CN101487042B - Hpv高危和低危亚型分型dna微阵列芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种DNA微阵列芯片，特别是涉及人乳头瘤病毒(HPV)高危和低危亚型分型DNA微阵列芯片。采用固相载体基片，配合HPV各亚型的寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，可以高灵敏度、高特异性的一次性同时检测多个样本的HPV高危和低危型亚型，可以广泛应用于HPV病毒感染定性和分型检测。
Description
所属技术领域
本发明涉及一种DNA微阵列芯片，特别是涉及人乳头瘤病毒(HPV)亚型基因分型DNA微阵列芯片。采用固相载体基片，针对HPV各亚型的寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，可以高灵敏度、高特异性的一次性同时检测多个样本的HPV高危和低危亚型，可以广泛应用于HPV病毒感染定性和分型检测。
技术背景
人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是一种最小的DNA(脱氧核糖核酸)病毒。主要感染上皮细胞。到目前为止，已鉴定出HPV达80多个亚型，有资料报道为100种以上HPV亚型。HPV在人类感染率很高，自然人群中HPV感染率从低于1％到高达50％，性活跃人群中20％～80％以上的人有HPV感染史。
HPV感染最常见的部位之一是肛门外生殖器，引起肛门外生殖器尖锐湿疣，近年来，尖锐湿疣发病率逐年升高，目前已在性病属性传播疾病中排第二的位置，发病率仅次于淋病。是除艾滋病外对患者影响最大的传染疾病。
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，死亡率仅次于乳腺癌。我国患病人数和死亡人数均占全世界1/3，每年新发病例约有13万。在临床病理检查中，宫颈癌患者几乎100％的有高危型人乳头瘤病毒(HPV)的感染，可以肯定地说，HPV感染是宫颈癌患发的主要原因。宫颈癌是目前为数不多的已经明确了病因的癌肿，又是一种可预防、可治愈的疾病，关键在于早发现，治疗宫颈癌前病变，终止其向宫颈癌的发展。在女性体检中，开展HPV基因检测对宫颈癌的早期诊断具有重要的临床诊断和预防、治疗意义。因此2003年8月30日美国FDA将HPV基因检测作为妇女常规检测项目。我国近年临床上已经启动此项检测，部分经济发达省市有列入妇女常规体检和普查项目的计划。
HPV是一组病毒的总称，组成一个科，其病毒形态类似，但DNA限制性内切酶图谱各异，核壳体蛋白质的抗原性不同。目前已经确定的HPV型别大约有80余种，依其感染的上皮所在部位分为皮肤型HPV和生殖道上皮HPV，大约35种型别可感染妇女生殖道，约20种与肿瘤相关。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危险型别和高危险型别HPV，低危险型别HPV包括HPV6，11，32，34，40，42，43，54，MM8等型别，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变(CINI)，高危险型HPV包括HPV16，18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，83，MM4等型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CIN II/III)的发生相关，尤其是HPV16和18型。
鉴于以上HPV感染和危害情况，发明一种快速、高准确度、高通量的HPV分型检测产品具有重要意义。
由于HPV体外增殖非常困难，到目前为止尚无可靠的血清学分型方法。传统的方法是通过形态学和免疫学方法对其进行检测，如巴氏涂片法，液基薄层细胞学检查，阴道镜检查，组织病理学检查，电镜检查，发射免疫法和酶联免疫法测定血清抗体水平等。这些传统的HPV检测方法灵敏度和特异性均不好，存在较高的假阳性和假阴性率，并且不能分型。
近年来，随着分子生物学的发展，科学工作者采用现代分子生物学方法，包括核算杂交法、PCR法、荧光定量PCR法等进行HPV检测，但这些方法仍然存在灵敏度、特异性、通量等方面的问题，不能很好的适应临床要求。
本世纪90年代，诞生了基因微阵列芯片技术，该技术具有高通量、集约化、低成本、高准确性等特点，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，该技术为HPV基因分型检测提供了合适的解决办法。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种人乳头瘤病毒(HPV)全亚型基因分型DNA微阵列芯片。这种具有高通量、高准确性的DNA微阵列芯片，可以对HPV高危型和低危型进行全面分型检测。
本发明所采用的技术方案是：采用固相载体基片，配合针对HPV各亚型的寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，再配以特殊PCR系统，每张芯片可以一次性同时检测多个样本的HPV所有亚型。
本发明针对HPV不同型别的基因序列，设计一套特异性寡核苷酸探针(附表1)，采用自动点样机器人，将探针印制在一张玻片的特定区域，每张玻片印制10个微阵列矩阵，这样就制成DNA微阵列芯片，一张芯片可以检测10个样本，再配以其它必要的组份，如PCR引物(附表2)，组成完整的产品。实际检测时，取10份人基因组DNA溶液，采用CY3标记引物和不对称PCR方法，扩增出HPV基因组CY3标记靶标片段。取DNA微阵列芯片一张，在10个杂交区分别加入10种PCR产物2ul和杂交液8ul。将芯片放在自动杂交洗涤仪的杂交槽内，杂交温度设定为45℃，杂交时间30分钟，自动洗涤吹干。取出玻片，放入GenePix 4100A扫描仪进行扫描，使用分析软件对扫描图像信号进行图像数据转换处理，并分析产生样本型别结果。
本产品的片基载体可以是玻片、尼龙膜或其它可以附着探针的载体。
表1寡核苷酸探针序列以及所检测的型别
| 名称 | 序列(5’----3’) | 基因型别 | |
| PR1 | tgtgctgccatatctacttc | gaagtagatatggcagcaca | 16 |
| PR2 | cctgggcaatatgatgctac | gtagcatcatattgcccagg | 18 |
| PR3 | agtacattatctgcagcatc | gatgctgcagataatgtact | 26 |
| PR4 | gctgcaattgcaaacagtga | tcactgtttgcaattgcagc | 31 |
| PR5 | actagtgacagtacatata | tatatgtactgtcactagt | 33 |
| PR6 | ctagtgacagtacatataa | ttatatgtactgtcactag | 35 |
| PR7 | atagagtcttccataccttc | gaaggtatggaagactctat | 39 |
| PR8 | tatgaccctactaagttta | taaacttagtagggtcata | 45 |
| PR9 | ctgcggtttccccaacatt | aatgttggggaaaccgcag | 51 |
| PR10 | actttatgtgctgaggtta | taacctcagcacataaagt | 52 |
| PR11 | catgactctttccgcaacc | ggttgcggaaagagtcatg | 53 |
| PR12 | tagtactgctacagaacag | ctgttctgtagcagtacta | 56 |
| PR13 | ctgaagtaactaaggaagg | ccttccttagttacttcag | 58 |
| PR14 | ccaatctttctgtgtgtgc | gcacacacagaaagattgg | 59 |
| PR15 | catgactattaatgcagct | agctgcattaatagtcatg | 66 |
| PR16 | ctaataaatttaaggaata | tattccttaaatttattag | 68 |
| PR17 | actaatttttctgtatgtg | cacatacagaaaaattagt | 73 |
| PR18 | atattactatttcagctgc | gcagctgaaatagtaatat | 83 |
| PR19 | accattagcactgctgtta | taacagcagtgctaatggt | MM4 |
| PR20 | gtgcatccgtaactacatc | gatgtagttacggatgcac | 6 |
| PR21 | tgtgcatctgtgtctaaat | atttagacacagatgcaca | 11 |
| PR22 | tgtgctactgtaacaactg | cagttgttacagtagcaca | 32 |
| PR23 | acttttcagtttgtgtagg | cctacacaaactgaaaagt | 34 |
| PR24 | tgccacacagtcccccaca | tgtgggggactgtgtggca | 40 |
| PR25 | tgactttgtgtgccactgc | gcagtggcacacaaagtca | 42 |
| PR26 | gtacaaacttgacgttatg | cataacgtcaagtttgtac | 43 |
| PR27 | actaacctaacattgtgtg | cacacaatgttaggttagt | 54 |
| PR28 | attttactattagtgctgc | gcagcactaatagtaaaat | 84 |
表2引物序列
| 名称 | 序列(5’-3’) | 碱基数 |
| PH1 | TTTGTTACTGTIGTIGATACIAC | 23 |
| PH1-1 | GCACAGGGICAIAAIAATGG | 20 |
| PH2-1 | GAAAAATAAACTGTAAITCAIAITC | 25 |
| PH2-2 | AAATAAACTGCAAATCAIAITCITC | 25 |
| PH2-3 | GTTGAAAAACAAACTGTAIITCAIA | 25 |
| PH2-4 | CAAACTGTAAATCAAACTCTTCTGC | 25 |
| PH2-5 | AAATAAACTGCAAATCAAACTCCTC | 25 |
| PH2-6 | ATTGAAATATAAATTGCACATCATA | 25 |
以下结合附图说明本发明的具体实施。
附图说明
图1为HPV高危和低危亚型分型DNA微阵列芯片示意图
1芯片整体外观
2杂交区以及探针微阵列
图2为HPV 16型阳性扫描图
图3H为PV 18型阳性扫描图
图4为HPV 11型阳性扫描图
图5为HPV16、18混合型阳性扫描图
图6为HPV11、16型阳性扫描图
具体实施方式
本发明用下列实施例进行解释，目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
实施例一：
方法1：HPV高危和低危亚型分型DNA微阵列芯片PCR引物和探针的设计
在HPV基因组序列多态性比较集中的L区，设计和合成特异性PCR引物，5’端引物PH1，PH1-1，CY3标记；3’端引物P2-1，P2-2，P2-3，P2-4，P2-5，P2-6，引物序列见表2。采用多重不对称PCR一管扩增。
针对HPV L区各亚型基因序列的多态性特性，设计和合成亚型探针28对，另外设计阳性和阴性对照探针各一对。亚型分型探针序列，见表1。
方法2：HPV高危和低危亚型分型DNA微阵列芯片的制备
微阵列芯片制备需要每对探针的其中一条。采用基因芯片自动点样仪，将28条分型探针和两条对照探针的其中一条，点制到玻片的特定区域，制成DNA微阵列。
(1)点样探针溶液：将探针稀释到5×SSC、0.05％SDS溶液中，终浓度为30uM；
(2)点样矩阵：(如图1)将探针点制在玻片上，每个探针横向重复3点点制在杂交区内，每行9点，共10行，90个点；杂交区分成10个区，可以同时检测10份样本。
实施例二：使用本发明产品检测10份临床样本
取10份样本，提取病毒DNA，先进行DNA测序，测序结果如下：
| 样本号 | 测序结果(HPV型别) | 样本号 | 测序结果(HPV型别) |
| 01 | 16 | 06 | 阴性 |
| 02 | 18 | 07 | 阴性 |
| 03 | 11 | 08 | 阴性 |
| 04 | 16，18 | 09 | 阴性 |
| 05 | 11，16 | 10 | 阴性 |
采用本发明的HPV高危和低危亚型分型DNA微阵列芯片对以上10份样本进行一次性检测。取10管PCR反应液，分别加入10种样本DNA提取液，5ul/管，PCR循环参数为：94℃5’；94℃30”，50℃30”，72℃30”，45循环；72℃5’。
取一张微阵列芯片，分别取10种PCR产物各2ul加到芯片的10孔，再在各孔加入杂交液(5XSSC)8ul，芯片放到自动杂交洗涤仪的槽内，设定杂交温度50℃，杂交时间40分钟。杂交后自动洗涤和风干。
采用GnenPix4100A扫描仪，扫描杂交信号，得到杂交结果扫描图(见图2-图11)，并将图像转换成数据。
采用分析软件，将以上数据自动分析转换成为各个样本的基因型别，检测结果与样本测序结果完全相相符。见表3。
表3本次检测结果与样本测序结果的比较
| 样本编号 | 测序结果 | 本次试验结果 | 是否相符 |
| 01020304050607080910 | 16型18型11型16，18型混合11，16型混合阴性阴性阴性阴性阴性 | 16型18型11型16，18型混合11，16型混合阴性阴性阴性阴性阴性 | 是是是是是是是是是是 |
实施例说明了本发明产品在检测通量方面的优势(一次检测10个样本，可以同时检测所有高危和低危型别)和检测准确性方面的可靠性(检测结果与样本测序结果完全相符)。
序列表
<110>中山大学达安基因股份有限公司
<120>HPV高危和低危亚型分型DNA微阵列芯片
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
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TGTGCTGCCATATCTACTTC
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GCACACACAGAAAGATTGG
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TATTCCTTAAATTTATTAG
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TAACAGCAGTGCTAATGGT
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GTGCATCCGTAACTACATC
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GATGTAGTTACGGATGCAC
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TGTGCATCTGTGTCTAAAT
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>45
ACTTTTCAGTTTGTGTAGG
<210>46
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>46
CCTACACAAACTGAAAAGT
<210>47
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>47
TGCCACACAGTCCCCCACA
<210>48
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>48
TGTGGGGGACTGTGTGGCA
<210>49
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>49
TGACTTTGTGTGCCACTGC
<210>50
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>50
GCAGTGGCACACAAAGTCA
<210>51
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>51
GTACAAACTTGACGTTATG
<210>52
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>52
CATAACGTCAAGTTTGTAC
<210>53
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>53
ACTAACCTAACATTGTGTG
<210>54
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>54
CACACAATGTTAGGTTAGT
<210>55
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>55
ATTTTACTATTAGTGCTGC
<210>56
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>56
GCAGCACTAATAGTAAAAT
<210>57
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>57
TTTGTTACTGTIGTIGATACIAC
<210>58
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>58
GCACAGGGICAIAAIAATGG
<210>59
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>59
GAAAAATAAACTGTAAITCAIAITC
<210>60
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>60
AAATAAACTGCAAATCAIAITCITC
<210>61
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>61
GTTGAAAAACAAACTGTAIITCAIA
<210>62
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>62
CAAACTGTAAATCAAACTCTTCTGC
<210>63
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>63
AAATAAACTGCAAATCAAACTCCTC
<210>64
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>64
ATTGAAATATAAATTGCACATCATA
Claims (4)
1.一种人乳头瘤病毒(HPV)高危和低危亚型分型DNA微阵列芯片，该DNA微阵列芯片将28对寡核苷酸探针作为一组，点制在玻片上，配以8种引物以及常规组分，其特征在于所用的28对寡核苷酸探针序列分别为：
2.根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片，其特征还在于所使用的8种引物序列分别为：
PH1：5’-TTTGTTACTGTIGTIGATACIAC-3’
PH1-1：5’-GCACAGGGICAIAAIAATGG-3’
PH2-1：5’-GAAAAATAAACTGTAAITCAIAITC-3’
PH2-2：5’-AAATAAACTGCAAATCAIAITCITC-3’
PH2-3：5’-GTTGAAAAACAAACTGTAIITCAIA-3’
PH2-4：5’-CAAACTGTAAATCAAACTCTTCTGC-3’
PH2-5：5’-AAATAAACTGCAAATCAAACTCCTC-3’
PH2-6：5’-ATTGAAATATAAATTGCACATCATA-3’。
3.根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片，其特征还在于探针点样的载体是玻片、尼龙膜。
4.根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片，其特征是还在于DNA微阵列芯片用于临床HPV感染辅助诊断以及高危和低危型别分辨诊断。
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