CN100400675C - 人乳头瘤病毒基因分型检测诊断芯片和制作方法及检测方法 - Google Patents
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- CN100400675C CN100400675C CNB2005100133184A CN200510013318A CN100400675C CN 100400675 C CN100400675 C CN 100400675C CN B2005100133184 A CNB2005100133184 A CN B2005100133184A CN 200510013318 A CN200510013318 A CN 200510013318A CN 100400675 C CN100400675 C CN 100400675C
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Abstract
本发明是人乳头瘤病毒基因分型检测诊断芯片和制作方法及检测方法。在芯片基质上设置16种探针，探针在芯片上微阵列排列，包括通用探针1个，HPV型特异探针有15个，用于区分HPV基因型6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、52、56、58等共计15种基因型，在特异探针末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，将点好的芯片放在紫外交联仪内进行照射5分钟，使探针完全固定在芯片上，构成检测诊断芯片。PCR引物采用2对24条链的套式引物组合，。本发明具有诊断准确、快速、诊断方法简单、特异性强、信息量高和易于推广使用的特点，临床应用具有极大的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物检测医学体外诊断技术，尤其涉及一种人乳头瘤病毒基因分型检测诊断芯片和制作方法及检测方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(即Human papilloma virus，以下简称HPV)的分型研究一直受到国内外学者的高度重视，HPV各型在标本中的确认，取决于所用方法。目前，对HPV感染的诊断主要依赖分子生物学技术对病毒核苷酸序列进行基因检测，包括基因测序、杂交捕获、斑点杂交、狭线杂交和特异型探针等方法已应用于HPV研究，但由于各自的局限性及特殊要求，无法满足在临床检测中短时间内、高通量获得患者感染的HPV病毒基因型。
发明内容
本发明的主要目的在于解决上述检测HPV病毒基因存在的问题，提供一种利用基因芯片技术快速、可靠、敏感、特异及简单的人乳头瘤病毒基因分型检测诊断芯片和制作方法及检测方法。
人乳头瘤病毒(即Human papilloma virus，以下简称HPV.)是一种在人群中极易传播扩散的DNA病毒，可通过直接或间接接触交叉传染，其感染部位隐蔽，发病隐匿，不易早期发现。据有关统计显示，近20％的人群携带着HPV病毒，而且超过半数的人在感染HPV后不会有任何症状，因此，实际携带HPV的人口比例可能远不止于此。HPV各基因型与其生物学行为存在着高度相关性，不同基因型的HPV可导致人体不同部位的不同反应及疾病，有不同的致病危害性。HPV感染人的皮肤和粘膜上皮细胞诱发细胞增生，产生乳头样病变，不同基因型引起的感染具有不同的临床表现。
依据HPV在生殖系统肿瘤形成中所发挥作用的差异，将HPV分为高危组、中危组和低危组三个组。临床统计表明，高危组的HPV感染是宫颈癌的主要病因，与95％以上的宫颈癌发病有关。如能及早发现HPV，用药物加以间接治疗，可以大大减少患宫颈癌的机会。即使不幸发现患有宫颈癌，只要能于宫颈癌病发的第一至第二期发现并进行治疗，五年内存活率达70至90％；但如果迟于第三至第四期发现，其五年内存活率只有7-30％。因此及早进行HPV基因分型，对女性健康十分必要。另外，最近文献表明HPV在生殖系统以外区域的鳞状细胞粘膜肿瘤中也存在，如口腔、鼻咽、食道和男性尿道等。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
芯片基质上设置探针，包括识别所有HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，用于区分HPV 6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共计15种基因型，探针在芯片上微阵列排列，至少5个以上坐标点控制芯片的矩形点样区域，以坐标点控制芯片的矩形点样区域和点样方向，微阵列中一个角设置2个标点，为点样起始点，指示探针排列方向，微阵列的其他3个角上为1个坐标点，微阵列的纵列至少3列以上，微阵列的横行至少3行以上。每个HPV探针点样1个以上，通用探针是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15种基因型，“+”代表阳性质控点，排列方式由通用探针到各型探针由小数到大数依次排列，再加上阴性和阳性质控点，点阵数至少18点以上。
PCR引物采用2对24条链的套式引物组合，其核苷酸序列如下表所示，
| 基因型 | 序列组成 |
| 上游外引物 | |
| 6/11 | 5’GC(C/T)CAGGGACATAACAATGG 3′ |
| 18/58 | 5’GCACA(G/A)GGTCATAACAATGG 3′ |
| 39/45 | 5’GCCCAGGGCCA(T/C)AACAATGG 3′ |
| 33/35/56 | 5’GCACAAGG(T/C)CATAATAATGG 3′ |
| 31/42 | 5’GCTCA(G/A)GGACACAATAATGG 3′ |
| 44/52/16 | 5’GC(G/A)CAGGGCCACAATAATGG 3′ |
| 上游内引物 | |
| 6/11/18/31/33 | 5’TTTGTTACTGTGGTAGATAC 3′ |
| 44/56 | 5’TTTGTTACTGT(T/A)GTAGATAC 3′ |
| 35/58/42 | 5’TTTGTTAC(T/C)GT(A/G)GTTGATAC 3′ |
| 52 | 5’TTTGTCACAGTTGTGGATAC 3′ |
| 39/45 | 5’TTTGTTACTGT(A/T)GTGGACAC 3′ |
| 16 | 5’TTTGTTACTGTTGTTGATAC 3′ |
| 下游外引物 | |
| 6/33/58 | 5’CGTCCCAAAGGA(T/A)ACTGATC 3′ |
| 35 | 5’CGGCCCAACGGAAACTGATC 3′ |
| 31/56 | 5’CGACCCAGTGGAAA(C/T)TGATC 3′ |
| 39/42 | 5’CGTCC(T/C)AAAGG(A/G)AATTGATC 3′ |
| 11/18/44/45 | 5’CGTCCAAGGGGA(A/T)A(C/T)TGATC 3′ |
| 16/52 | 5’CGTCCTAAAGGAAACTGATC 3′ |
| 下游内引物 | |
| 6/52/31/39 | 5’TGAAA(A/T)ATAAATTGTAAATCA 3′ |
| 33/58 | 5’TGAAAAACAAACTGTA(G/A)(A/G)TCA 3′ |
| 44 | 5’TGAAACATAAATTGTAAGTCA 3′ |
| 56 | 5’TGAAAAACAAATTGTAATTCA 3′ |
| 42 | 5’TGAAATATAAATTGCACATCA 3′ |
| 18/45/35/11/16 | 5’TGAAAAATAAACTG(C/T)AAATCA 3′ |
在带正电荷的芯片基质上固定HPV各基因型探针，探针在膜上呈双点微阵列排列。
5个坐标点(黑色圆圈)控制芯片的点样区域和点样方向，左下角的双坐标点为点样起始点。每个HPV探针可重复点样2个，通用探针是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 52、HPV 56代表15种基因型，“+”代表阳性质控点。
HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，包括HPV基因型HPV 6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 52、HPV 56、HPV 58等共计15种基因型，各型探针序列如下表所示，
| 基因型 | 序列组成 |
| 通用探针 | 5′TATGATTT(A/G)CA(A/G)TTTATG 3′ |
| HPV-6 | 5’TCCGTAACTACATCTTCCA 3′ |
| HPV-11 | 5’TCTGTGTCTAAATCTGCTAC 3′ |
| HPV-16 | 5’CATTATGTGCTGCCATATC 3′ |
| HPV-18 | 5’TGCTTCTACACAGTCTCCT 3′ |
| HPV-31 | 5’GCAATTGCAAACAGTGATAC 3′ |
| HPV-33 | 5’TATGACTTTATGCACACAAGT 3′ |
| HPV-35 | 5’CTGCTGTGTCTTCTAGTGA 3′ |
| HPV-39 | 5’ATAGAGTCTTCCATACCTTC 3′ |
| HPV-42 | 5’TGGTGATACATATACAGCTG 3′ |
| HPV-43 | 5’TCTACTGACCCTACTGTG 3′ |
| HPV-44 | 5’TACTAGTGAACAATATAAGCA 3′ |
| HPV-45 | 5’TACACAAAATCCTGTGCCA 3′ |
| HPV-52 | 5’GAATACCTTCGTCATGGC 3′ |
| HPV-56 | 5’CAGAACAGTTAAGTAAATATG 3′ |
| HPV-58 | 5’ATTATGCACTGAAGTAACTAA 3′ |
15个HPV型特异探针指的是区分15种HPV基因型的型特异探针，每一个探针对应特定的一种基因型。1个共有探针指的是15种HPV基因型的通用探针，该探针可以和15种HPV基因型出现杂交信号，甚至包括其他基因型。
在特异探针末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，使其能够固化在芯片上，特定的聚核苷酸尾巴是在每个HPV特异探针的3’末端加入20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸分子。将点好的芯片放在紫外交联仪内进行照射5分钟，使探针完全固定在芯片上，构成检测诊断芯片，把构成的检测诊断芯片置于2-8℃条件下存放。
根据美国国家生物信息中心基因库(GenBank)公布的HPV各基因型序列，选取HPV序列中相对保守而又存在型间差异的ORFL1区，结合HPV各基因型在我国的流行状况和致病性设计所检测基因型的PCR引物和芯片探针，探针合成时在3’末端加一段特定的聚核苷酸尾巴。
在芯片基质上设置探针，用微孔板放置点样探针和坐标标记，探针在芯片上矩形微阵列排列，包括识别所有HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，用于区分HPV 6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58、58共计15种基因型，探针在芯片上微阵列排列，至少5个以上坐标点控制芯片的矩形点样区域，以坐标点标示控制芯片的矩形点样区域和点样方向，微阵列中一个角设置2个坐标点，为点样起始点，指示探针排列方向，微阵列的其他3个角上为1个坐标点，微阵列的纵列至少3列以上，微阵列的横行至少3行以上。每个HPV探针可重复点样2个，通用探针是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56代表15种基因型，“+”代表阳性质控点，排列方式由通用探针到各型探针由小数到大数依次排列，再加上阴性和阳性质控点，点阵数至少18点以上。
PCR引物采用2对24条链的套式引物组合，其核苷酸序列如下表所示，
| 基因型 | 序列组成 |
| 上游外引物 | |
| 6/11 | 5’GC(C/T)CAGGGACATAACAATGG 3′ |
| 18/58 | 5’GCACA(G/A)GGTCATAACAATGG 3′ |
| 39/45 | 5’GCCCAGGGCCA(T/C)AACAATGG 3′ |
| 33/35/56 | 5’GCACAAGG(T/C)CATAATAATGG 3′ |
| 31/42 | 5’GCTCA(G/A)GGACACAATAATGG 3′ |
| 44/52/16 | 5’GC(G/A)CAGGGCCACAATAATGG 3′ |
| 上游内引物 | |
| 6/11/18/31/33 | 5’TTTGTTAC TGTGGTAGATAC 3′ |
| 44/56 | 5’TTTGTTAC TGT(T/A)GTAGATAC 3′ |
| 35/58/42 | 5’TTTGTTAC(T/C)GT(A/G)GTTGATAC 3′ |
| 52 | 5’TTTGTCACAGTTGTGGATAC 3′ |
| 39/45 | 5’TTTGTTACTGT(A/T)GTGGACAC 3′ |
| 16 | 5’TTTGTTACTGTTGTTGATAC 3′ |
| 下游外引物 | |
| 6/33/58 | 5’CGTCCCAAAGGA(T/A)ACTGATC 3′ |
| 35 | 5’CGGCCCAACGGAAACTGATC 3′ |
| 31/56 | 5’CGACCCAGTGGAAA(C/T)TGATC 3′ |
| 39/42 | 5’CGTCC(T/C)AAAGG(A/G)AATTGATC 3′ |
| 11/18/44/45 | 5’CGTCCAAGGGGA(A/T)A(C/T)TGATC 3′ |
| 16/52 | 5’CGTCCTAAAGGAAACTGATC 3′ |
| 下游内引物 | |
| 6/52/31/39 | 5’TGAAA(A/T)ATAAATTGTAAATCA 3′ |
| 33/58 | 5’TGAAAAACAAACTGTA(G/A)(A/G)TCA 3′ |
| 44 | 5’TGAAACATAAATTGTAAGTCA 3′ |
| 56 | 5’TGAAAAACAAATTGTAATTCA 3′ |
| 42 | 5’TGAAATATAAATTGCACATCA 3′ |
| 18/45/35/11/16 | 5’TGAAAAATAAACTG(C/T)AAATCA 3′ |
HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，包括HPV基因型HPV6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、5HPV6、HPV58共计15种基因型，各型探针序列如下表所示，
| 基因型 | 序列组成 |
| 通用探针 | 5′TATGATTT(A/G)CA(A/G)TTTATG 3′ |
| HPV-6 | 5’TCCGTAACTACATCTTCCA 3′ |
| HPV-11 | 5’TCTGTGTCTAAATCTGCTAC 3′ |
| HPV-16 | 5’CATTATGTGCTGCCATATC 3′ |
| HPV-18 | 5’TGCTTCTACACAGTCTCCT 3′ |
| HPV-31 | 5’GCAATTGCAAACAGTGATAC 3′ |
| HPV-33 | 5’TATGACTTTATGCACACAAGT 3′ |
| HPV-35 | 5’CTGCTGTGTCTTCTAGTGA 3′ |
| HPV-39 | 5’ATAGAGTCTTCCATACCTTC 3′ |
| HPV-42 | 5’TGGTGATACATATACAGCTG 3′ |
| HPV-43 | 5’TCTACTGACCCTACTGTG 3′ |
| HPV-44 | 5’TACTAGTGAACAATATAAGCA 3′ |
| HPV-45 | 5’TACACAAAATCCTGTGCCA 3′ |
| HPV-52 | 5’GAATACCTTCGTCATGGC 3′ |
| HPV-56 | 5’CAGAACAGTTAAGTAAATATG 3′ |
| HPV-58 | 5’ATTATGCACTGAAGTAACTAA 3′ |
用DNA合成仪合成探针，在特异探针末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，即20个寡聚胸腺嘧啶核苷酸，使其能够固化在芯片上，在DNA合成仪采用固相亚磷酰胺三酯法在每个HPV特异探针的3′末端加入20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸分子。使用Nunc点样仪按照预先设定好的顺序在带有正电荷的芯片进行点样。
使用罗氏公司生产的带有正电荷的芯片，使用Nunc点样仪按预先设定好的顺序进行点样。
将点好的芯片放在UVP紫外交联仪内照射固定5分钟，使点样探针固定在芯片上，构成检测诊断芯片，把制作成的检测诊断芯片置于2-8℃条件下存放待用。
由于设计的探针比较短，很难固化在芯片上，因此在探针序列的3′末端加一个尾巴，即20个寡聚胸腺嘧啶核苷酸，使其能够固化在芯片上。
设计HPV特异性引物和探针：为有效扩增各基因型HPV和提高灵敏度，采用2对24条链的组合套式引物设计。设计探针16个，包括HPV共用探针1个，区分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56和HPV58共计15种基因型。
取出获得杂交信号的芯片，整张芯片背景不着色，杂交信号呈棕黄色，特异杂交点与非特异杂交点之间的差别明显，通过点样区域模式图，比对查出HPV基因分型。
按照临床标本处理、套式PCR扩增、芯片杂交、芯片洗涤、芯片显色和芯片杂交信号的判读进行检测；进行临床标本处理采用活检组织或石蜡标本或拭子标本。
套式PCR扩增分为两次进行，第一次PCR扩增包括标本处理上清液5微升、一次PCR反应混合液(含组合式上游外引物或下游外引物)44微升和Taq聚合酶1微升，总计50微升均匀混合。PCR循环条件为94℃预变性2分钟，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，进行35个循环，保持72℃延伸5分钟。
第二次PCR扩增是将第一次PCR产物5微升、二次PCR反应混合液(含组合式上游内引物和DIG-dUTP或者下游内引物和DIG-dUTP)44微升和Taq聚合酶1微升均匀混合。
PCR循环条件为94℃预变性2分钟，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，进行35个循环，保持72℃延伸5分钟，经过二次PCR扩增的PCR产物即制作成DIG标记的杂交探针。
将预先制作好的芯片装入杂交袋中，并在杂交袋中加入适量杂交液，把杂交袋封好，进行0.5--1小时的预杂交，加入5-20微升的变性探针，放入杂交箱内，再进行3-6小时的杂交，杂交箱温度为45℃。
在室温条件下用2×SSC/0.1％SDS洗涤芯片两次，每次2min，在46℃条件下用0.2×SSC/0.1％SDS洗的芯片两次，每次2min，然后用TNT溶液洗涤芯片5min。
将洗涤干净的芯片装入干净的塑料袋中，在塑料袋内加入10％封阻液100μl或TN 900μl，混合均匀，在37℃的条件下放置30min。
加入POD抗体1μl，轻轻混合均匀，在37℃的条件下放置30min；将芯片从塑料袋中取出用TNT漂洗芯片2次，每次3min。
将芯片放入干净的塑料袋中，取DAB显色液10μl、DAB稀释液10μl和灭菌水480μl，混合均匀后立即加到塑料袋中，待显色达到理想程度后(一般显色5-30分钟左右)，用1×PBS终止反应，获得芯片杂交结果，整张芯片背景不着色，杂交信号呈棕黄色。
临床标本处理采用活检组织，取50毫克活检组织加入DNA裂解液100微升混合均匀后进行研磨，研磨后进行55℃温浴1-3小时，再进行100℃煮沸10分钟，用12000rpm离心机离心10分钟，取5微升上清液用做PCR扩增模板。
临床标本处理采用石蜡标本，取3-5个石蜡标本切片进行脱蜡，加入DNA裂解液50微升，进行55℃温浴1-3小时，再进行100℃煮沸10分钟，用12000rpm的离心机离心10分钟，取5微升上清液用做PCR扩增模板。
临床标本处理采用拭子标本，拭子标本用生理盐水浸泡，用离心的方式收集细胞沉淀，加入DNA裂解液50微升，进行55℃温浴1-3小时，再进行100℃煮沸10分钟，用12000rpm离心机离心10分钟，取5微升上清液用做PCR扩增模板。
本发明在天津市第三中心医院对收集的95例临床样本进行分析表明，其中25例为HPV阳性感染，分型结果如下：
HPV6型9例、HPV11型5例、HPV16型4例、HPV33型3例、HPV52型2例、HPV16与HPV33的混合型1例、HPV16与HPV52的混合型1例，芯片杂交结果见图2。将其中的25例的PCR产物进行进一步的克隆测序，均证实芯片的准确性。实验证明HPV基因分型诊断芯片具有诊断准确、特异性强、操作简单、信息量大的特点。
本发明是人乳头瘤病毒基因分型检测诊断芯片和制作方法及检测方法。具有诊断准确、快速、诊断方法简单、特异性强、信息量高和易于推广使用的特点，探针检测通量大，可同时检测15种常见的HPV基因型；操作简便、快速，不需要昂贵的仪器设备和严格的操作环境，从样本处理开始仅用两个工作日内即可获得检测结果；组合式引物设计提高了PCR扩增的效率和阳性检出率；合理的探针设计减少了非特异性杂交反应的发生，特异性强；检测结果易于判断，可直接通过肉眼进行判断，也可由计算机控制的芯片阅读仪自动收集和分析数据。临床应用的市场潜力巨大，具有极大的经济效益和社会效益。
附图说明
以下结合附图和实施例对本发明详细说明。
图1芯片微阵列探针点样模式图(A)7×4微阵列模式(B)9×3微阵列模式(C)5×6微阵列模式(D)4×7微阵列模式(E)3×12微阵列模式
图2部分HPV基因型的芯片杂交结果(A)HPV 6型(B)HPV11型(C)HPV 16型(D)HPV 33型(E)HPV 16、33混合型(F)HPV 16、52混合型(注：图中铅笔字为标本号)
具体实施方式
实施例1
芯片基质上设置探针，包括识别所有HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，用于区分HPV 6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共计15种基因型，探针在芯片上微阵列排列，5个坐标点控制芯片的矩形点样区域，以坐标点控制芯片的矩形点样区域和点样方向，微阵列中一个角设置2个坐标点，为点样起始点，指示探针排列方向，微阵列的其他3个角上为1个坐标点，微阵列的纵列为4列，微阵列的横行为7行。每个HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探针点为1个，通用探针、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探针点为2个，通用探针是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15种基因型，“+”代表阳性质控点，排列方式由通用探针到各型探针由小数到大数依次排列，再加上阴性和阳性质控点，点阵数18点。
PCR引物采用2对24条链的套式引物组合，其核苷酸序列如下表所示，
| 基因型 | 序列组成 |
| 上游外引物 | |
| 6/11 | 5’GC(C/T)CAGGGACATAACAATGG 3′ |
| 18/58 | 5’GCACA(G/A)GGTCATAACAATGG 3′ |
| 39/45 | 5’GCCCAGGGCCA(T/C)AACAATGG 3′ |
| 33/35/56 | 5’GCACAAGG(T/C)CATAATAATGG 3′ |
| 31/42 | 5’GCTCA(G/A)GGACACAATAATGG 3′ |
| 44/52/16 | 5’GC(G/A)CAGGGCCACAATAATGG 3′ |
| 上游内引物 | |
| 6/11/18/31/33 | 5’TTTGTTACTGTGGTAGATAC 3′ |
| 44/56 | 5’TTTGTTACTGT(T/A)GTAGATAC 3′ |
| 35/58/42 | 5’TTTGTTAC(T/C)GT(A/G)GTTGATAC 3′ |
| 52 | 5’TTTGTCACAGTTGTGGATAC 3′ |
| 39/45 | 5’TTTGTTACTGT(A/T)GTGGACAC 3′ |
| 16 | 5’TTTGTTACTGTTGTTGATAC 3′ |
| 下游外引物 | |
| 6/33/58 | 5’CGTCCCAAAGGA(T/A)ACTGATC 3′ |
| 35 | 5’CGGCCCAACGGAAACTGATC 3′ |
| 31/56 | 5’CGACCCAGTGGAAA(C/T)TGATC 3′ |
| 39/42 | 5’CGTCC(T/C)AAAGG(A/G)AATTGATC 3′ |
| 11/18/44/45 | 5’CGTCCAAGGGGA(A/T)A(C/T)TGATC 3′ |
| 16/52 | 5’CGTCCTAAAGGAAACTGATC 3′ |
| 下游内引物 | |
| 6/52/31/39 | 5’TGAAA(A/T)ATAAATTGTAAATCA 3′ |
| 33/58 | 5’TGAAAAACAAACTGTA(G/A)(A/G)TCA 3′ |
| 44 | 5’TGAAACATAAATTGTAAGTCA 3′ |
| 56 | 5’TGAAAAACAAATTGTAATTCA 3′ |
| 42 | 5’TGAAATATAAATTGCACATCA 3′ |
| 18/45/35/11/16 | 5’TGAAAAATAAACTG(C/T)AAATCA 3′ |
HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，包括HPV基因型HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58等共计15种基因型，各型探针序列如下表所示，
| 基因型 | 序列组成 |
| 通用探针 | 5′TATGATTT(A/G)CA(A/G)TTTATG 3′ |
| HPV-6 | 5’TCCGTAACTACATCTTCCA 3′ |
| HPV-11 | 5’TCTGTGTCTAAATCTGCTAC 3′ |
| HPV-16 | 5’CATTATGTGCTGCCATATC 3′ |
| HPV-18 | 5’TGCTTCTACACAGTCTCCT 3′ |
| HPV-31 | 5’GCAATTGCAAACAGTGATAC 3′ |
| HPV-33 | 5’TATGACTTTATGCACACAAGT 3′ |
| HPV-35 | 5’CTGCTGTGTCTTCTAGTGA 3′ |
| HPV-39 | 5’ATAGAGTCTTCCATACCTTC 3′ |
| HPV-42 | 5’TGGTGATACATATACAGCTG 3′ |
| HPV-43 | 5’TCTACTGACCCTACTGTG 3′ |
| HPV-44 | 5’TACTAGTGAACAATATAAGCA 3′ |
| HPV-45 | 5’TACACAAAATCCTGTGCCA 3′ |
| HPV-52 | 5’GAATACCTTCGTCATGGC 3′ |
| HPV-56 | 5’CAGAACAGTTAAGTAAATATG 3′ |
| HPV-58 | 5’ATTATGCACTGAAGTAACTAA 3′ |
在特异探针末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，使其能够固化在芯片上，特定的聚核苷酸尾巴是在每个HPV特异探针的3’末端加入20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸分子。将点好的芯片放在紫外交联仪内进行照射5分钟，使探针完全固定在芯片上，构成检测诊断芯片，把构成的检测诊断芯片至于2-8℃条件下存放，如图1(A)、图2所示。
实施例2
芯片基质上设置探针，包括识别所有HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，用于区分HPV 6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共计15种基因型，探针在芯片上微阵列排列，5个坐标点控制芯片的矩形点样区域，以坐标点控制芯片的矩形点样区域和点样方向，微阵列中一个角设置2个坐标点，为点样起始点，指示探针排列方向，微阵列的其他3个角上为1个坐标点，微阵列的纵列为3列，微阵列的横行为9行。每个HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探针点为1个，通用探针、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探针点为2个，通用探针是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15种基因型，“+”代表阳性质控点，排列方式由通用探针到各型探针由小数到大数依次排列，再加上阴性和阳性质控点，点阵数18点以上，如图1(B)、图2所示。
实施例3
芯片基质上设置探针，包括识别所有HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，用于区分HPV 6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共计15种基因型，探针在芯片上微阵列排列，5个坐标点控制芯片的矩形点样区域，以坐标点控制芯片的矩形点样区域和点样方向，微阵列中一个角设置2个坐标点，为点样起始点，指示探针排列方向，微阵列的其他3个角上为1个坐标点，微阵列的纵列为6列，微阵列的横行为5行。每个HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探针点为1个，通用探针、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探针点为2个，通用探针是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15种基因型，“+”代表阳性质控点，排列方式由通用探针到各型探针由小数到大数依次排列，再加上阴性和阳性质控点，点阵数18点以上，如图1(C)、图2所示。
实施例4
芯片基质上设置探针，包括识别所有HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，用于区分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共计15种基因型，探针在芯片上微阵列排列，5个坐标点控制芯片的矩形点样区域，以坐标点控制芯片的矩形点样区域和点样方向，微阵列中一个角设置2个坐标点，为点样起始点，指示探针排列方向，微阵列的其他3个角上为1个坐标点，微阵列的纵列为7列，微阵列的横行为4行。每个HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探针点为1个，通用探针、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探针点为2个，通用探针是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15种基因型，“+”代表阳性质控点，排列方式由通用探针到各型探针由小数到大数依次排列，再加上阴性和阳性质控点，点阵数18点以上，如图1(D)、图2所示。
实施例5
芯片基质上设置探针，包括识别所有HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，用于区分HPV 6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共计15种基因型，探针在芯片上微阵列排列，5个坐标点控制芯片的矩形点样区域，以坐标点控制芯片的矩形点样区域和点样方向，微阵列中一个角设置2个坐标点，为点样起始点，指示探针排列方向，微阵列的其他3个角上为1个坐标点，微阵列的纵列为12列，微阵列的横行为3行以上。每个HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探针点为1个，通用探针、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探针点为2个，通用探针是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15种基因型，“+”代表阳性质控点，排列方式由通用探针到各型探针由小数到大数依次排列，再加上阴性和阳性质控点，点阵数18点以上，如图1(E)、图2所示。
实施例6
在芯片基质上设置探针，用微孔板放置点样探针和坐标标记，探针在芯片上矩形微阵列排列，包括识别所有HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，用于区分HPV 6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共计15种基因型，探针在芯片上微阵列排列，至少5个以上坐标点控制芯片的矩形点样区域，以坐标点标示控制芯片的矩形点样区域和点样方向，微阵列中一个角设置2个坐标点，为点样起始点，指示探针排列方向，微阵列的其他3个角上为1个坐标点，微阵列的纵列至少3列以上，微阵列的横行至少3行以上；每个HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探针点为1个，通用探针、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探针点为2个，通用探针是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15种基因型，“+”代表阳性质控点，排列方式由通用探针到各型探针由小数到大数依次排列，再加上阴性和阳性质控点，点阵数至少18点以上。
PCR引物采用2对24条链的套式引物组合，其核苷酸序列如下表所示，
| 基因型 | 序列组成 |
| 上游外引物 | |
| 6/11 | 5’GC(C/T)CAGGGACATAACAATGG 3′ |
| 18/58 | 5’GCACA(G/A)GGTCATAACAATGG 3′ |
| 39/45 | 5’GCCCAGGGCCA(T/C)AACAATGG 3′ |
| 33/35/56 | 5’GCACAAGG(T/C)CATAATAATGG 3′ |
| 31/42 | 5’GCTCA(G/A)GGACACAATAATGG 3′ |
| 44/52/16 | 5’GC(G/A)CAGGGCCACAATAATGG 3′ |
| 上游内引物 | |
| 6/11/18/31/33 | 5’TTTGTTACTGTGGTAGATAC 3′ |
| 44/56 | 5’TTTGTTACTGT(T/A)GTAGATAC 3′ |
| 35/58/42 | 5’TTTGTTAC(T/C)GT(A/G)GTTGATAC 3′ |
| 52 | 5’TTTGTCACAGTTGTGGATAC 3′ |
| 39/45 | 5’TTTGTTACTGT(A/T)GTGGACAC 3′ |
| 16 | 5’TTTGTTACTGTTGTTGATAC 3′ |
| 下游外引物 | |
| 6/33/58 | 5’CGTCCCAAAGGA(T/A)ACTGATC 3′ |
| 35 | 5’CGGCCCAACGGAAACTGATC 3′ |
| 31/56 | 5’CGACCCAGTGGAAA(C/T)TGATC 3′ |
| 39/42 | 5’CGTCC(T/C)AAAGG(A/G)AATTGATC |
| 11/18/44/45 | 5’CGTCCAAGGGGA(A/T)A(C/T)TGATC |
| 16/52 | 5’CGTCCTAAAGGAAACTGATC 3′ |
| 下游内引物 | |
| 6/52/31/39 | 5’TGAAA(A/T)ATAAATTGTAAATCA 3′ |
| 33/58 | 5’TGAAAAACAAACTGTA(G/A)(A/G)TCA 3′ |
| 44 | 5’TGAAACATAAATTGTAAGTCA 3′ |
| 56 | 5’TGAAAAACAAATTGTAATTCA 3′ |
| 42 | 5’TGAAATATAAATTGCACATCA 3′ |
| 18/45/35/11/16 | 5’TGAAAAATAAACTG(C/T)AAATCA 3′ |
HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，包括HPV基因型HPV6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共计15种基因型，各型探针序列如下表所示，
| 基因型 | 序列组成 |
| 通用探针 | 5′TATGATTT(A/G)CA(A/G)TTTATG 3′ |
| HPV-6 | 5’TCCGTAACTACATCTTCCA 3′ |
| HPV-11 | 5’TCTGTGTCTAAATCTGCTAC 3′ |
| HPV-16 | 5’CATTATGTGCTGCCATATC 3′ |
| HPV-18 | 5’TGCTTCTACACAGTCTCCT 3′ |
| HPV-31 | 5’GCAATTGCAAACAGTGATAC 3′ |
| HPV-33 | 5’TATGACTTTATGCACACAAGT 3′ |
| HPV-35 | 5’CTGCTGTGTCTTCTAGTGA 3′ |
| HPV-39 | 5’ATAGAGTCTTCCATACCTTC 3′ |
| HPV-42 | 5’TGGTGATACATATACAGCTG 3′ |
| HPV-43 | 5’TCTACTGACCCTACTGTG 3′ |
| HPV-44 | 5’TACTAGTGAACAATATAAGCA 3′ |
| HPV-45 | 5’TACACAAAATCCTGTGCCA 3′ |
| HPV-52 | 5’GAATACCTTCGTCATGGC 3′ |
| HPV-56 | 5’CAGAACAGTTAAGTAAATATG 3′ |
| HPV-58 | 5’ATTATGCACTGAAGTAACTAA 3′ |
用DNA合成仪合成探针，在特异探针末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，使其能够固化在芯片上，在DNA合成仪采用固相亚磷酰胺三酯法在每个HPV特异探针的3′末端加入20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸分子。使用Nunc点样仪按照预先设定好的顺序在带有正电荷的芯片进行点样。
使用罗氏公司生产的带有正电荷的芯片，使用Nunc点样仪按预先设定好的顺序进行点样，如图1、图2所示。
将点好的芯片放在UVP紫外交联仪内照射固定5分钟，使点样探针固定在芯片上，构成检测诊断芯片，把制作成的检测诊断芯片至于2-8℃条件下存放待用，如图1、图2所示。
设计HPV特异性引物和探针：为有效扩增各基因型HPV和提高灵敏度，采用2对24条链的组合套式引物设计。设计探针16个，包括HPV共用探针1个，区分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56和HPV58共计15种基因型，如图1、图2所示。
实施例7
取出获得杂交信号的芯片，整张芯片背景不着色，杂交信号呈棕黄色，特异杂交点与非特异杂交点之间的差别明显，通过点样区域模式图，比对查出HPV基因分型，如图1、图2所示。
按照临床标本处理、套式PCR扩增、芯片杂交、芯片洗涤、芯片显色和芯片杂交信号的判读进行检测。进行临床标本处理采用活检组织或石蜡标本或拭子标本。
套式PCR扩增分为两次进行，第一次PCR扩增包括标本处理上清液5微升、一次PCR反应混合液(含组合式上游外引物或下游外引物)44微升和Taq聚合酶1微升，总计50微升均匀混合。PCR循环条件为94℃预变性2分钟，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，进行35个循环，保持72℃延伸5分钟。
第二次PCR扩增是将第一次PCR产物5微升、二次PCR反应混合液(含组合式上游内引物和DIG-dUTP或者下游内引物和DIG-dUTP)44微升和Taq聚合酶1微升均匀混合。
PCR循环条件为94℃预变性2分钟，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，进行35个循环，保持72℃延伸5分钟，经过二次PCR扩增的PCR产物即制作成DIG标记的杂交探针。
将预先制作好的芯片装入杂交袋中，并在杂交袋中加入适量杂交液，把杂交袋封好，进行0.5--1小时的预杂交，加入5-20微升的变性探针，放入杂交箱内，再进行3-6小时的杂交，杂交箱温度为45℃。
在室温条件下用2×SSC/0.1％SDS洗涤芯片两次，每次2min，在46℃条件下用0.2×SSC/0.1％SDS洗的芯片两次，每次2min，然后用TNT溶液洗涤芯片5min。
将洗涤干净的芯片装入干净的塑料袋中，在塑料袋内加入10％封阻液100μl或TN 900μl，混合均匀，在37℃的条件下放置30min。
加入POD抗体1μl，轻轻混合均匀，在37℃的条件下放置30min；将芯片从塑料袋中取出用TNT漂洗芯片2次，每次3min。
将芯片放入干净的塑料袋中，取DAB显色液10μl、DAB稀释液10μl和灭菌水480μl，混合均匀后立即加到塑料袋中，待显色达到理想程度后(一般显色5-30分钟左右)，用1×PBS终止反应，获得芯片杂交结果，整张芯片背景不着色，杂交信号呈棕黄色，如图1、图2所示。
实施例8
临床标本处理采用活检组织，取50毫克活检组织加入DNA裂解液100微升混合均匀后进行研磨，研磨后进行55℃温浴1-3小时，再进行100℃煮沸10分钟，用12000rpm离心机离心10分钟，取5微升上清液用做PCR扩增模板，如图1、图2所示。
实施例9
临床标本处理采用石蜡标本，取3-5个石蜡标本切片进行脱蜡，加入DNA裂解液50微升，进行55℃温浴1-3小时，再进行100℃煮沸10分钟，用12000rpm的离心机离心10分钟，取5微升上清液用做PCR扩增模板，如图1、图2所示。
实施例10
临床标本处理采用拭子标本，拭子标本用生理盐水浸泡，用离心的方式收集细胞沉淀，加入DNA裂解液50微升，进行55℃温浴1-3小时，再进行100℃煮沸10分钟，用12000rpm离心机离心10分钟，取5微升上清液用做PCR扩增模板，如图1、图2所示。
Claims (6)
1.一种人乳头瘤病毒基因分型检测诊断芯片，其特征是芯片基质上设置探针，包括识别所有HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，用于区分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共计15种基因型，探针在芯片上微阵列排列，至少5个以上坐标点控制芯片的矩形点样区域，以坐标点控制芯片的矩形点样区域和点样方向，微阵列中一个角设置2个坐标点，为点样起始点，指示探针排列方向，微阵列的其他3个角上为1个坐标点，微阵列的纵列至少3列以上，微阵列的横行至少3行以上；每个HPV探针点样1个以上，通用探针是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15种基因型，排列方式由通用探针到各型探针由小数到大数依次排列，再加上阴性和阳性质控点，点阵数至少18点以上；PCR引物采用2对24条链的套式引物组合，其核苷酸序列如下表所示，
HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，包括HPV基因型HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共计15种基因型，各型探针序列如下表所示，
在特异探针末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，使其能够固化在芯片上，特定的聚核苷酸尾巴是在每个HPV特异探针的3′末端加入20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸分子；将点好的芯片放在紫外交联仪内进行照射5分钟，使探针完全固定在芯片上，构成检测诊断芯片，把构成的检测诊断芯片置于2-8℃条件下存放。
2.一种人乳头瘤病毒基因分型检测诊断芯片的制作方法，其特征是在芯片基质上设置探针，用微孔板放置点样探针和坐标标记，探针在芯片上矩形微阵列排列，包括识别所有HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，用于区分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共计15种基因型，探针在芯片上微阵列排列，至少5个以上坐标点控制芯片的矩形点样区域，以坐标点标示控制芯片的矩形点样区域和点样方向，微阵列中一个角设置2个坐标点，为点样起始点，指示探针排列方向，微阵列的其他3个角上为1个坐标点，微阵列的纵列至少3列以上，微阵列的横行至少3行以上；每个HPV探针重复点样2个，通用探针是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15种基因型，排列方式由通用探针到各型探针由小数到大数依次排列，再加上阴性和阳性质控点，点阵数至少18点以上；PCR引物采用2对24条链的套式引物组合，其核苷酸序列如下表所示，
HPV基因型的通用探针1个，HPV基因型特异探针15个，包括HPV基因型HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共计15种基因型，各型探针序列如下表所示，
用DNA合成仪合成探针，在特异探针末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，使其能够固化在芯片上，在DNA合成仪采用固相亚磷酰胺三酯法在每个HPV特异探针的3′末端加入20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸分子；使用Nunc点样仪按照预先设定好的顺序在带有正电荷的芯片进行点样；将点好的芯片放在UVP紫外交联仪内照射固定5分钟，使点样探针固定在芯片上，构成检测诊断芯片，把制作成的检测诊断芯片置于2-8℃条件下存放待用。
3.一种人乳头瘤病毒基因分型检测诊断芯片的检测方法，其特征是取出根据权利要求2制作的获得杂交信号的芯片，整张芯片背景不着色，杂交信号呈棕黄色，特异杂交点与非特异杂交点之间的差别明显，通过点样区域模式图，比对查出HPV基因分型；按照临床标本处理、套式PCR扩增、芯片杂交、芯片洗涤、芯片显色和芯片杂交信号的判读进行检测；进行临床标本处理采用活检组织或石蜡标本或拭子标本；套式PCR扩增分为两次进行，第一次PCR扩增包括标本处理上清液5微升、一次PCR反应混合液(含组合式上游外引物或下游外引物)44微升和Taq聚合酶1微升，总计50微升均匀混合；PCR循环条件为94℃预变性2分钟，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，进行35个循环，保持72℃延伸5分钟；第二次PCR扩增是将第一次PCR产物5微升、二次PCR反应混合液(含组合式上游内引物和DIG-dUTP或者下游内引物和DIG-dUTP)44微升和Taq聚合酶1微升均匀混合；PCR循环条件为94℃预变性2分钟，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，进行35个循环，保持72℃延伸5分钟，经过二次PCR扩增的PCR产物即制作成DIG标记的杂交探针；将预先制作好的芯片装入杂交袋中，并在杂交袋中加入适量杂交液，把杂交袋封好，进行0.5--1小时的预杂交，加入5-20微升的变性探针，放入杂交箱内，再进行3-6小时的杂交，杂交箱温度为45℃；在室温条件下用2×SSC/0.1％SDS洗涤芯片两次，每次2min，在46℃条件下用0.2×SSC/0.1％SDS洗的芯片两次，每次2min，然后用TNT溶液洗涤芯片5min；将洗涤干净的芯片装入干净的塑料袋中，在塑料袋内加入10％封阻液100μl或TN 900μl，混合均匀，在37℃的条件下放置30min；加入POD抗体1μl，轻轻混合均匀，在37℃的条件下放置30min；将芯片从塑料袋中取出用TNT漂洗芯片2次，每次3min；将芯片放入干净的塑料袋中，取DAB显色液10μl、DAB稀释液10μl和灭菌水480μl，混合均匀后立即加到塑料袋中，待显色达到理想程度后(一般显色5-30分钟左右)，用1×PBS终止反应，获得芯片杂交结果，整张芯片背景不着色，杂交信号呈棕黄色。
4.根据权利要求3所述的人乳头瘤病毒基因分型检测诊断芯片的检测方法，其特征是所述的临床标本处理采用活检组织，取50毫克活检组织加入DNA裂解液100微升混合均匀后进行研磨，研磨后进行55℃温浴1-3小时，再进行100℃煮沸10分钟，用12000rpm离心机离心10分钟，取5微升上清液用做PCR扩增模板。
5.根据权利要求3所述的人乳头瘤病毒基因分型检测诊断芯片的检测方法，其特征是所述的临床标本处理采用石蜡标本，取3-5个石蜡标本切片进行脱蜡，加入DNA裂解液50微升，进行55℃温浴1-3小时，再进行100℃煮沸10分钟，用12000rpm的离心机离心10分钟，取5微升上清液用做PCR扩增模板。
6.根据权利要求3所述的人乳头瘤病毒基因分型检测诊断芯片的检测方法，其特征是所述的临床标本处理采用拭子标本，拭子标本用生理盐水浸泡，用离心的方式收集细胞沉淀，加入DNA裂解液50微升，进行55℃温浴1-3小时，再进行100℃煮沸10分钟，用12000rpm离心机离心10分钟，取5微升上清液用做PCR扩增模板。
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