CN103409553B - 一种用于高通量分型检测人乳头瘤病毒的基因芯片、试剂及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于高通量分型检测人乳头瘤病毒的基因芯片、试剂及其试剂盒,所述基因芯片包括:载体膜底基,固定于该底基上的探针,该探针为可分别与人乳头瘤病毒各种型别DNA特定片段杂交的核苷酸,该探针5’末端进行氨基标记,所述探针的核苷酸序列为所附序列表中探针核苷酸序列中的至少一条。本发明提供了用于检查人乳头瘤病毒各种型别的基因芯片,本发明同时包含一种可以快速、平行检测多种型别HPV,对大样本量进行高通量分析的检测试剂。
Description
技术领域
本发明技术领域涉及一种基因芯片技术;尤其是涉及一种检测人乳头瘤病毒(HPV)DNA的基因芯片及其试剂,还涉及一种利用本方法检测样本中HPVDNA各种型别的试剂盒。
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)是一类感染人类上皮细胞DNA病毒,根据HPV基因组E6、E7和L1区开放阅读框核苷酸序列同源性不超过90%的定义,已发现100多种HPV型,一些型别根据上述区域同源性在90%-98%且不超过98%的定义,还可进一步分为不同的亚型。
HPV可以引起人全身各部位的皮肤或者粘膜感染,导致多种上皮组织疾病,例如皮肤寻常疣,扁平疣,外生殖器的尖锐湿疣等。宫颈上皮组织长期感染的某些型别的HPV可能引起基因突变,导致感染部位发生癌变。没有HPV感染不可能导致宫颈癌,而有HPV感染不一定会导致疾病和宫颈癌。因为HPV感染大多数是一过性感染,即在感染后短期内靠自身免疫力转归,不会导致疾病,只有少数转为持续性感染,而且也可能存在反复性的感染,据统计,80%的女性一生有可能至少感染HPV一次。能够感染人类的泌尿生殖道的40多种HPV型别中,按照导致宫颈癌风险的高低将HPV分为高危型和低危型,高危型HPV可能导致妇女发生宫颈癌,主要包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、67、69、73、82等型别,低危性HPV主要引起尖锐湿疣,包括HPV6、11、40、42、43、44、54、55、57、61、71、81、83等型别。
由于HPV目前还不能进行体外培养,免疫学的抗体检测方法缺乏可靠一致的结果,HPV的检测主要依赖于细胞学和分子生物学的基因检测方法。细胞学检测方法在检查时发现感染HPV只能是引起细胞病变之后,而HPV的DNA检测,可以在细胞学异常出现之前发现HPV的存在,从而进行预防,减少发生疾病的风险。目前分子生物学检测HPVDNA的方法主要有:(1)以抗体捕获、核酸杂交和化学发光信号放大技术为基础的第二代杂交捕获(HCII)法;(2)以PCR技术为基础的检测方法。由于PCR技术的高灵敏性,后者的检测灵敏度高于前者。由于HPV各型之间的基因存在较大的变异,多数研究者采用位于HPV基因组相对保守的L1片段的简并引物扩增后,PCR产物经过电泳、杂交等检测方法确定HPV的存在。目前常用的简并引物包括GP5/GP6,MY11/MY09,SPF,PGMY11/PGMY09等等。上述引物在扩增HPV时,具有不同的HPV型扩增谱和不同的灵敏度。目前基于PCR对多种型别HPV的检测方法常用的反向点杂交法,在一张较大的膜条(几个厘米至十多厘米)或其他基质上附着HPV检测的DNA探针,存在膜条载体面积大、杂交体积大、杂交时间长、需要使用旋转杂交仪、操作复杂等缺点,这种方法不属于基因芯片的范畴,无法做到对更多型别的多指标大样本量进行平行的高通量的快检测。
生物芯片(biochip或bioarray)是采用能够并行处理生物样本中的多个信息的微处理单元形成的集合体,根据生物分子间特异相互作用的原理,将生物分子分析过程集成于芯片表面,从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。狭义的生物芯片概念是指通过不同方法将生物分子(寡核苷酸、cDNA、genomicDNA、多肽、抗体、抗原等)固着于硅片、玻璃片(珠)、塑料片(珠)、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的生物分子点阵。基因芯片和DNA微阵列技术是生物芯片的一个种类,采用以阵列方式设定在平面基质载体上形成能够并行处理生物样本中多个基因信息的微处理单元,它具有微型化和并行处理的特征,点阵排布点直径在500μm以内,相邻两个点的中心点间距在1000μm以内,点阵列用于检测基因分子。利用基因芯片技术可以实现多指标大样本进行各种基因的高通量分析。
发明内容
本发明的目的在于结合核酸扩增、DNA分子杂交、信号放大技术和基因芯片技术形成一种高通量检测多种HPV型别的新方法和试剂盒。在HPV基因L1区设计简并引物进行PCR扩增样本中的HPVDNA片段;设计特异性核酸探针,通过基因芯片点样仪,将各种探针点样在平面载体上很小面积上形成基因芯片微阵列;将扩增的PCR产物与探针在特指的微孔板装置承载的孔内(利用微孔板的48或96孔作为反应池)进行分子杂交,通过信号放大,经基因芯片阅读分析仪检测芯片给出的信号,可以检测多种HPV型(包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、67、69、73、82、6、11、40、42、43、44、54、55、57),达到快速灵敏和高通量的检测效果。
本发明所述的用于高通量分型检测人乳头瘤病毒的基因芯片,包括:
载体膜底基;
固定于所述底基上的探针,该探针包括可分别与人乳头瘤病毒各种型别的核苷酸杂交的人工合成核苷酸片段,所述探针的核苷酸序列为核苷酸序列表SEQIDNO.1至SEQIDNO.29所列所示,该探针还包括可与人beta珠蛋白基因特定片段PCR产物杂交的人工合成核苷酸片段(SEQIDNO.30);
该探针5’末端进行氨基标记,所述探针的核苷酸序列为所附序列表中所列核苷酸序列SEQIDNO.1至SEQIDNO.29中的至少一条。
本发明提供了用于检测人乳头瘤病毒各种基因型别的基因芯片,本发明同时包含一种可以快速、平行检测多种型别HPV,对大样本量进行高通量分析的试剂。
本发明针对人乳头瘤病毒,针对不同的HPV型别设计特异性的探针,固定在在微型化的基因芯片阵列上,在特定杂交条件下进行DNA分子杂交。
附图说明
图1所示为HPV基因芯片探针点样矩阵示意图;
图2所示为本发明HPV基因芯片微阵列的制备流程;
图3所示为本发明HPV基因芯片微阵列点样扫描图的一部分(5×5矩阵);
图4-1所示为HPV基因芯片质控点和阴性对照显色模式图;
图4-2所示为HPV基因芯片质控点和阴性对照实例图;
图5-1所示为HPV基因芯片质控点和阳性对照显色模式图;
图5-2所示为HPV基因芯片质控点和阳性对照实例图;
图6-1所示为检测样本时出现HPV16阳性实例图;
图6-2所示为检测样本时出现HPV18阳性实例图;
图6-3所示为检测样本时出现HPV16、18、39混合型阳性实例图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明的针对各个型别HPV的引物采用简并引物设计、针对各个型别和个别亚型的特异性探针的序列在HPV基因组L1区、针对人珠蛋白基因的引物和特异性探针序列如附表所示。
PCR反应的引物组合:正向引物1和反向引物1为一对,正向引物2和反向引物2为一对,可分别进行PCR,在引物的5’端双向或单向标记Biotin,其中:R代表A或G;M代表A或C;W代表A或T;S代表G或C;K代表G或T;Y代表C或T;V代表A或C;H代表A或C或T;D代表A或G或T;N代表A或G或C或T。
本发明通过下述步骤来实现:(1)样本中HPV基因组DNA的提取;(2)HPV基因组DNA特定片段的PCR扩增和生物素标记;(3)通过基因芯片点样仪将探针点样和固定在载体上;(4)PCR产物与微孔板内基因芯片载体上的HPV探针杂交;(5)清洗后进行酶标反应和检测信号;(7)结果的判断。
上述方法(1)所用的样本为棉签试子或者专用毛刷刮取的宫颈脱落细胞样本,或者宫颈组织切片。上述方法(1)所用的DNA提取方法为煮沸裂解法。
上述方法(2)的PCR扩增采用的引物位于HPV基因组DNA的L1区域的保守区中,上述优化的PGMY09/11的引物对,其PCR产物的长度在460bp左右,PCR产物较长。本发明旨在设计更短的PCR产物,以提高PCR效率和杂交效率。HPV正向引物SEQIDNO.31、SEQIDNO.32、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34和HPV反向引物SEQIDNO.35、SEQIDNO.36、SEQIDNO.37、SEQIDNO.38、SEQIDNO.39,产生的PCR产物根据各个型别的基因组序列,在164-173bp之间,所有反向引物的5’末端均有生物素标记。在HPV正向引物与反向引物之间的正链上设计针对二十九种HPV型别的正向的探针SEQID.1至SEQID.29,引物和探针序列见所附序列表。
上述方法(3)所采用的探针固定方法包括用于载体活化的试剂为双功能活化交联试剂,如1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚(EDC);浓度为0.1-100mM。所采用的探针序列位于正向引物和反向引物之间;探针的5’端带有氨基修饰;探针浓度为0.5μM-5.0μM。通过压电式生物芯片点样仪(Healthdigit2003)将HPVDNA探针点样在尼龙膜条平面载体上(6.4mm×6.4mm),每个探针点的直径在100-200μm之间,每个点的间距在500-600μm之间,形成基因芯片微阵列。
上述方法(4)所采用的PCR产物杂交方法包括:取10-40μlPCR产物加入10-50μl的碱变性液(0.2-1MNaOH)进行碱变性,变性时间为10分钟;变性结束后加入100-160μl杂交中和液,杂交中和液为含4-6×SSC、0.01-0.02MPB缓冲液、0.1-0.5%BSA和0.1-0.5%SDS的溶液;杂交反应在42-65℃进行30-40分钟。
上述方法(5)所采用的信号放大的方法可以是辣根过氧化物酶标记的亲和素介导的酶底物放大反应;作为酶底物的可以是TMB或POD;也可以是由辣根过氧化物酶标记的亲和素介导的化学发光信号放大系统,发光底物为鲁米诺(Luminol)。还可以是碱性磷酸酶标记的亲和素介导的底物放大反应,所采用的底物可以是4-MUP或者pNPP底物。
上述方法(6)所采用的判断方法采用检测信号值与Cutoff值(Cutoff值等于11)比较的方法进行;信号值大于或等于Cutoff值,检测结果判为阳性;低于Cutoff值判为阴性。
本发明采用上述方法制备的检测试剂盒组份包括(1)包含有探针固定的基因芯片,固定的探针可检测多种HPV型,在48-96孔板内的方形小孔中进行杂交反应;(2)样本DNA提取液;(3)碱变性液;(4)中和杂交液;(5)PCR混合物;(6)TaqDNA聚合酶;(7)浓缩洗涤液;(8)酶结合物;(9)显色液A;(10)显色液B;(11)终止液;(12)阳性对照;(13)阴性对照。
本发明采用改良的L1区的简并引物对,可扩增大多数型别的HPVL1片段的PCR产物,采用基因芯片技术,探针载体膜的面积可以是1.0cm2以下,最小可以只有0.4cm2,并可同时固定多条探针,将基团芯片放入48或96孔微孔内作为反应池,达到快速、灵敏和高通量检测多种HPV型的效果。由于本发明在PCR扩增,杂交,洗涤,显色反应等方面进行了一系列优化,能够提供一种检测二十九种HPV基因型(包含HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、67、69、73、82、6、11、40、42、43、44、54、55、57)的试剂盒。
实施例1:HPV基因芯片微阵列的制备
实施例1例举了HPV基因芯片微阵列的制备方法,图1为每个基因芯片中HPV探针和对照点探针的排列矩阵,每个点的直径在150μm,每个点中心间距为500μm,芯片的点样流程见图2,将PallBiodyneC膜裁剪为每张膜条24cm×20cm大小,用EDC进行前处理后,用0.1M的磷酸缓冲液(pH7.4)分别配制序列表所列SEQIDNO.1至SEQIDNO.30的探针点样液,探针浓度在0.2μM-5μM,使用HeathDigit2003生物芯片点样仪将探针按照图1中HPV芯片微阵列矩阵排列方式,喷点在面积为6.4mm×6.4mm芯片内,图3举例示意喷点后的微阵列扫描图的一部分(5×5矩阵),每张膜条至少可以点上936个芯片(36×26矩阵),点样液使用黄色染料来跟踪判断芯片矩阵每个探针点是否完整,没有漏点。
实施例2:使用人乳头瘤病毒分型检测试剂盒(基因芯片法)(以下简称“HPG”试剂)进行样本检测实验
【产品名称】通用名:人乳头瘤病毒分型检测试剂盒(基因芯片法)
【包装规格】48测试/盒
【检验原理】
本试剂盒采用基因芯片检测技术。利用微量点样技术,将HPV型特异性探针点样于基因芯片基质上,制成基因芯片;经过对样本中的DNA进行PCR扩增、杂交和显色,通过HPV分型基因芯片检测阅读系统自动采集图像并分析和报告检测结果。试剂盒的主要成分和检测过程举例如下:
【主要组成成分】
本试剂盒由A盒和B盒组成(见表1);A盒包括5种PCR相关组份,B盒包括9种杂交显色相关组份。在有效期内不同批号试剂盒中各组份可以互换。HPVPCR反应液中包含序列表所列HPV正向引物1-4(SEQIDNO.31至SEQIDNO.34)和HPV反向引物1-5(SEQIDNO.35至SEQIDNO.39,HB=F引物SEQIDNO.40和HB-R引物SEQIDNO.41)。正向引物和反向引物的比例为1:2(0.2μM:0.4μM)为最佳,提高5’-Biotin标记PCR产物的比率。利用简并引物的原理,适当降低复性温度至52℃,使所有29个型别HPV都能够产生PCR产物,从而能够被本发明所述的基因芯片分别单个型别或多个型别的平行进行检测。
表1主要组成成分
【储存条件及有效期】
1储存条件
A盒-20℃保存,B盒2-8℃保存。
A盒组份应避免反复冻融,B盒内显色液B应避光保存。
2有效期
未开封产品有效期为12个月。
已开封产品建议1个月内用完。
【适用仪器】
普通PCR扩增仪
HPV分型基因芯片检测阅读系统
【样本要求】
标本类型生殖道脱落细胞(如宫颈口、尿道口等部位脱落细胞)。
将采样棉拭子(或宫颈刷)浸入盛有1ml无菌生理盐水的样本管中,充分漂洗。将棉拭子(或宫颈刷)贴壁挤干后丢弃,立即送检。
标本保存采集的标本应尽快送检,建议标本4℃保存不超过24小时,-20℃保存不超过6个月,需要长期保存的标本应置于-70℃保存,避免多次冻融。
已经提取好的样本DNA,可直接进入如下2.1的步骤进行PCR扩增。
【检验方法】
1样本处理
1.1标本预处理
取出待处理标本,振荡混匀;置离心机中以13,000rpm离心5分钟;弃上清,保留沉淀物。-20℃保存的标本,应置室温自然解冻后再使用!
1.2DNA提取
1.2.1准备2个离心管,分别加入阴性对照和阳性对照各5μl。
1.2.2分别向上述对照品管及1.1项标本管加入50μlHPVDNA提取液,振荡混匀;然后沸
水浴(或干浴)10分钟。
1.2.3将上述样本管置离心机中,13,000rpm离心10分钟,保留上清液(DNA样品),备用。
1.3DNA样品保存
建议DNA样品立即用于PCR检测,否则4℃保存;当天不检测的样品,-20℃保存。
2PCR扩增
2.1PCR反应混合液配制
根据待检测总样本数(包括对照品和临床标本)和表2,配制PCR反应混合液。
实际计算用量时应计入损耗量。
将PCR反应混合液混匀并短暂离心后,按每管28μl分装至各PCR反应管中。
表2PCR反应混合液配制
组份 | HPVPCR反应液 | Taq/UNG |
单份用量(μl) | 27.6 | 0.4 |
2.2加样
取2μl待测DNA样品分别加至上述PCR反应管中。盖紧管盖,混匀并短暂离心,立即用于检测。-20℃保存的DNA样品,应在用前取出,置室温自然解冻并混匀后,13,000rpm离心1分钟,取上清用于检测!
2.3PCR扩增
将待检测反应管小心置于PCR扩增仪中,按表3要求设置PCR扩增参数。
表3PCR扩增参数设置
3DNA杂交
3.1准备
3.1.1准备试剂
将杂交中和液及洗液B置55℃预热。
3.1.2准备湿盒
建议制作方法:用适当大小(不小于20cm×15cm×10cm)的带盖塑料盒,内置吸水纸,加水浸湿,以无流动水为宜,55℃预热。
注意:在基因芯片的温育操作中必须用湿盒保湿,切忌湿盒干燥!
3.1.3基因芯片定位
小心转移基因芯片至96孔板内,按正位摆放在芯片孔内。(正位指芯片水平放置、黑色定位点面朝上,定位点正对孔内左下角。芯片孔指已定位芯片的孔位)。
转移芯片时应避免器械接触芯片中心区及污损芯片!
3.2预杂交
向各芯片孔中加入100μl洗液B,55℃温育15分钟;吸干孔内液体。
3.3变性
取30μl变性液加至PCR产物管中,轻微摇动混匀,静置10分钟。
3.4中和与杂交
向各芯片孔中分别加入100μl杂交中和液和变性的PCR产物(约60μl),轻微摇动混匀。
55℃温育30分钟,吸干孔内液体。
3.5清洗
向各芯片孔中加入150μl洗液B,轻微摇动漂洗3分钟,吸干孔内液体;重复2次。
注意:应使芯片孔内温度不低于20℃,否则影响清洗效果!
4显色
4.1准备试剂
4.1.1将洗液A和显色液B置37℃预热。
4.1.2配制酶标工作液
按表4要求,用洗液A将酶标原液稀释为酶标工作液,配制方法见表4。
实际计算用量时应计入损耗量。
表4配制酶标工作液
用量 | 酶标原液 | 洗液A |
1份检测用量 | 1μl | 100μl |
24份检测用量 | 24μl | 2.4ml |
4.2酶标
取100μl酶标工作液,加至3.5项的芯片孔内,37℃温育30分钟;吸干孔内液体。
4.3清洗
加入150μl洗液A,轻微摇动漂洗3分钟,吸干孔内液体;重复1次。
加入150μl洗液C,轻微摇动漂洗3分钟,吸干孔内液体。
应使芯片孔内温度不低于20℃,否则影响清洗效果!
4.4显色
分别加入50μl显色液A和50μl显色液B,轻微摇动混匀,室温显色5分钟。
吸干孔内液体,加入150μl洗液C,静置约1分钟,吸干孔内液体。
4.5风干
45℃风干。注意:请确认风干后检测。
5检测与分析
检查确认芯片孔内基因芯片均为正位,用HPV分型基因芯片检测阅读系统对基因芯片检测并分析。
【参考值】
检测结果(INS)的参考值为11.0。
参考值的确定方法:统计HPV阴性标本的检测INS值,按平均值+3倍标准差确定参考值。
【检验结果的解释】
1质量控制
1.1基因芯片点阵说明
基因芯片的探针点阵共包括35个点。点阵模式图见图1,基因芯片点阵说明见表5。
表5基因芯片点阵说明
1.2质控品检测结果
1)阴性对照结果应为HPV阴性(图4-1和图4-2)并且2个HB点阳性;
2)阳性对照结果应为HPV16型阳性(图5-1和图5-2)并且2个HB点阳性;
如果检测结果不符合上述要求,则本次检测结果无效。
1.3质控品异常分析及处理
1)3个阳性定位点中一个或多个缺失或者不显色,检测结果无效,应重新检测。
2)标本的检测结果中,定位点正常而HB点和所有HPV检测点均为阴性,表明样本中可能含有PCR抑制成分,应将原DNA样品适当稀释后再检测。
3)阴性对照或阳性对照结果不符合质控要求,应检查操作或试剂是否正常。
2结果判断
HPV分型基因芯片检测阅读系统可自动检测INS值,并分析和报告结果,报告结果如下:
1)INS<11.0:HPV阴性;
2)INS≥11.0:HPV阳性,并报告HPV型别(本试剂盒检测29种HPV型中的一种或多种)。
举例说明检测样本中HPV型别的实例图3例(图6-1、图6-2、图6-3)。
实施例2针对HPV44、HPV33检测探针序列优化
1.对HPV44探针的优化
在实验过程中发现最初设计的HPV44探针(F20)出现对HPV40型PCR产物的交叉反应,经序列比对分析,经重新设计2个探针(20F-1、20F-2),将新探针设计的序列向正向引物方向移动,以减少对HPV40的交叉反应(表6)。经实验对比,F20与HPV40型PCR产物及HPV44型PCR产物均发生明显的显色反应,而20F-1、20F-2两个新设计的探针均与HPV44型PCR产物发生明显的显色反应,不与HPV40型PCR产物发生交叉反应,但20F-1与高浓度的HPV68型PCR产物有微弱的显色反应,显示20F-2特异性优于20F-1,20F-2即为所附序列表中的SEQIDNO.20HPV44探针。经过多次点样实验确定20F-2点样浓度选择0.4uM较佳。
表6HPV44探针的优化
2.对HPV33探针的优化
在实验过程中发现最初设计的HPV33探针(F4)出现对HPV35型PCR产物的交叉反应,经重新设计2个探针(F4-1、F4-2)和实验对比(表7),F4与HPV33型PCR产物及HPV35型PCR产物均发生明显的显色反应。而F4-1、F4-2两个新设计的探针均与HPV33型PCR产物发生显色反应,不与HPV35型PCR产物发生交叉反应,但F4-2的显色强度高于F4-1与HPV33型PCR产物的显色反应,提示F4-2特异性和灵敏度优于F4-1,经过多次点样实验确定F4-2点样浓度选择0.5uM较佳,F4-2即为附表序列标准HPV33探针。经过探针优化,消除了这2个型别的交叉反应,保证了探针的特异性。
表7HPV33探针的优化
实施例4与国际上通用的HPV检测方法对比
1.与DigeneHC2比较的结果
DigeneHC2即美国Digene公司的二代杂交捕获法,包括两组探针,可分别检测13种高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)和5种低危型(6、11、42、43、44),是美国FDA最早批准的HPVDNA检测产品,被业界公认为“金标准”,国内引进的主要是检测13种高危型的HC2试剂,为简便起见将表本发明的基因芯片检测试剂盒简称为“HPG”,以下为HPG与HC2(高危)的对比检测结果:(说明:以下表中样本序号为针对来源重新编码,非原始 序号)。2种方法基因分型比较结果划分为以下5组:
1)HR:分型结果为HC2对应13种高危型的1种或几种,未检出低危型;
2)LR:分型结果为其他16种基因型的一种或几种,未检出HC2对应13种高危型;
3)HR/LR:高/低危型混合感染,即至少包含HC2对应13种高危型的一种和其他16种基因型的一种;
4)-ve:HB检测正常,HPV检测阴性;
5)Nil:HB及HPV检测均为阴性,可能源于样本DNA量不足或提取的DNA中含有PCR抑制成分,这部分样本在统计时将被舍弃。
由于HC2将13种主要高危型作为一个整体检测而不具体分型,结果统计时我们将HPG结果为1)HR或3)HR/LR认为与HC2阳性一致;与此对应,将HPG结果为2)LR或4)-ve的记为与HC2阴性一致,临床结果中所有不一致样本及其结果以黑体显示。
SZ1232例样本中29例样本因样本量不足或可能含PCR抑制剂被排除(HB、HPV均为阴性),有效样本有48例为HC2阳性(表8,29例HB、HPV均为阴性的样本和HC2、HPG均为阴性的样本未列出),统计灵敏度为86.3%(139/161),特异性为90.5%(38/42),总符合率为87.2%(177/203)(kappa=0.66表9)。
表8.HPGvsHC2样本测试结果对比(SZ1)
表9.HPGvsHC2(SZ1)
2.与瑞士罗氏公司的LinearArrayHPVgenotypingtest试剂盒(以下简称LA)对比和兼容性样本的验证
瑞士罗氏公司的LinearArrayHPVgenotypingtest试剂盒(以下简称LA)能对37种HPV型(6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、45、51-56、58、59、61、62、64、66、67、68、69、70、71、72、73(MM9)、81、82(MM4)、83(MM7)、84(MM8)、IS39、89(CP6108))进行分型检测。
以下为对41例样本进行人乳头瘤病毒分型检测试剂盒(基因芯片法)与LA试剂盒对照试验的结果(表10),与LA试剂盒相比HPG产品无法检测HPV61、62、64、70、71、72、81、83、84、IS39、89(CP6108),计11个型,HPG独有的型包括HPV43、44和57(3个型)。统计时仅计算两种方法共有的26个型。
表10、HPGvsLA临床测试结果及分型一致性判断
说明:
表1表10中下划线部分为非共有基因型(即只为HPG或LA某一种方法之一检出),不纳入统计。Mix=33/35/52/58,由于知识产权限制,LA试剂盒不能直接检测HPV52,膜条上有一条带为33/35/52/58混合点样,如果样本33、35、58均为阴性而混合带为阳性则判断为52阳性。
将两种方法检出基因型完全相同的定义为“一致(concordant)“;至少一个基因型相同的定义为“兼容(compatible)”;如基因型无一对应则定义为“不一致(disconcordant)”。根据以上分类原则,两种方法比较没有“不一致”的结果;24例样本(58.5%)基因型完全一致,17例样本为“兼容(compatible)”结果。
对17例出现兼容(compatible)结果中出现的型别,分别进行相应的型特异性PCR并委托上海英骏生物技术有限公司广州分公司对PCR产物进行DNA测序,结果见表11。
表11兼容样本验证结果
对17例出现兼容(compatible)结果中出现的型别,分别进行相应的型特异性PCR及DNA测序,HPG分型完全正确的有8例,LA分型完全正确的有7例,另有2例二者均不正确。
综上所述:41例样本中,两种方法比较没有“不一致”的结果;24例样本(58.5%)基因型完全一致(包括20例高危单型感染,HPV53、11感染各1例,阴性2例);17例样本为“兼容(compatible)”结果:型特异性PCR及DNA测序验证显示,HPG分型完全正确的有8例,LA分型完全正确的有7例,另有2例二者均不正确。
对单型样本的检测结果两种产品有较高的一致性,多型的结果多数并非完全一致而被划归“兼容(compatible)”。除了PCR引物可能存在偏好外,如果某一基因型DNA含量远高于其他型,竞争的结果往往是模板量较少的基因型无法获得有效扩增,从而难以被检出。此外取样误差(即使是取自同一份均一样本)也可能导致弱阳性样本无法被检出。HPG与LA在设计上的差异导致灵敏度不同也可引起检测结果的差异:LA使用的PGMY09/11引物对通过5条上游引物和13条下游引物扩增获得约450bp的产物,退火温度为55°C,HPG使用改良的上游引物和下游引物,其产物更短,退火温度也相对更低(52°C)。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.用于高通量分型检测人乳头瘤病毒的基因芯片,其特征是,包括:载体膜底基,
固定于所述底基上的探针,该探针包括分别与人乳头瘤病毒各种型别的核苷酸杂交的人工合成核苷酸片段,以及与人beta珠蛋白基因特定片段PCR产物杂交的人工合成核苷酸片段,所述探针的核苷酸序列为SEQIDNO.1至SEQIDNO.30所列;该探针5’末端进行氨基修饰。
2.如权利要求1所述的用于高通量分型检测人乳头瘤病毒的基因芯片,其特征是:所述的载体膜底基面积为0.4-1.0cm2。
3.用于高通量分型检测人乳头瘤病毒各种基因型的检测试剂,其特征是,该检测试剂至少包括:权利要求1中所述的用于高通量分型检测人乳头瘤病毒的基因芯片;从待测样本中扩增人乳头瘤病毒各型DNA片段的引物对,人乳头瘤病毒正向引物SEQIDNO.31、SEQIDNO.32、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34和人乳头瘤病毒反向引物SEQIDNO.35、SEQIDNO.36、SEQIDNO.37、SEQIDNO.38、SEQIDNO.39;用于扩增样本中的人beta珠蛋白基因的PCR引物对,人beta珠蛋白基因正向引物SEQIDNO.40和人beta珠蛋白基因反向引物SEQIDNO.41。
4.如权利要求3所述的用于高通量分型检测人乳头瘤病毒各种基因型的检测试剂,其特征是,所述人乳头瘤病毒反向引物的5’末端均有生物素标记。
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