白蛋白。
交联剂是指一类分子两端各有一个相同或者不同的活性基团，可与其他分子上的氨基、巯基、羟基等发生共价结合而产生交联作用的试剂。本发明各高危基因型特异探针通过交联剂与固定到固体支持物上的蛋白共价结合。在具体实施方式中所述各高危基因型特异探针在其末端进行氨基化、醛基化、巯基化等修饰，然后再利用交联剂与固定在固体支持物上的蛋白发生共价反应结合到固体支持物上。常用的交联剂有戊二醛、1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚(EDC)、乙酸酐、二缩水甘油基乙醚、辛二亚氨酸甲酯等。优选的，本发明所述交联剂为戊二醛或1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚(EDC)。
本发明所述固体支持物为本领域人员熟知的杂交反应的支持物，作为优选，所述固体支持物为玻片或有机聚合物，本发明不做限定。在具体实施方案中为96微孔板。所述探针是一小段单链DNA、RNA或寡核苷酸片段，用于检测与其互补的核酸序列。
本发明所述检测方法取提取待测样品DNA，用末端带有生物素标记的各靶基因引物扩增待测样品DNA，然后与固定有各靶基因特异探针的固体支持物杂交，亲和素介导的酶底物信号放大系统检测样品DNA。与固定有各高危基因型特异探针固体支持物杂交，亲和素介导的酶底物信号放大系统检测样品DNA。待测样品DNA中的各靶基因序列被固体支持物上的各高危基因型特异探针捕获，利用生物素与亲和素的相互作用形成稳定的配位键，使酶通过亲和素与扩增产物结合，最后通过与酶底物反应显色检测待测样品DNA。
高危型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68，共13个亚型，被认为与宫颈癌和宫颈上皮内瘤病变密切相关。高危型HPV检测作为细胞学和病理学的辅助诊断方法，可以在细胞学异常出现之前就可确认发生宫颈癌的高发人群，并且确证细胞学和组织病理学的检测结果，为临床的诊断和治疗提供可靠的依据。
在具体实施方案中，所述各靶基因为人乳头瘤病毒各高危基因，即提供一种检测人乳头瘤病毒各高危基因的方法，包括：
步骤1、蛋白与固体支持物共价结合固定在固体支持物上，然后末端修饰活性有机基团的人乳头瘤病毒各高危基因特异探针通过交联剂与蛋白共价结合固定在固体支持物上，得到固定有人乳头瘤病毒各高危基因特异探针的固体支持物；
步骤2、提取待测样品DNA，用末端带有生物素标记的各靶基因引物扩增待测样品DNA，然后与固定有人乳头瘤病毒各高危基因特异探针的固体支持物杂交，亲和素介导的酶底物信号放大系统检测样品DNA。
本发明所述检测人乳头瘤病毒各高危基因的方法以蛋白作为桥梁将人乳头瘤病毒各高危基因特异探针固定在固体支持物上，利用蛋白作为固体支持物与探针杂交的桥梁，扩大固相支持物表面和探针之间的距离，增加探针固定的面积，减少杂交的空间位阻，从而将人乳头瘤病毒各高危基因特异探针同时固定在固体支持物上，同时检测人乳头瘤病毒各高危基因。
本发明所述人乳头瘤病毒各高危基因特异探针包括特异性识别各高危型HPVDNA的探针序列，即针对13种高危型HPV多态性非保守区设计的特异性识别各高危型HPVDNA的核苷酸序列，以提高检测的准确性，避免漏检。固定在固体支持物上的各基因探针越特异，检测的准确性越高。
优选的，本发明所述检测人乳头瘤病毒各高危基因的方法所述人乳头瘤病毒各高危基因特异探针序列包括：
(1)识别高危型HPV16的序列：SEQ ID NO：1所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，
(2)识别高危型HPV18的序列：SEQ ID NO：3所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，
(3)识别高危型HPV31的序列：SEQ ID NO：5所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，
(4)识别高危型HPV33的序列：SEQ ID NO：7所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列，
(5)识别高危型HPV35的序列：SEQ ID NO：9所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：10所示核苷酸序列，
(6)识别高危型HPV39的序列：SEQ ID NO：11所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：12所示核苷酸序列，
(7)识别高危型HPV45的序列：SEQ ID NO：13所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：14所示核苷酸序列，
(8)识别高危型HPV51的序列：SEQ ID NO：15所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：16所示核苷酸序列，
(9)识别高危型HPV52的序列：SEQ ID NO：17所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：18所示核苷酸序列，
(10)识别高危型HPV56的序列：SEQ ID NO：19所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：20所示核苷酸序列，
(11)识别高危型HPV58的序列：SEQ ID NO：21所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：22所示核苷酸序列，
(12)识别高危型HPV59的序列：SEQ ID NO：23所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：24所示核苷酸序列，
(13)识别高危型HPV68的序列：SEQ ID NO：25所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：26所示核苷酸序列。
在具体实施方案中可以针对每个基因型选取多条特异的探针，同时固定在固体支持物上，以提高检测的准确性。
本发明所述人乳头瘤病毒各高危基因特异探针还包括连接在探针序列末端的oligo dT或poly A，以增加探针和固体支持物之间的距离，减少杂交的空间位阻。优选的，所述人乳头瘤病毒各高危基因特异探针核苷酸序列末端连接10～20个T或A，更优选地是，探针核苷酸序列末端连接15个T。
本发明所述检测人乳头瘤病毒各高危基因的方法用末端带有生物素标记的人乳头瘤病毒各高危基因引物扩增待测样品DNA制备带有生物素标记的待测样品DNA。在扩增时，引物用抗原生物素标记，扩增后，产物中就会带有生物素标记，得到带有生物素标记的待测样品DNA。其中，所述扩增人乳头瘤病毒各高危基因引物，是针对13种高危型HPV基因序列的L1区域的两个相对保守区域设计，确保可以扩增13种高危型HPVDNA。
优选的，所述扩增人乳头瘤病毒各高危基因引物为针对13种高危型HPV基因序列的L1区域的两个相对保守区域设计，确保13种高危型HPV中每种亚型的上下游保守区至少有一个引物的3’端的10个碱基上错配的碱基少于两个，从而使上下游引物能够在较低的复性温度下扩增出13种高危型HPV。
更优选地是，所述扩增人乳头瘤病毒各高危基因型引物包括SEQ ID NOs：27～31所示核苷酸序列的5条上游引物和具有SEQ ID NOs：32～35所示核苷酸序列的4条下游引物。
本发明所述待测样品DNA与固定有人乳头瘤病毒各高危基因特异探针固体支持物杂交采用本领域技术人员熟知的方法进行，在具体实施方案中，所述杂交方法为待测样品DNA在65℃条件下碱变性10min，变性结束后，加入预杂交液，以封闭非特异性位点避免与探针的非特异性结合，然后在42～65℃下与探针杂交反应30～120min。其中，杂交所采用的碱变性液优选为本领域人员熟知的0.2～1mol/L的NaOH溶液或0.1～0.5mg/mL的麝香草芬兰溶液(Thymol-blue)，本发明不做限定，待测样品DNA加入量为10～40μL，碱变性液加入量为10～50μL。杂交所采用的预杂交液优选本领域人员熟知的预杂交液，配方为4～6×SSC、0.01～0.02mol/L PB、0.1～0.5％ BSA、0.1～0.5％ SDS、10～100μg/mL鲑精DNA、0.2mol/L HCl，预杂交液加入量为50～100μL。
本发明所述检测方法利用酶底物信号放大系统检测信号，可提高检测方法的灵敏度，以检测微量DNA样品。酶能催化特定的底物，将其转化为有可检测信号的产物，酶使底物转化为产物，本身在反应过程中并不消耗，反复起催化作用，将信号放大。本发明所述酶底物信号放大系统中的酶优选为本领域人员熟知的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，酶的底物可以为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶特定的色原底物、荧光底物或化学发光底物。在具体实施方案中，酶底物信号放大系统可以是底物为3，3′5，5-四甲基联苯胺(TMB)、3′3′二氨基联苯胺(DAB)或鲁米诺(Luminol)的辣根过氧化物酶标记的底物放大系统，也可以是底物为5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐(BCIP)、氯化硝基四氮唑兰(NBT)、磷酸4-甲基伞酮(4-MUP)或对硝基苯基磷酸钠六水合物(pNPP)的碱性磷酸酶标记的底物放大系统。
优选的，所述酶底物信号放大系统为底物为3，3′5，5-四甲基联苯胺的辣根过氧化物酶标记的底物放大系统。
本发明还提供了一种检测多种病原微生物的试剂盒，包括固定有各靶基因特异探针的固体支持物。
在具体实施方案中，所述各靶基因为人乳头瘤病毒各高危基因，即本发明提供了一种检测人乳头瘤病毒各高危基因的试剂盒，包括固定有人乳头瘤病毒各高危基因特异探针的固体支持物。
优选的，所述人乳头瘤病毒各高危基因型特异探针序列包括特异性识别各高危型HPVDNA的探针序列。
更优选的，所述人乳头瘤病毒各高危基因特异探针序列包括：
(1)识别高危型HPV16的序列：SEQ ID NO：1所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，
(2)识别高危型HPV18的序列：SEQ ID NO：3所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，
(3)识别高危型HPV31的序列：SEQ ID NO：5所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，
(4)识别高危型HPV33的序列：SEQ ID NO：7所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列，
(5)识别高危型HPV35的序列：SEQ ID NO：9所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：10所示核苷酸序列，
(6)识别高危型HPV39的序列：SEQ ID NO：11所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：12所示核苷酸序列，
(7)识别高危型HPV45的序列：SEQ ID NO：13所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：14所示核苷酸序列，
(8)识别高危型HPV51的序列：SEQ ID NO：15所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：16所示核苷酸序列，
(9)识别高危型HPV52的序列：SEQ ID NO：17所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：18所示核苷酸序列，
(10)识别高危型HPV56的序列：SEQ ID NO：19所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：20所示核苷酸序列，
(11)识别高危型HPV58的序列：SEQ ID NO：21所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：22所示核苷酸序列，
(12)识别高危型HPV59的序列：SEQ ID NO：23所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：24所示核苷酸序列，
(13)识别高危型HPV68的序列：SEQ ID NO：25所示核苷酸序列和/或SEQ ID NO：26所示核苷酸序列。
在具体实施方案中可以针对每个基因型选取多条特异的探针，同时固定在固体支持物上，以提高检测的准确性。
在具体实施方案中，本发明所述试剂盒还可以包括人乳头瘤病毒各高危基因特异探针、固体支持物、蛋白和各种反应液，由技术人员自行制备。制备方法具体为将蛋白溶解于蛋白包被液中孵育活性有机基团修饰的固体支持物，加入交联剂活化蛋白分子，然后再用人乳头瘤病毒各高危基因探针孵育固体支持物。具体操作采用本领域技术人员熟知的方法进行。其中，优选的，所述人乳头瘤病毒各高危基因探针浓度为0.5μmol/L～2.0μmol/L，所述蛋白包被液可以是pH7.4的PBS缓冲液，也可以是pH9.6的碳酸缓冲液，所述交联剂，包括但不限于浓度为0.1～100mmol/L的1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚(EDC)、浓度为1％～10％的戊二醛。
优选的，本发明所述检测人乳头瘤病毒各高危基因型的试剂盒，还包括末端带有生物素标记的人乳头瘤病毒各高危基因型引物。
更有选地是，所述人乳头瘤病毒各高危基因型引物包括SEQ ID NOs：1～5所示核苷酸序列的5条上游引物和具有SEQ ID NOs：6～9所示核苷酸序列的4条下游引物。
优选的，本发明所述检测人乳头瘤病毒各高危基因的试剂盒还包括亲和素介导的酶底物信号放大系统，所述酶底物信号放大系统中包括酶标记亲和素反应液和底物显色液。其中，酶标记亲和素反应液优选为本领域人员熟知的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记亲和素，所述底物显色液可以为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶特定的色原底物、荧光底物或化学发光底物。在具体实施方案中，酶底物信号放大系统可以是底物为3，3′5，5-四甲基联苯胺(TMB)、3′3′二氨基联苯胺(DAB)或鲁米诺(Luminol)的辣根过氧化物酶标记的底物放大系统，也可以是底物为5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐(BCIP)、氯化硝基四氮唑兰(NBT)、磷酸4-甲基伞酮(4-MUP)或对硝基苯基磷酸钠六水合物(pNPP)的碱性磷酸酶标记的底物放大系统。
优选的，本发明所述试剂盒还包括杂交反应液，以方便扩增产物与探针杂交。所述杂交反应液包括碱变性液和预杂交液。所述碱变性液优选为本领域人员熟知的0.2～1mol/L的NaOH溶液或0.1～0.5mg/mL的麝香草芬兰溶液(Thymol-blue)，本发明不做限定。所述预杂交液优选本领域人员熟知的预杂交液，在具体实施方案中，所述预杂交液配方为4～6×SSC、0.01～0.02mol/LPB、0.1～0.5％ BSA、0.1～0.5％ SDS、10～100μg/mL鲑精DNA、0.2mol/L HCl。
优选的，所述试剂盒还包括PCR反应液和/或样品DNA提取液。优选为本领域人员熟知的PCR反应液和DNA提取液，本发明不做限定。
优选的，本发明所述试剂盒还包括对照样品，包括阳性对照样品和阴性对照样品。
在一个具体实施方式中，本发明采用提供的扩增人乳头瘤病毒各高危基因引物扩增各高危亚型HPVDNA，凝胶电泳检测扩增产物，结果显示，各高危亚型HPV扩增产物均为单一条带，测序显示与HPV各高危亚型的核苷酸片段序列一致，表明本发明提供的引物可以同时扩增各高危亚型HPV，并且特异性好，灵敏度高。
在一个具体实施方式中，采用本发明提供的检测人乳头瘤病毒各高危基因的方法检测包括各高危亚型在内的29种HPV DNA，结果显示，各高危亚型HPV信号强度远高于其它基因型，表明本发明所述检测方法特异性好，灵敏度高，适合高危亚型HPV的检测。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：探针的制备
针对13种高危型HPV基因序列的L1区域的两个相对保守区域之间的多态性非保守区域设计探针，每种HPV高危型分别设计两条特异探针，分别命名为A和B，确保13种高危型HPV中每个HPV型两条特异探针分别位于不同位置，相互重叠部分小于5bp。探针5’端带有15bp的多聚T的长臂，同时进行氨基修饰，便于与固定在固体支持物上的蛋白结合。探针序列如表1所示。
表1 13种高危型HPV检测探针表：
实施例2：引物的设计与制备
针对13种高危型HPV基因序列的L1区域的两个相对保守区域设计引物，确保13种高危型HPV中每种亚型的上下游保守区至少有一个引物的3’端的10个碱基上错配的碱基少于两个，从而使上下游引物能够在较低的复性温度下扩增出13种高危型HPV。引物序列如表2所示，包括SEQ ID NOs：27～31所示核苷酸序列的上游引物F1、F2、F3、F4、F5和SEQ ID NOs：32～35所示核苷酸序列下游引物R1、R2、R3、R4。引物的5’端带有生物素标记。
表2引物序列
实施例2：检测人乳头瘤病毒各高危基因的试剂盒
一种检测人乳头瘤病毒各高危基因的试剂盒，包括固定有人乳头瘤病毒各高危基因特异探针的微孔板，所述探针序列如表1所示。探针的5’端带有15bp的多聚T的长臂，同时进行氨基修饰。
实施例3：检测人乳头瘤病毒各高危基因的试剂盒
一种检测人乳头瘤病毒各高危基因的试剂盒，包括固定有人乳头瘤病毒各高危基因特异探针的微孔板，扩增人乳头瘤病毒各高危基因引物、辣根过氧化物酶标记亲和素反应液和3，3′5，5-四甲基联苯胺(TMB)的底物显色液。其中，所述探针序列如表1所示，所述引物序列如表2所示，引物的5’端带有生物素标记，探针的5’端带有15bp的多聚T的长臂同时进行氨基修饰。
实施例4：检测人乳头瘤病毒各高危基因的试剂盒
一种检测人乳头瘤病毒各高危基因的试剂盒，包括固定有人乳头瘤病毒各高危基因特异探针的微孔板，扩增人乳头瘤病毒各高危基因引物、0.2～1mol/L的NaOH碱变性溶液、预杂交液、碱性磷酸酶标记亲和素的酶反应液溶液、磷酸4-甲基伞酮(4-MUP)底物显色液和终止液。其中，所述探针序列如表1所示，所述引物序列如表2所示，引物的5’端带有生物素标记，探针的5’端带有15bp的多聚T的长臂同时进行氨基修饰。所述预杂交液配方为4～6×SSC、0.01～0.02mol/L PB、0.1～0.5％ BSA、0.1～0.5％ SDS、10～100μg/mL鲑精DNA、0.2mol/L HCl。所述碱性磷酸酶标记亲和素的酶反应液溶液如表3所示。底物显色液如表4所示。终止液为3mol/L的K2HP4溶液。
表3酶标记物溶液
表44-MUP底物显色液
实施例5：检测扩增人乳头瘤病毒各高危基因的引物
取各高危亚型HPV标准品DNA(购自中国药品检验所)，采用实施例2所述引物，进行PCR扩增。按照表5所示配方配制PCR反应液。包括上游引物F1、F2、F3、F4、F5和下游引物R1、R2、R3、R4，每条引物的终浓度为0.1μmol/L。
表5PCR反应液配方
将加好样的PCR管放入PCR仪托槽内，关闭仪器，设置反应程序，反应程序如表6所示。
表6PCR反应程序
PCR反应完成后，2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。
由图1可见，各高危型HPV泳道均有单一条带，回收产物，送中美泰和生物工程公司测序，结果显示与HPV各高危型的核苷酸片段序列一致，表明采用本发明所述引物组可以同时扩增各高危型HPV。
测定扩增产物浓度并换算成拷贝数值，10倍倍比稀释，换算成拷贝数，制备成102～106拷贝的样品，常规凝胶电泳检测，结果显示103～106拷贝的样品均具有单一条带，102拷贝具有微弱的单一条带，表明本发明提供的引物特异性好，灵敏度高。
实施例6：检测人乳头瘤病毒各高危基因
采用实施例4所述试剂盒检测包括各高危型基因在内的29种HPV标准品DNA。按照实施例5所述PCR反应液配方配制PCR反应体系，将加好样的PCR管放入PCR仪托槽内，关闭仪器，设置反应程序，PCR反应程序同实施例5。将固定特异性检测高危型人乳头瘤病毒探针的96孔微孔板，每孔加入50μL碱变性液。待PCR反应完成后，每个HPV亚型取30μL PCR产物，分别加入微孔板中，放入湿盒内，盖好盖子，65℃反应10min。然后每孔加入70μL预杂交液，轻轻震动微孔板，液体变为黄色，将微孔板放回预先加热的湿盒内，65℃反应0.5h。倾去微孔中的反应液，纸巾上拍干，用双蒸水洗涤微孔板2～3次，洗板完成后，轻轻在纸巾上拍干残存液体。向各反应孔内加入酶标记物溶液100μL，37℃反应0.5h。双蒸水洗涤微孔板2～3次，然后各检测孔分别加入100μL底物显色液，反应10min，终止液终止反应。酶标检测仪检测反应信号，检测波长为450nm，检测结果见图2。
由图2可见，13个HPV高危基因的信号强度远高于其它HPV亚型，与Cutoff值比较，13个高危型HPV的信号值大于Cutoff值为阳性，而其它HPV亚型的信号值均小于Cutoff值，为阴性，表明本发明所述检测方法可以特异性检测各高危亚型HPV。
实施例7：本发明所述检测人乳头瘤病毒各高危基因的方法与第二代杂交捕获法比较试验
采集236份临床样本分别采用本发明实施例6所述方法和第二代杂交捕获法(HCII)进行检测，结果见表7。
表7本发明所述方法与HCII法比较
由表7结果可见，两种方法总体复合率为92.7％，在236例临床样本中本发明所述方法比第二代杂交捕获法多检出15例阳性，表明本发明所述方法比第二代杂交捕获法灵敏度高。
实施例8：临床样本的检测
按照本发明所述检测方法，利用本发明实施例4所述试剂盒，采集10000份女性宫颈口棉拭子样本进行检测。
样本采集：采样前用无菌生理盐水棉球将宫颈口过多的分泌物轻轻擦拭干净，随后使用生理盐水浸润的特制取样刷，紧贴宫颈口稍用力转动两周，取得脱落细胞，放入含1mL无菌生理盐水的样本管中，充分漂洗后，将棉拭子贴壁挤干丢弃，如果样本中含有血液成分，应多次用生理盐水洗涤，直到样本无色为止。采集的样本在室温放置不超过3h，4℃保存不超过24h，-20℃保存不超过三个月，-70℃可长期保存，但应避免反复冻融。
样本处理：将上述宫颈取样刷的生理盐水浸液混匀，转移至1.5mL离心管中，13,000rpm离心5min，弃去上清，沉淀加入200μL DNA提取液，振荡混匀，沸水浴10min，13,000rpm离心10min，取上清2μL做为PCR反应模板。
样本检测：采用实施例4所述试剂盒，按照实施例6所述方法对样本进行检测。结果显示，10000份女性宫颈口棉拭子样本中，254份可检测到反应信号，其中60份信号强度明显高于其他样本。为了进一步证实本发明所述方法的准确性，对上述60份样本利用第二代杂交捕获法(HCII)进行复查，结果表明，复查结果与按照本发明所述方法检测的结果完全一致。可见本发明所述检测方法和试剂盒可满足于HPV高危型基因的临床检测。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (3)
1.一种检测人乳头瘤病毒各高危基因型的试剂盒，其特征在于，包括固定有人乳头瘤病毒各高危基因特异探针的固体支持物，所述固定有人乳头瘤病毒各高危基因特异探针的固体支持物为蛋白与固体支持物共价结合固定在固体支持物上，然后末端修饰活性有机基团的人乳头瘤病毒各高危基因特异探针通过交联剂与蛋白共价结合固定在固体支持物上得到；
其中，所述人乳头瘤病毒各高危基因特异探针5’端带有15bp的多聚T的长臂，同时末端修饰的活性有机基团为氨基，并通过交联剂与牛血清白蛋白共价结合固定在固体支持物上；所述人乳头瘤病毒各高危基因特异探针序列为：
（1）识别高危型HPV16的序列：SEQ ID NO：1所示核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，
（2）识别高危型HPV18的序列：SEQ ID NO：3所示核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，
（3）识别高危型HPV31的序列：SEQ ID NO：5所示核苷酸序列和SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，
（4）识别高危型HPV33的序列：SEQ ID NO：7所示核苷酸序列和SEQ ID NO：8所示核苷酸序列，
（5）识别高危型HPV35的序列：SEQ ID NO：9所示核苷酸序列和SEQ ID NO：10所示核苷酸序列，
（6）识别高危型HPV39的序列：SEQ ID NO：11所示核苷酸序列和SEQ ID NO：12所示核苷酸序列，
（7）识别高危型HPV45的序列：SEQ ID NO：13所示核苷酸序列和SEQ ID NO：14所示核苷酸序列，
（8）识别高危型HPV51的序列：SEQ ID NO：15所示核苷酸序列和SEQ ID NO：16所示核苷酸序列，
（9）识别高危型HPV52的序列：SEQ ID NO：17所示核苷酸序列和SEQ ID NO：18所示核苷酸序列，
（10）识别高危型HPV56的序列：SEQ ID NO：19所示核苷酸序列和SEQ ID NO：20所示核苷酸序列，
（11）识别高危型HPV58的序列：SEQ ID NO：21所示核苷酸序列和SEQ ID NO：22所示核苷酸序列，
（12）识别高危型HPV59的序列：SEQ ID NO：23所示核苷酸序列和SEQ ID NO：24所示核苷酸序列，
（13）识别高危型HPV68的序列：SEQ ID NO：25所示核苷酸序列和SEQ ID NO：26所示核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，还包括末端带有生物素标记的人乳头瘤病毒各高危基因引物。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述人乳头瘤病毒各高危基因引物为SEQ ID NOs：27～31所示核苷酸序列的5条上游引物和如SEQ ID NOs：32～34所示核苷酸序列的3条下游引物。
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