CN104232803B

CN104232803B - 检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的基因芯片以及试剂盒

Info

Publication number: CN104232803B
Application number: CN201410513810.7A
Authority: CN
Inventors: 文心田; 曹三杰; 黄小波; 赵松; 文翼平; 伍锐; 邓静; 尹人杰; 张仙; 常晓霞
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2014-09-29
Filing date: 2014-09-29
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2034-09-29
Also published as: CN104232803A

Abstract

本发明公开了一种检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的基因芯片和试剂盒。本发明基因芯片和检测试剂盒可以准确、有效的检测鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，应用前景良好。

Description

检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的基因芯片以及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的基因芯片以及试剂盒。

背景技术

随着我国养禽业集约化程度的不断提高，各类疾病的发生也呈逐年上升的趋势。我国禽病防治的总体水平不高，禽病的发生和危害仍然十分严重，据不完全统计，目前危害我国养禽业生产的疾病达80余种，其中传染病约占禽病总数的75％，危害严重。同时禽病的发生也出现新的特点，如新的传染病不断出现；新发生禽病的种类增多；传染病发病的非典型化和病原出现新的变化；混合感染和复合症使疾病更为复杂等。

鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡传染性喉气管炎这3种病在我国和许多国家地区广泛流行，受病毒侵袭的鸡群会引起大批死亡，耐过的生长发育缓慢，淘汰率增高，并干扰其它疫苗的免疫力，使鸡易继发感染其它疾病，而造成严重的经济损失。这3种病的共同特征都能引起呼吸道症状，而且症状十分相似，在临床诊断中很难准确判断，也极易与其它呼吸道病如禽流感、慢性呼吸道病等相混淆。现有的禽病检测或监测技术均存在不可克服的局限，如对疫病的混合感染、隐性感染及疫苗毒和野毒的区分等，在检测时均存在一定的困难。同时对于多种疫病的混合感染需要同一种方法或不同方法多次进行检测，因此有必要加强对动物疫病检测或监测新型技术的研究。

目前，对这3种病的诊断一般采用病原分离鉴定和常规的血清学方法，但这些方法存在操作繁杂、费时费力、敏感性较差等不足。特别是当鸡群存在鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡传染性喉气管炎等多种病毒感染时，难以应用这些传统方法进行快速检测和鉴别诊断，在一定程度上影响了对这些疫病的有效防制。最近国内外均建立了PCR/RT-PCR检测方法，以及多重PCR检测方法，但是还不能满足更加快速、准确的检测多种病原混合感染的要求。因此，有必要建立DNA微阵列检测技术对鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性喉气管炎病毒进行鉴别诊断，建立快速、准确的早期诊断和检测方法，以便尽快采取有效的针对性防治措施，减少这些疾病对养禽业造成的损失。用DNA微阵列检测技术对鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性喉气管炎病毒进行鉴别诊断的方法是十分必要的，具有重要的现实意义。

分子生物学理论和技术的发展，特别是基因芯片有高通量、多样性、微型化和自动化的特点，这些特性使它上面的信息能快速准确地被读出，对样品的量要求很少，节约试剂和成本，处理速度大大加快，在对各种病原体的检测中，病原体基因的检测和分析是最可信的，而基因芯片技术能对各种病原体的RNA进行定性和定量的分析，从而帮助临床医生对感染的种类和感染的程度进行分析。

公开号为1616679和1616678的专利申请分别公开了检测包括鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒等10种或9种病毒的基因芯片，但是该文件中没有芯片的特异性和灵敏度试验，不能说明其可以特异且灵敏地同时检出鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种特异强、灵敏度高可同时检测检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的新的基因芯片和试剂盒。

本发明检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的基因芯片，它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQIDNO：1～2所示任意一个或者两个基因片段，SEQIDNO：3～4所示任意一个或者两个基因片段以及SEQIDNO：5～6所示任意一个或者两个基因片段。

基因芯片，又叫DNA微阵列，是指指通过不同方法将生物分子(寡核苷酸、cDNA、genomicDNA、多肽、抗体、抗原等)固着于硅片、玻璃片(珠)、塑料片(珠)、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的生物分子点阵，其突出的特点是微型化、集成化、平行化和高通量。

其中，所述基因芯片还包括或定位探针，定位探针是SEQIDNO：19所示的基因片段。

本发明检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的试剂盒，它包括前述的基因芯片与扩增鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒基因的试剂，其中，扩增鸡新城疫病毒基因的试剂包括SEQIDNO：7～8和/或SEQIDNO：9～10所示引物对；扩增鸡传染性支气管炎病毒基因的试剂包括SEQIDNO：11～12和/或SEQIDNO：13～14所示引物对；扩增鸡传染性喉气管炎病毒基因的试剂包括SEQIDNO：15～16和/或SEQIDNO：17～18所示引物对。

所述试剂盒还包括SEQIDNO：20～21所示引物对。

所述引物对中，SEQIDNO：7、15、17所示上游引物与SEQIDNO：8、16、18所示下游引物的摩尔比为1：10；SEQIDNO：9、11、13所示上游引物与SEQIDNO：10、12、14所示下游引物的摩尔比为1：20。

所述上游引物标记有荧光染料。

所述试剂盒还包含有胶体金。

胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。

本发明胶体金按照下述方法制备：取200mL灭菌超纯水和2mL1％HAuCl4混于500ml大烧杯中，而后量取20mL分装于编号1-10的10个50mL小烧杯中，使用加热磁力搅拌器将分装的胶体金溶液依次加热5min，快速加入1％柠檬酸三钠溶液，加入量分别为0.1mL，0.2mL，0.24mL，0.28mL，0.32mL，0.36mL，0.4mL，0.6mL，1.0mL，1.2mL。颜色由浅黄迅速变为黑色再变为红色时，再持续搅拌10min停止，等溶液冷却至室温，用硝酸纤维薄膜过滤，即可得到所需胶体金。

本发明提供了SEQIDNO：7～8、SEQIDNO：9～10、SEQIDNO：11～12、SEQIDNO：13～14、SEQIDNO：15～16和SEQIDNO：17～18所示引物对以及SEQIDNO：1～6所示基因片段。

本发明还提供了SEQIDNO：1或2所示任意一个或者两个基因片段，SEQIDNO：3或4所示任意一个或者两个基因片段与SEQIDNO：5或6所示任意一个或者两个基因片段在制备检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的基因芯片中的用途。

所述基因芯片还包括定位探针，定位探针是SEQIDNO：19所示的基因片段。

本发明还提供了SEQIDNO：7～8和/或SEQIDNO：9～10所示引物对、SEQIDNO：11～12和/或SEQIDNO：13～14所示引物对与SEQIDNO：15～16和/或SEQIDNO：17～18所示引物对在制备同时扩增鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的试剂中的用途。

本发明还提供了SEQIDNO：7～8和/或SEQIDNO：9～10所示引物对、SEQIDNO：11～12和/或SEQIDNO：13～14所示引物对以及SEQIDNO：15～16和/或SEQIDNO：17～18所示引物对，与SEQIDNO：1～2所示任意一个或者两个基因片段、SEQIDNO：3～4所示任意一个或者两个基因片段以及SEQIDNO：5～6所示任意一个或者两个基因片段在制备检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的试剂盒中的用途；其中，引物对为扩增试剂；SEQIDNO：1～6为检测探针。

本发明基因芯片可以有效检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，特异性强，敏感性高，各病毒样品的最低检测浓度为1.8×10⁴拷贝/μL(0.2pg/μL)，耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1多重PCR体系1电泳情况。M：100bpLadderDNAMaeker；1：NDV-F；2：IBV-N；3：ILTV-gB；4：多重PCR；

图2多重PCR体系2电泳情况。M：100bpLadderDNAMaeker；1：NDV-HN；2：IBV-M；3：ILTV-TK；4：多重PCR；

图3DNA微阵列的矩阵排列情况；

图4胶体金的影响结果；

图5特异性实验结果；

图6灵敏度实验结果；

图7稳定性实验结果。

具体实施方式

一、实验材料和仪器

菌株：ILTV标准株、NDVLaSota株、IBVH120株均购自中国兽药监察所。

主要试剂与培养基：Omega质粒提取试剂盒，购于Omega生物技术公司；2×TaqPCRMasterMix、反转录试剂盒、总RNA提取试剂盒、天根DNA提取试剂盒和100bpDNALadder；Amp：取1gAmp溶解于10mL灭菌超纯水中浓度为100mg/mL；液体LB培养基：胰蛋白胨2.0g，氯化钠2.0g，酵母浸出物1.0g，完全溶于180.0mL超纯水后，用NaOH调节pH＝7.2，定容到200mL，高压灭菌30min，冷至55℃左右，100mLLB加100ul的Amp，4℃保存；固体LB培养基：向100mL的LB加1.5g的琼脂粉，高压灭菌后冷至55℃左右，加入100uL的100mg/mLAmp，倒入平板中，4℃保存备用；50×TAE：0.5mol/LEDTA50.0mL，冰醋酸28.55mL，Tris121.0g，用氢氧化钠调节pH＝8.0，定容到500mL。氨基基片：氨基载玻片，点样缓冲液：点样缓冲液，均购自上海百傲生物工程有限公司。Cy3-dCTP购于美国Amersham公司；100×Denhardt：牛血清白蛋白0.2g，聚乙烯毗咯烷酮0.2g，聚蔗糖0.2g，加到ddH₂O10mL中完全溶解；20×SSC：柠檬酸钠8.82g，氯化钠17.53g，超纯水80.0mL，NaOH调pH＝7.0，定容到100.0mL，4℃保存；洗液1：2×SSC/0.1％SDS，洗液2：0.2×SSC/0.1％SDS，洗液3：0.16×SSC/0.1％SDS，洗液4：ddH2O

主要仪器设备：超净工作台，SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司；电子天平，SartoriusBP310S；恒温摇床，ThermoForma，美国产；梯度PCR仪，P×2，Thermohybaid，美国产；超纯水仪，MilliQplus，法国产；电泳仪，POWERPac300，Bio-RAD，意大利产；凝胶电泳成像系统，Bio-RAD，意大利产；高速冷冻离心机3K18型，Sigma，德国产；核酸蛋白检测仪，SmartSpaeeTM3010，Bio-RAD，意大利产；分子杂交仪，Thermohybaid，美国产；晶芯SmartArrayer16基因芯片点样仪，CapitalbioCorporation，北京博奥生物公司；真空抽干机，SinBo，香港产；基因芯片杂交盒，北京博奥生物公司；晶芯LuxScan10K基因芯片扫描仪，CapitalbioCorporation，北京博奥生物公司。

实施例1本发明基因芯片的制备

1、菌株

ILTV标准株、NDVLaSota株、IBVH120株。

2、实验方法

2.1PCR引物、检测探针的制备

(1)设计病原特异性探针：通过对GenBnak中收录的鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒的核酸序列的比对分析，选定保守区域序列：NDV-F/HN、IBV-IBM/IBN、ILTV-TK/gB。针对保守序列设计检测多对探针，从中挑选出特异性强的探针序列。

(2)设计探针序列的特异性引物：针对上述保守探针序列，利用生物信息学软件DNAman、Primer5.0等设计特异性引物。特异性引物由上海生物工程公司合成。

(3)探针制备：用小量病毒/液体样品DNA/RNA抽提试剂盒提取鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒的DNA/RNA，利用上述特异性引物对三种病原核酸进行PCR扩增，纯化浓度测定。

反转录体系及条件(参照PrimeScriptRTreagentKit的方法)

PCR扩增体系及条件：

反应条件如下：

(4)探针的筛选:将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在氨基化玻璃基片上制成DNA微阵列，通过杂交试验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明检测DNA微阵列所需的特异性探针：NDV-F/HN、IBV-IBM/IBN、ILTV-TK/gB。

引物和探针的序列如下：

SEQIDNO：1(NDV-F)

源基因来源：NDVLaSota株

基因大小及序列：440bp

CAAGAACCCAGCACCTATGATGCTGACTATCCGGGTTGCGCTGGTACTGAGTTGCATCTGTCCGGCAAACTCCATTGATGGCAGGCCTCTTGCAGCTGCAGGAATTGTGGTTACAGGAGACAAAGCCGTCAACATATACACCTCATCCCAGACAGGATCAATCATAGTTAAGCTCCTCCCGAATCTGCCCAAGGATAAGGAGGCATGTGCGAAAGCCCCCTTGGATGCATACAACAGGACATTGACCACTTTGCTCACCCCCCTTGGTGACTCTATCCGTAGGATACAAGAGTCTGTGACTACATCTGGAGGGGGGAGACAGGGGCGCCTTATAGGCGCCATTATTGGCGGTGTGGCTCTTGGGGTTGCAACTGCCGCACAAATAACAGCGGCCGCAGCTCTGATACAAGCCAAACAAAATGCTGCCAACATCCTCCGAC

SEQIDNO：2(NDV-HN)

源基因来源：NDVLaSota株

基因大小及序列：464bp

CTGGACGGTTTGGTGGGAAACGCATACAGCAGGCTATCTTATCTATCAAGGTGTCAACATCCTTAGGCGAAGACCCGGTACTGACTGTCCGCCCAACACAGTCACACTCATGGGGGCCGAAGGCAGAATTCTCACAGTAGGGACATCTCATTTCTTGTATCAACGAGGGTCATCATACTTCTCTCCCGCGTTATTATATCCTATGACAGTCAGCAACAAAACAGCCACTCTTCATAGTCCTTATACATTCAATGCCTTCACTCGGCCAGGTAGTATCCCTTGCCAGGCTTCAGCAAGATGCCCCAACTCGTGTGTTACTGGAGTCTATACAGATCCATATCCCCTAATCTTCTATAGAAACCACACCTTGCGAGGGGTATTCGGGACAATGCTTGATGGTGTACAAGCAAGACTTAACCCTGCGTCTGCAGTATTCGATAGCACATCCCGCAGTCGCATTACTC

SEQIDNO：3(IBV-M)

源基因来源：IBVH120株

基因大小及序列：368bp

ACACAGGAGGTCTTGTCGCAGCGATAATACTTACTGTGTTTGCGTGTCTTTCTTTTGTAGGTTATTGGATCCAGAGTATTAGACTCTTTAAGCGGTGTAGATCTTGGTGGTCATTTAACCCAGAATCTAACGCCGTAGGTTCAATACTCCTAACTAATGGTCAACAATGTAATTTTGCTATAGAGAGTGTGCCGATGGTGCTTTCTCCTATTATAAAGAATGGTGTTCTTTATTGTGAGGGTCAGTGGCTTGCTAAATGTGAACCAGACCACTTGCCTAAAGACATATTTGTATGCACACCAGATAGACGTAATATCTATCGTATGGTGCAGAAATACATTGGTGACCAAAGCGGAAATAAGAAAAGG

SEQIDNO：4(IBV-N)

源基因来源：IBVH120株

基因大小及序列：292bp

CAATACCCGCTACGATTCTCAGATGGAGGACCTGATGGTAATTTCCGTTGGGACTTCATTCCAATAAATCGTGGTAGGAGTGGAAGATCAACAGCGGCTTCATCAGCAGCATCTAGTAGAGCACCGTCGCGTGATGGCTCGCGTGGACGTAGAAGCGGAGCTGAAGATGATCTTATAGCTCGTGCAGCAAAGATCATTCAGGATCAGCAGAAGAAGGGTTCTCGCATTACTAAAGCTAAGGCCGATGAAATGGCTCATCGCCGGTATTGTAAGCGTACTATCCCACCTGGTT

SEQIDNO：5(ILTV-TK)

克隆基因的源基因来源：ILTK标准株

基因大小及序列：279bp

TCCTCGTAGATAGGCACCCACTCGCGGCATGTTTGTGTTTCCCTGTTGCACAATATCTAAGCGGAGCGCTCGAATTTGGAGATTTAATAACTTTATTGTCAGGAATTCCTGACATTCCAACACACTCCAACATTGTTTTAATGGATTTGGATATTTGCGAACAGGCACGGCGTATAATACAAAGGGGGCGCCCAGGGGAAACGGTCGACTGGACGTATTTGTGTGCATTACGTAACTCGTACATCTGCCTCATGAATACTACCACCTACCTCCAACGTA

SEQIDNO：6(ILTV-gB)

源基因来源：ILTV标准株

基因大小及序列：189bp

TGCTGGAATAATAGACCCTCGTGATACAGCCAGCATGGATGTTGGAAAAATCTCTTTCTCCGAAGCCATTGGGTCGGGGGCACCGAAAGAACCCCAGATTAGAAACAGAATTTTTGCGTGCTCATCTCCAACTGGCGCCAGTGTTGCGAGGCTTGCCCAGCCACGACATTGTCACCGACATGCCGATTC

SEQIDNO：7～8(F-primer)

F5`-CAAGAACCCAGCACCTATGATG-3`

R5`-GTCGGAGGATGTTGGCAGC-3`

SEQIDNO：9～10(HN-primer)

F5`-CTGGACGGTTTGGTGGGAA-3`

R5`-GAGTAATGCGACTGCGGGATG-3`

SEQIDNO：11～12(IM-primer)

F5`-ACACAGGAGGTCTTGTCGCAG-3'

R5`–CCTTTTCTTATTTCCGCTTTGG-3`

SEQIDNO：13～14(IN-primer)

F5`-CAATACCCGCTACGATTCTCAG-3`

R5`-AACCAGGTGGGATAGTACGCTTA-3`

SEQIDNO：15～16(TK-primer)

F5`-TCCTCGTAGATAGGCACCCACTC-3`

R5`-TACGTTGGAGGTAGGTGGTAGTATTCA-3`

SEQIDNO：17～18(gB-primer)

F5`-TGCTGGAATAATAGACCCTCGT-3`

R5`-GAATCGGCATGTCGGTGA-3`

定位基因的序列(SEQIDNO：19)

aaagcgaggctttttggcctctgtcgtttcctttctctgtttttgtccgtggaatgaacaatggaagtcaacaaaaagcagctggctgacattttcggtgcgagtatccgtaccattcagaactggcaggaacagggaatgcccgttctgcgaggcggtggcaagggtaatgaggtgctttatgactctgccgccgtcataaaatggtatgccgaaagggatgctgaaattgagaacgaaaagctgcgccgggaggttgaagaactgcggcaggccagcgaggcagatctccagccaggaactattgagtacgaacgccatcgacttacgcgtgcgcaggccgacgcacaggaactgaagaatgccagagactccgctgaagtggtggaaaccgcattctgtactttcgtgctgtcgcggatcgcaggtgaaattgccagtattctcgacgggctccccctgtcggtgcagcggcgttttccggaactggaaaaccgaca

SEQIDNO：20～21(定位基因互补序列的扩增引物)

F：AAAGCGACGCAATGAGGCACT

R：GTTCCACGACCGCAACTGC

为验证本发明引物的有效性，按照如下体系和条件分别进行单重对称PCR和多重对称PCR，分为两组分别扩增，两组引物分别为，体系1：ILTV-gB、NDV-F、IBV-N；体系2：ILTV-TK、NDV-HN、IBV-M。

PCR标记体系：

上下引物的浓度都是25umol/L。

试验中Cy3-dCTP荧光素使用终浓度为2.5umol/L，加入荧光素时及以后操作均在暗室中进行。反应条件如下：

扩增完成后，取10μL产物，以2％琼脂糖凝胶电泳分析，评价引物之间是否会相互影响。

结果如图1～2所示，多重RT-PCR的扩增产物与相应的单重RT-PCR扩增条带一致。实验结果说明，本发明扩增三种病毒的引物之间不会相互干扰，可以同时有效扩增3种病毒的基因。

2.2标准质粒的构建

2.2.1NDV和IBV基因组的抽提

NDV和IBV的总RNA抽提采用天根的总RNA提取试剂盒，参照说明，具体操作方法如下：

1)直接取200μL病毒尿囊液于1.5mL离心管中，加入600μL裂解液，充分振荡混匀；

2)将匀浆样品在15-30℃放置5min；

3)4℃，12000r/min离心5min，把上清液吸到新离心管中；

4)加200μL氯仿，剧烈上下振荡15sec，室温静置3min；

5)4℃，12000r/min离心10min，样品会产生分层，轻轻地将最上层无色的水相转到新管中；

6)加0.5倍体积无水乙醇，混匀，转移到吸附柱内，4℃，12000r/min离心30sec；

7)加500μL去蛋白液，4℃，12000r/min离心30sec；

8)加600μL漂洗液，静置2min，4℃，12000r/min离心30sec；重复一次

9)4℃，12000r/min离心2min，弃掉残余液体；

10)将吸附柱转到RNase-Free离心管中，加50μLRNase-Free超纯水，室温静置2min，4℃，12000r/min离心2min。离心液即得到的病毒RNA，于-20℃下保存备用或直接进行反转录。

2.2.2ILTV基因组的抽提

ILTV的DNA抽提采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，参照说明，具体操作方法如下：

1)取-20℃保存的尿囊膜10mg，研磨处理为细胞悬液，然后12000r/min离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮；

2)加20μLProteinaseK溶液，混匀后放置于56℃至尿囊膜溶解，。

3)加200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。

4)加200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec。

5)将混合物都加吸附柱中，12000r/min离心30sec。

6)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000r/min离心30sec。

7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心30sec，重复一次。

8)12000r/min空离2min，室温下放置5分钟晾干。

9)将柱子放到干净的离心管上，加50μL洗脱液TE，放置2min，12000r/min离心2min。收集的离心液即病毒DNA，或直接PCR扩增或于-20℃下保存备用。

2.2.3探针基因的RT-PCR及PCR扩增

以抽提的NDV和IBV的RNA为模板，以Random6primers为引物合成cDNA，反应体系如下：

RT Enzyme Mix	0.5μL
		Random 6primers	0.5μL
5×PrimeScript RT Buffer	2.0μL
		RNA	2.0μL
RNase-Free 超纯水	5.0μL
		Total	10.0μL

将上述体系混匀后按下面程序进行cDNA合成：反应程序为37℃，15min；85℃，5sec；4℃，保存。

以反转录合成的NDV、IBV的cDNA和ILTV的DNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下：

2×Taq PCR MasterMix	12.5μL
		cDNA/DNA	2.0μL
上游特异性引物(25.0μmol/L)	0.5μL
		下游特异性引物(25.0μmol/L)	0.5μL
超纯水	9.5μL
		Total	25.0μL

反应条件如下：

PCR完毕后，分别取7μL扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳分析。

2.2.4探针基因的胶回收

探针基因的胶回收，采用OMEGA小量胶回收试剂盒，参照说明进行回收操作，步骤如下：

1)取20μLPCR产物进行电泳，6V/cm，25min，紫外灯下切胶，称重。按照试剂盒说明进行胶回收；

2)按1:1的比例加入BindingBuffer(XP2)，55℃-60℃水浴直到胶全部融化，期间每隔2-3min上下颠倒离心管；

3)将液体加入吸附柱中，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

4)加入300BindingBuffer(XP2)，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

5)加入700mL漂洗液SPW，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

6)室温12000r/min空离2min，倒掉滤液；

7)将吸附柱放于新离心管中，加入30mL洗脱缓冲液，室温静置1min；

8)室温12000r/min离心2min，取7μL回收产物进行电泳，验证回收效果，其余回收产物于-20℃保存备用。

2.2.5探针基因的连接重组

采用pMD19-TSimpleVector克隆试剂盒，进行探针基因的连接重组，具体步骤按说明进行。连接体系如下：

pMD19-T Simple载体	0.5μL
		胶回收PCR产物	5.0μL
Solution I	4.5μL
		Total	10.0μL

4℃连接过夜，连接产物用于转化DH5α感受态细胞。

2.2.6感受态细胞的制备及保存

参考《分子克隆实验指南》氯化钙法^[56]制备DH5α感受态细胞，制备好的感受态细胞分装为100μL/管，直接用于转化或于-70℃保存。

2.2.7连接产物的转化

将100μL感受细胞放在冰上，向其中加10μL连接产物，冰浴30min；42℃水浴热休克90s，快速冰浴冷却5min；立即加入600μL37℃预热的LB液体培养基(无需冰上操作)，37℃，150r/min振荡培养1h，使受体菌恢复正常生长状态；取150μL培养物均匀涂布于LB平板(含100mg/mLAmp)，晾干，于37℃培养约12h，挑取菌落进行鉴定。

2.2.8探针质粒菌的鉴定及保存

2.2.8.1探针质粒菌的DNA抽提

将阳性质粒菌接种于5mLLB(含100mg/mLAmp)液体培养基中，37℃振荡培养12h；按Omega小量质粒提取试剂盒说明方法提取质粒。具体步骤如下：

1)吸1mL菌液到离心管中，室温12000r/min离心1min，吸弃上清；

2)加入250μLSolutionI(4℃储存)，振荡使菌体悬浮；

3)加入250μLSolutionII，轻轻地颠倒混匀，静置2min；

4)加入350μLSolutionIII，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀物，室温12000r/min，离心10min；

5)将上一步的液体转入吸附柱中，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

6)向其加500μLBufferHB，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

7)向其加700μLBufferWashBuffer，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；重复一次；

8)室温12000r/min空离2min，将柱子装于一个干净的离心管中，向其加30μLElutionBuffer，静置2min，12000r/min离心1min，收集的离心液即为提取的质粒DNA。

2.3.8.2探针质粒菌的PCR鉴定

对提取的探针质粒菌分别进行PCR鉴定，同时以pMD19-TSimple空白载体作阴性对照，反应体系如下：

2×Taq PCR MasterMix	7.5μL
		上游特异性引物(25.0μmol/L)	0.5μL
下游特异性引物(25.0μmol/L)	0.5μL
		质粒(50倍稀释)	2.0μL
超纯水	4.5μL
		Total	15.0μL

反应程序同上。反应完毕，分别取5μL于2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳分析。

2.2.9探针质粒菌的序列测定和分析

采用Sanger双脱氧末端终止法对经过PCR鉴定为阳性的探针质粒菌进行序列测定，序列测定工作交由上海杰李生物技术有限公司完成。

得测序正确的质粒菌T/F、T/HN、T/M、T/N、T/TK、T/gB，分别含有如下基因片段：SEQIDNO：1(NDV-F)、SEQIDNO：2(NDV-HN)、SEQIDNO：3(IBV-M)、SEQIDNO：4(IBV-N)、SEQIDNO：5(ILTV-TK)、SEQIDNO：6(ILTV-gB)。

2.2.10探针质粒菌的保存

把序列测定正确的探针质粒菌菌扩大培养，然后以20％脱脂奶粉作为保护剂冻干，-70℃保存。

2.3芯片制备

(1)芯片矩阵的设计：每张芯片分为四个区，四个区为四个重复阵列，用杂交围栏隔开，以便同时进行三个不同样品的杂交反应。每个阵列参数如图3所示：每排探针基因和定位基因均为9个样点，各样点中心间距450μm，样点直径为220μm。

检测DNA微阵列的点制：点样缓冲液配制成点样液，将包括鸡传染性喉气管炎病毒探针、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、定位基因定量至使用浓度即为250ng/μL，加热至95℃保持5min，然后置于冰上冷却10min。

按芯片设计要求在96(384)孔载样板孔内加入稀释变性好的包括鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒探针、定位基因、空白质控缓冲液，封住孔板，用基因芯片点样系统(MicroarrayPrintingSystem，SpotArrayTM16)在氨基化基片上接触式点样。点样环境相对湿度为55％-65％，温度15-30℃。

点制好的芯片静置充分干燥过夜(＞8h)，然后用60-80℃水合处理10s，立即于加热至80℃原位PCR仪上烘干，紫外线交联30min后，以0.2％SDS液洗涤5min，再以蒸馏水快速洗涤后离心干燥，密封、4℃保存备用。

实施例2本发明检测方法

1、核酸抽提

病毒RNA的抽提：采用试剂盒方法抽提病毒RNA，试验使用小量病毒/液体样品RNA抽提试剂盒。按该试剂盒说明抽提RNA，方法如下：

a)取待检样品300μL置于离心管中，加入500μLRV液后剧烈振荡2min后室温静置5min。

b)加入750μL异丙醇，轻轻摇匀。

c)移取800μL至吸附柱中，4℃下12000rpm离心30s。

d)弃收集管中液体，将剩余的裂解物移入吸附柱中，4℃下12000r离心30s。

e)弃收集液后加入500μLRP液，4℃下12000rpm离心30s去除蛋白质。

f)加入500μLW3液，静置lmin后，4℃下12000rpm离心15s。

g)重复步骤f。

h)将吸附柱转移到另一干净的离心管中，在吸附膜中央加入30μL超纯水，室温静置2min。

i)12000rpm离心2min，离心液为提取的RNA，-70℃保存备用。

病毒RNA的反转录：NDV、IBV反转录体系10.0μL体系：

反转录反应程序如下：42℃，反转录30min；85℃，30s灭活反转录酶；4℃保持。

病毒DNA的抽提：采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒抽提病毒DNA，方法如下

a)动物组织(组织用量应少10mg)应先打碎处理为细胞悬液，然后10000rpm离心1min，倒尽上清，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

b)加入20μlProteinaseK溶液，混匀，在56℃放置，直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

c)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

d)加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

e)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

f)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

g)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

h)重复操作步骤g。

i)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

j)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，离心2min，离心液为提取的DNA，-70℃保存备用。

2、本发明不对称PCR标记扩增方法

以DNA和反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下：

所有上游引物的浓度为10umol/l，SEQIDNO：8、16、18所示下游引物的浓度分别为100umol/l，SEQIDNO：10、12、14所示下游引物浓度分别为200umol/l，SEQIDNO：21所示下游引物浓度为10umol/l。

各下游引物的5’端均有Cy3荧光标记，因此加引物须在暗室中进行。

反应条件如下：

3、检测

采用实施例1的基因芯片进行检测。

基因芯片的预杂交

取制备保存的基因芯片，将芯片置于杂交舱中，于芯片点样区加入预杂交液25ul，将盖玻片轻放其上，以免形成气泡，使预杂交液均匀覆盖芯片区，将芯片置于密封的湿盒内于44℃下预杂交1h。

基因芯片的杂交

吸除预杂交液，将PCR扩增的核酸样品与杂交缓冲液混匀于95℃变性5min后，立即置冰中冷却3min，取该混合液20-40ul加到芯片区，以盖玻片轻放其上，将芯片放入杂交舱内于一湿盒内避光杂交，于48℃杂交温度下杂交3h时间。杂交完成后，盖玻片除去后，依次用温热的清洗液1、清洗液2、清洗液3、清洗液4依次洗涤3min，低速离心干燥后进行扫描。

扫描分析离心干燥的芯片用基因芯片扫描仪4000扫描检测。扫描参数为Laserpower95％，PMGT75％，分辨率20um，扫描结果以16位TIFF和BMP格式保存图像。

实施例3胶体金对基因芯片杂交效率的影响

1、胶体金的制备

配制1％的HAuCl4，1％柠檬酸三钠溶液。取1.0gHAuCl4粉末溶解于盛有100mL灭菌超纯水的洁净烧杯中，即制的1％的HAuCl4，并保存于棕色瓶中，避光4℃保存备用。

取200mL灭菌超纯水和2mL1％HAuCl4混于500ml大烧杯中，而后量取20mL分装于编号1-10的10个50mL小烧杯中，使用加热磁力搅拌器将分装的胶体金溶液依次加热5min，快速加入1％柠檬酸三钠溶液，加入量分别为0.1mL，0.2mL，0.24mL，0.28mL，0.32mL，0.36mL，0.4mL，0.6mL，1.0mL，1.2mL。颜色由浅黄迅速变为黑色再变为红色时，再持续搅拌10min停止，等溶液冷却至室温，用硝酸纤维薄膜过滤，即可得到所需胶体金溶液，4℃避光保存。使用时，稀释至胶体金浓度为25nmol/L的溶液。

2、胶体金对基因芯片杂交效果的影响

除了在PCR体系中加入胶体金溶液(25nmol/L)外，加入量为0.6uL，其余条件同实施例2，检测ILTV、NDV和IBV的混合样品。

3、实验结果

实验结果如表1、表2和图4所示。

表1不加入胶体金扫描结果

表2加入胶体金扫描结果

由表1、表2和图4可以看出，当加入胶体金之后能很好的增加不对称PCR的产量，杂交发现加入胶体金的平均信号值要比不加胶体金的高2000左右，说明胶体金可以让单链的扩增增加，同时抑制非特异性杂交。

实验结果说明，胶体金可以使得检测结果更准确。因此，本发明检测试剂盒优选包含胶体金。

实施例4特异性试验

一、试验方法

采用实施例2的方法，分别检测NDV、IBV、ILTV、IBDV、AIV五种病原体，以检测其特异性。

二、结果

实验结果如图5所示，本发明方法可以有效检出本发明NDV、IBV、ILTV，而不会检出其他病毒，如，IBDV、AIV，表明本发明基因芯片和试剂盒的特异性强，不会扩增其他病毒。

实验结果说明，本发明基因芯片和试剂盒的特异性强。

实施例5灵敏度试验

一、试验方法

将实施例1构建的6种质粒DNA用核酸蛋白仪定量后，将质粒拷贝数调整为1.8×10¹²拷贝/μL进行10倍梯度稀释，稀释8个梯度，将每个梯度的液体加入5μL定位基因混合，按照实施例2的方法进行检测。

二、结果

结果如图6和表3～4所示：

表3基因芯片灵敏度检测结果

表4基因芯片灵敏度检测结果

可以看出，在靶基因稀释度为10⁸(质粒拷贝数调整为1.8×10⁴拷贝/μL)时，ILTV、NDV、IBV均有较为明显的杂交斑点，而且平均信号值大于1000，SNRm大于1.5，阳性对照斑点明显而阴性对照斑点不明显。

采用本发明方法进行检测时，各病毒样品的最低检测浓度为1.8×10⁴拷贝/μL(0.2pg/μL)，说明本发明基因芯片和试剂盒的灵敏度高。

实施例6稳定性试验

一、试验方法

从两批不同时间制备的微阵列中随机抽出3张，针对相同靶核酸(NDV-F、NDV-HN)标记并进行杂交反应，其中靶核酸的使用量、杂交条件与标准流程完全一致。

二、结果

如图7所示，对于同一批次生产的基因芯片和不同批次生产的基因芯片，其检测结果符合预期，无多大波动，阳性对照斑点明显而阴性对照斑点不明显，稳定性和可重复性良好。

实验结果说明，本发明基因芯片稳定性好。

实施例7采用本发明基因芯片检测病料

一、检测方法

1、病料的采取与预处理：

1)病料的采取：收集四川重庆12个市县(成都崇州、成都大邑、重庆梁平、绵阳、南充、眉山洪雅、眉山峨眉、眉

山丹棱、内江威远、雅安雨城、雅安石棉、宜宾长宁)20份表现呼吸道症状的鸡、鸽样品，包括气管和肺部组织。

2)病料的预处理：将采集的病料用灭菌PBS研磨，37℃下作用30分钟，反复冻融3次并用超声波处理，离心，上清液-20℃保存。

2、检测：

采用实施例2的PCR体系和条件进行单一PCR分别检测NDV、IBV和ILTV，同时采用实施例1的基因芯片，按照实施例2的方法检测。

二、检测结果

临床样品检测结果

实验结果说明，本发明基因芯片和试剂盒可以准确、有效地检出鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒。

综上，本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒，特异性强、敏感性高、耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

Claims

1.一种检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的基因芯片，其特征在于：它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQIDNO：1～2所示任意一个或者两个基因片段，SEQIDNO：3～4所示任意一个或者两个基因片段以及SEQIDNO：5～6所示任意一个或者两个基因片段。

2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：它还包括定位探针，定位探针是SEQIDNO：19所示的基因片段。

3.一种检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的试剂盒，其特征在于：它包括权利要求1或2所述的基因芯片与扩增鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒基因的试剂，其中，扩增鸡新城疫病毒基因的试剂包括SEQIDNO：7～8和/或SEQIDNO：9～10所示引物对；扩增鸡传染性支气管炎病毒基因的试剂包括SEQIDNO：11～12和/或SEQIDNO：13～14所示引物对；扩增鸡传染性喉气管炎病毒基因的试剂包括SEQIDNO：15～16和/或SEQIDNO：17～18所示引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：它还包括SEQIDNO：20～21所示引物对。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：它还包括胶体金。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述引物对中，SEQIDNO：7、15、17所示上游引物与SEQIDNO：8、16、18所示下游引物的摩尔比为1：10；SEQIDNO：9、11、13所示上游引物与SEQIDNO：10、12、14所示下游引物的摩尔比为1：20。

7.SEQIDNO：7～8、SEQIDNO：9～10、SEQIDNO：11～12、SEQIDNO：13～14、SEQIDNO：15～16和SEQIDNO：17～18所示引物对以及SEQIDNO：1～6所示基因片段。

8.SEQIDNO：1或2所示任意一个或者两个基因片段，SEQIDNO：3或4所示任意一个或者两个基因片段与SEQIDNO：5或6所示任意一个或者两个基因片段在制备检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的基因芯片中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述基因芯片还包括定位探针，定位探针是SEQIDNO：19所示的基因片段。

10.SEQIDNO：7～8和/或SEQIDNO：9～10所示引物对、SEQIDNO：11～12和/或SEQIDNO：13～14所示引物对以及SEQIDNO：15～16和/或SEQIDNO：17～18所示引物对，与SEQIDNO：1～2所示任意一个或者两个基因片段、SEQIDNO：3～4所示任意一个或者两个基因片段以及SEQIDNO：5～6所示任意一个或者两个基因片段在制备检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的试剂盒中的用途；其中，引物对为扩增试剂；SEQIDNO：1～6为检测探针。