CN102816865A

CN102816865A - H1n1、prrsv、csfv四重检测试剂盒

Info

Publication number: CN102816865A
Application number: CN2011103369315A
Authority: CN
Inventors: 胡萌; 王业富; 周康平; 邱杨; 陈进会
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan Optics Valley new drug incubation public service platform Co., Ltd.
Priority date: 2011-10-31
Filing date: 2011-10-31
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2031-10-31
Also published as: CN102816865B

Abstract

本发明公开了一种四重同步核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针，属于生物技术领域。该试剂盒包括PCR反应液，其中包括DEPC处理水、Taq酶、M-MLV反转录酶、RNase抑制剂、dNTPMix、10×一步法RT-PCRBuffer、MgCl₂溶液、SEQIDNo.1~12所示的针对H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒的引物和探针；试剂盒中还包括RNA提取液、阴性质控品、工作标准品、阳性质控品和临界阳性质控品。本发明采用实时荧光定量PCR技术定量检测甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒核酸，具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。

Description

H1N1、PRRSV、CSFV四重检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒四重同步核酸定量检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

甲型H1N1流感病毒为A型流感病毒，正黏病毒科。新分离的病毒多为丝状，颗粒呈多形性，直径为80～120nm。病毒粒子有囊膜与纤突，核衣壳螺旋形对称。基因组由8条单链负义分节段RNA片段组成，分别编码一到两种蛋白，具体为PB2编码PB2聚合酶，PB1编码PB1聚合酶，PA编码PA聚合酶，HA编码血凝素HA，NP编码核蛋白NP，NA编码神经氨酸酶NA，M编码基质蛋白M1、M2，NS编码非结构蛋白NS1、NS2。每节段两端均有末端重复序列，所有节段3’端核苷酸序列相同。5’端有与3’端核苷酸序列互补的保守区段和重复序列。整个基因组约13.5kp。M为流感病毒的分类依据之一，根据M及NP，流感病毒被分为A、B、C三种类型，而HA则为A型流感病毒的进一步分类依据之一，根据HA及NA抗原抗性，可将A型流感病毒共分为16中HA亚型及9中NA亚型，因此理论上A型流感病毒存在135中亚型可能性。通过M鉴别A型，HA鉴别H1，理论上可将H1N1特异性的检测出来。确定目标基因及其相对保守的序列，合成相应的引物探针，达到特异性的检测甲型H1N1流感病毒的目的。不仅如此，M基因及HA基因编码的蛋白均为功能性蛋白，如M蛋白可裂解为M1及M2，M1蛋白同囊膜结合，其固定支撑作用，而M2蛋白则形成四聚体分部于囊膜内部，可调节病毒pH值从而有利于病毒侵染过程中的基因组释放，M2对病毒复制过程中调节宿主细胞高尔基体的pH值也具有很大作用。HA为跨膜蛋白，其主要成分位于膜外，以唾液酸(N-乙-神经氨酸)为受体，通过膜融合，介导病毒颗粒进入细胞。因此，研究该基因片段对进一步深入的研究病毒的致病机理至关重要。甲型H1N1流感病毒虽然是一种新型病毒，但是病人感染这种病毒后的表现症状却和一般的流感基本相同，因此，很难从症状上判断到底是不是感染了甲型H1N1流感。其症状与普通感冒几乎是一样的。从临床症状上基本无法区别，必须得通过实验室的检测，才能确诊。本发明通过设计针对Matrix基因及血凝素H1基因的LNA探针及引物，以此来特异性检测检测甲型H1N1流感病毒，灵敏度高，特异性强，可大批量检测。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus，PRRSV)，俗称猪蓝耳病毒，为套式病毒目，动脉炎病毒科、属，分血清型有美洲型及欧洲型两种，两型间核苷酸序列差异较大，而对型内而言，欧洲型较为保守，美洲型变异较大，我国目前流行的为美洲型。PRRSV病毒粒子有囊膜及纤突，直径50-60nm，基因组为不分节段的单股正义RNA组成，含8个开放阅读框，点突变率高，存在基因重组现象。目前针对高致病性猪蓝耳病毒的核酸检测，目标基因大致为RNAPol，ORF5、6、7区域，根据以上H1N1叙述的理由，选定GP5为目标基因，GP5为PRRSV的主要结构蛋白，也是重要的功能性蛋白，该蛋白含病毒的6个抗原决定簇，其中一个为血清型特异性线性中和决定簇，能在体外中和抗体，是病毒的主要免疫性保护性抗原。良好的免疫原性及反应原性决定了该核酸及蛋白在疫苗研究等方面的重要意义。PRRS是危害养猪业最严重的疾病之一，除疾病本身造成危害外，更重要的是PRRSV感染机体，导致机体免疫抑制，致使很多其它病原体(PCV2、链球菌、APP和副猪嗜血杆菌、CSFV等)继发感染或混合感染，从而导致猪场很高的死亡率和较大的经济损失。根据流行病学、临床症状和病理变化可对高致病性蓝耳病做出初步诊断。但确诊需要实验室进行病毒分离鉴定或用分子生物学检测方法，本研究通过检测GP5来诊断PRRSV。

猪瘟病毒为黄病毒科，瘟病毒属，只有一个血清型，但型内可分为多个基因型。病毒粒子有囊膜，直径为40-50nm，基因组由单股负链RNA构成，同FMDV一样，仅含一个大开放阅读框。对于CSFV的诊断，目前核酸针对的目标区域主要为5’UTR，E2，NS4B，NS5B。本研究确定目标基因为E2，E2为四种结构蛋白C、Erns、E1及E2之一，为囊膜上的主要结构糖蛋白之一，同时研究也表明E2分子含4个抗原结构域A、B、C和D，A区又分为A1、A2、A3三个亚区，在功能上，A1，B、C为中和性抗原区，其他几个为非中和抗原区。同前面2种病毒一样，研究该基因对该病毒的研究具有重要意义。目前猪瘟主要在亚洲、欧洲、非洲、中南美洲的国家与地区流行。近几年猪瘟疫情在我国又呈现上升的趋势，其流行和发病特点也发生了很大变化，在临床表现上趋于复杂化，出现了所谓“非典型猪瘟”、“温和型猪瘟”和“带毒母猪综合征”，目前猪瘟在我国普遍出现免疫失败和疾病非典型化现象，多表现为发热、精神沉郁、食欲减退、咳嗽、共济失调、结膜炎以及腹泻、围产期死亡、死胎、流产等。因此有必要对猪瘟的分子流行病学情况进行分析。E2(gp55)是CSFV最具抗原性的糖蛋白基因，而且是全基因组中最易变异的部分之一。能诱导高滴度的中和抗体，在保护性免疫应答中发挥重要作用。

根据以上的研究分析，本项目病原体的诊断部分将建立四重荧光定量RT-PCR同步检测甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒以及猪瘟病毒，建立四重同步检测可有效的将几种病毒存在的混合感染同时检测出来，以达到省时省力的目的。

现有技术中这三种疫病病毒的快速检测方法如下：

1、病毒分离法

为病毒性疾病诊断最常用以及高度敏感的方法之一。分离出的病毒再经电子显微镜、免疫学技术或分子生物学进一步鉴定。大致操作为获取病毒分离的样品、病毒分离操作、接种后观察或其他方法。分离出的病毒可用于长期保存，抗原性、基因特性或药物敏感性等分析，但也存在一定的使用限制。目前最常用的分离病毒的组织系一般为MDCK，而鸡胚则是最常用的活体。大多数毒株均可适应于该细胞，将病料或其它处理，接种到细胞系上，3～4天可见CPE，表明病毒分离。总体而言，病毒分离认为检测病毒的一种经典、准确、敏感的病原学诊断金标准，特异性和敏感性均较高，但较为费时。

2、电子显微镜技术

电镜已成为病毒研究的常规手段之一，可以很直观地显示病毒粒子的形态结构、病毒在寄主细胞内的存在状态、寄主细胞的结构变化、以及病毒的复制和装配等过程。电子显微镜技术分常规电镜和免疫电镜。可用电子显微镜直接观察到新城疫病毒颗粒或感染部位组织。常规电镜法样品用量小、制样速度快、观察比较直观，但观察灵敏度较低，要求样品的病毒量大。而免疫电镜法较常规电镜法的敏感性高，但样品制备过程较复杂，对操作者的技能要求较高。在此基础上还研究开发出了一些新方法及技术，如免疫电子显微镜或固相免疫电子显微镜，这些方法是利用抗原抗体反应并通过负染色在电子显微镜下进行观察，灵敏度相对提升了许多，但相应的样品制备过程较复杂，对操作者的技能要求较高。

3、血清学实验

血清学检测方法主要是检测甲病毒感染过程中产生的抗原抗体免疫标志物，主要包括免疫过氧化物单层试验(IPMA)、免疫荧光试验(IFA)、酶免疫法(EIA)和血清中和试验等。血清学测定的灵敏度高于电子显微镜，但其特异性低，实验室诊断方面局限性较大。此外，由于该技术建立于病毒抗原识别的基础之上，病毒的抗原多样性会对该技术的应用产生影响。操作上较为简单快速，但现有的方法缺乏足够的敏感性和特异性，如不能准确区分甲型H1N1流感病毒与季节性流感，且不能检测新变异的毒株。

免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)，广泛用于疫病病毒诊断，敏感性和特异性都比较好。可用于病毒抗原检测、病毒鉴定及血清抗体检测。间接荧光抗体试验间接荧光抗体试验(indirect fluorescent anti-body test，IFA)，为标记荧光素在抗原抗体上进行抗原抗体反应。新报道的微球免疫法即将利用结合于聚苯乙烯微球的抗体鉴定病毒，敏感性和特异性均相当高，并且，由于该微球系统可发出不同颜色的荧光，因此，理论上可同时检测100种不同的抗体，且试剂用量极少。该法是国际上检测疫病病毒阳性抗体通用而且比较敏感的血清检测方法。IFA特异性可达99％。IFA可以确定抗体的滴度，抗体滴度达到16或20的可以判为阳性。关于EIA，其应用最广的技术为酶联免疫吸附试验(ELISA)，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，再加底物显色，最后根据色泽深浅推算待测抗原或抗体的含量。检测方法分为有多种形式，如间接ELISA、捕捉ELISA、阻断ELISA、夹心ELISA等。抗原检测ELISA特异性较强，操作快速简便，可应用于大批量样本检测，并且抗体侦测的反应谱比抗原更广。而血清中和试验(serum neutralization test，SNT)，分常量和微量两种，基本原理为利用完整的病毒来检测中和抗体，WHO推荐使用微量中和法，其敏感性大大高于血凝抑制(HI)试验，但中和抗体在血清中出现比较迟，不适用于早期诊断。该法特异性很强，可区别不同毒力的病毒株型。此法是评价猪群免疫保护水平的唯一客观可信的方法，为经典方法，但操作繁琐、费时费料，对安全及检验技术要求高，现在已较少使用。另外还有SPRIA法、MEIA法、琼脂凝胶扩散试验(agar gel immunodiffusion，ACID)、血凝抑制(HI)试验、免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)等。

4、分子生物学方法

病毒的核酸检测敏感度高，检测周期短，目前应用较为广泛。分子诊断中使用最多的3种技术为PCR法、NASBA(nucleic acid sequence-based amplification)及DNA芯片。

PCR法是通过两段特异性寡核甘酸引物，在体外经DNA聚合酶催化，扩增与两引物互补的DNA序列之间的区段，检测样品中是否有该序列。PCR较血清学方法更敏感，但特异性和重复性较低，若结合斑点杂交、微孔板杂交、滤膜核酸探针杂交等核酸杂交方法和酶联免疫等方法对PCR产物进行分析，灵敏度和特异性均可大大提高。

随着现代核酸技术的发展，建立在基因水平上的核酸扩增技术PCR及相关技术，由于其高敏感性和高特异性，在甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒的临床检测中得到广泛应用，成为实验室诊断的主要方法。这些以PCR为基础的检测方法，都需要花费时间对PCR扩增产物进行后处理，PCR扩增产物中高浓度的目标DNA分子会以气溶胶的形式污染整个实验空间，由于PCR的高度灵敏性，甚至可以检测出反应体系中10个拷贝的模板浓度，从而可能给今后的PCR实验带来严重的假阳性；常规PCR方法是终点检测法，由于PCR反应具有平台期，无法依据终产物对起始模板进行精确定量检测。在此基础上研发出竞争PCR(competitive PCR)，巢式PCR(nested PCR)，半巢式PCR(semi-nested PCR)，多重巢式PCR(multiplex nested PCR)，限制片段长度多态性PCR(RELP-PCR)，多重PCR等。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR法)是一种灵敏度很强的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。建立病毒RT-PCR检测方法的原则是扩增病毒特异而保守的基因片段，具有很高的特异性和敏感性。的灵敏度可能因样本中存在其抑制物而低于预期，目前已逐步发展为病毒检测的“金标准”。在所有常规方法中，该反应最为灵敏。

逆转录实时荧光定量PCR法，该法在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，分一步法和两步法两种，具高通量，可定量，单位检测成本较低，稳定性、精确性、重复性好，以及自动化程度高等特点。并且单管封闭检测且不需后续处理而大大减小交叉污染的可能。检测周期短。敏感性为传统RT-PCR的10～100倍。而使用特异性的探针可进一步极高检测的效率及限制，据研究报道使用TaqMan探针的RRT-PCR方法的检测限可达0.006TCID₅₀/ml～0.2TCID₅₀/ml(50％tissue culture infectious dose，半数组织培养感染剂量)。而应用MGB探针可减少背景荧光，进一步提高敏感性，检测限可达0.08EID₅₀或0.006TCID₅₀(约5个RNA拷贝)。探针的应用使假阳性最小化。

依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)是一种快速、等温的RNA扩增技术，整个反应有赖于AMV逆转录酶、T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNase H)共同协作而完成，不需特殊仪器，不需温度循环，是以转录为基础，单链核苷酸的连续扩增，其反应产物是单链RNA。扩增产物与磁珠上的捕捉探针及钌标记的电化学发光寡核苷酸探针(ECL探针)杂交后，形成复合物，经NucliSens阅读器直接检测电化学发光强度。该法周期较短，灵敏度与鸡胚培养相当。NASBA扩增不要需要复杂的温度变化，其扩增效率高于传统的PCR，其敏感性要高于传统PCR，但现有的敏感性评估均为体外实验结果，需要进行直接检测临床样品的彻底评估。在NASBA技术上进一步发展出来的实时NASBA技术，使检测的敏感性和特异性大大提高，达到0.1TCID，相当于RRT-PCR。检测临床样品的阳性率高于细胞培养法及直接免疫荧光法多达64％。NASBA技术拥有RRT-PCR相似的优点，且因为不需要变性DNA，即便有基因组DNA污染也可以特异性扩增出目的RNA；而且还是一种高通量的方法，可以同时检测50个样本。非常适用于大规模样品的筛查。NASBA技术的扩增产物为RNA分子，使用者可以根据需要选择不同的检测方法，如电化学发光法和酶联法等。而且，与PCR的产物DNA分子不同，RNA分子不易对实验仪器和环境造成污染，避免了产物交叉污染实验仪器、操作环境导致的假阳性结果。但缺点是单位均检测成本要高于RRT-PCR，所以有条件的实验室，最适合的技术还是RRT-PCR。

基因芯片技术(gene chips)又称DNA芯片(DNA chips)或生物芯片(biologicalchips)。其原理是将大量特定的寡核苷酸或基因片段作为探针，有规律地和高密度地排列，固定在一块很小的支持物如硅片、玻片等，然后与待检的荧光标记样品核酸按碱基配对原则杂交，经洗涤后通过激光共聚焦荧光系统检测杂交信号强度，再经计算机分析处理数据从而获取样品的生物信息。将特异探针固定在载玻片上，在PCR扩增甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒分型区域时，应用荧光标记的dNRP使PCR产物带有荧光，通过将PCR产物与甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒芯片杂交后某型处的杂交点出现荧光而确定。将RT-PCR获得的病毒各种基因的cDNA或合成的特异性寡核苷酸探针固化于芯片，利用核酸杂交技术可构建检测流感病毒A、B及其亚型的芯片平台，CY3、CY5标记待检的cDNA或扩增的DNA，与芯片杂交，检测病毒核酸或进一步鉴别混合体系中扩增产物。理论上单次杂交可以检测多种病毒，并有潜力进行成千上万种核酸序列的筛选。可用于甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒的基因变异、基因分型的检测。该技术具有自动化程度高、灵敏度高、检测目的分子量少、效率高等优点，但也存在成本高、假阳性率偏高、重复性差等缺陷。目前基因芯片技术在流感的检测中还远远低于其它检测方法，且检测成本及硬件要求均较高.离实际应用还有很长的路要走。

此外还有原位核酸分子杂交技术(in situ hybridization，ISH)、核酸探针法、环介导的等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等。

发明内容

本发明的目的是提供一种能同步检测甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒核酸定量检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明首先提供一种甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与综合征病毒及猪瘟病毒核酸定量检测引物和探针，包括如下的序列组：

1)包括下述正向引物，反向引物和荧光探针的四组序列：

a)针对甲型H1N1流感病毒matrix基因

正向引物：5′-CATGGARTGGCTAAAGAC-3′，

反向引物：5′-WAGGGCATTTTGGACAAA-3′，

荧光探针：5′-CCAATCTTGTCACCTCT-3′，下标为LNA修饰；

b)针对甲型H1N1流感病毒haemagglutinin基因

正向引物：5′-TGCTGGATCTGGTATTATC-3′，

反向引物：5′-ATCGGATGTATATTCTGAAATG-3′，

荧光探针：5′-TCAGATACACCAGTCCAC-3′，下标为LNA修饰；

c)针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因

正向引物：5′-CTTYCTTCTGGACACTAAG-3′，

反向引物：5′-CTCTGGTTAWAGGGGTTG-3′，

荧光探针：5′AACCRTCAAGCACAACTC-3′，下标为LNA修饰；

d)针对猪瘟病毒E2基因

正向引物：5′-AACGGYAGTGCTTTCTAYC-3′，

反向引物：5′-GTGGRAAAGGCTTCTCTC-3′，

荧光探针：5′-ACCACTTCTGTYCTCA-3′，下标为LNA修饰。

2)上述1)中序列的5’端和/或3’端有延长的核苷酸片段的一组序列；

3)与上述1)或2)中序列的同源性大于85％，且具有特异性的一组序列；

4)与上述1)或2)或3)中序列的碱基互补的一组序列；

5)上述1)、2)和3)中任何三个或多个序列形成的具有正向引物、反向引物以及与之向对应的荧光探针的分别对应上述a)～d)中所述基因的四组序列；

其中，所述4种探针分别使用四种激发不同荧光信号的荧光基团；所述序列中，Y为C或T，R为A或G，W为A或T。

其中，所述针对甲型H1N1流感病毒Matrix基因荧光探针的5’端和3’端分别使用荧光基团VIC和BHQ1修饰，针对甲型H1N1流感病毒Haemagglutinin基因荧光探针的5’端和3’端分别使用荧光基团ROX和BHQ2修饰，针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因荧光探针的5’端和3’端分别使用荧光基团CY5和BHQ3修饰，而针对猪瘟病毒E2基因荧光探针的5’端和3’端分别使用荧光基团FAM和BHQ1修饰。

进一步，本发明提供含有上述引物和探针的甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒核酸定量检测试剂盒。

该试剂盒还可进一步含有以下试剂中的一种或多种：

(1)PCR反应液；

(2)RNA提取液；

(3)阴性质控品，为不含甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因的PMD18-T载体质粒DNA片段；

(4)阳性质控品，为含1.0×10⁸copy/ml浓度的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的cDNA片段；

(5)临界阳性质控品，为含1.0×10⁴copy/ml浓度的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的cDNA片段；以及

(6)工作标准品，为含有甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒的致病机理相关决定基因，即H1N1 Matrix基因的127个碱基对、H1N1 Haemagglutinin基因的的114个碱基对、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的146个碱基对以及猪瘟病毒E2基因的127个碱基对的核苷酸片段的PMD18-T重组质粒。

其中，所述(1)PCR反应液，包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的HotStart Taq DNA聚合酶、M-MLV反转录酶、RNase抑制剂、dNTP Mix、10×PCR Buffer、MgCl₂溶液，所述探针和引物溶于PCR反应液中。

所述工作标准品，具体包括：

a、工作标准品1，约1.0×10⁹copy/ml的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的非传染性DNA片段；

b、工作标准品2，约1.0×10⁸copy/ml的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的非传染性DNA片段；

c、工作标准品3，约1.0×10⁷copy/ml的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的非传染性DNA片段；

d、工作标准品4，约1.0×10⁶copy/ml的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的的非传染性DNA片段。

所述PCR反应液各组分含量的配比为：DEPC处理水用量4μl；5U/μl的热启动Taq酶0.9μl；200U/μl M-MLV反转录酶2.0μl；RNase抑制剂1.0μl；10mmol/l的dNTP Mix 12μl；10×一步法RT-PCR Buffer 5μl；50mmol/l的MgCl₂溶液用量10μl；、浓度为20μmol/l的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因正向引物各0.7μl、浓度为20μmol/l的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因反向引物0.7μl、浓度为20μmol/l的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因荧光探针0.5μl。

所述Trizol试剂主要成分为苯酚，另外还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等；所述氯仿为三氯甲烷，纯品；异丙醇为纯品；所述乙醇浓度为75％；所述DEPC处理水为0.1％DEPC水，经高压灭菌，同时也灭活了有毒性的DEPC。

本发明实施范例还提供利用所述的试剂盒检测甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒核酸的检测方法，包括下列步骤：

(1)样品预处理：样本可为血清、鼻咽拭子、咽拭子或是其他组织；

具体可按以下方式进行样品的预处理：

血清样品：收集5ml静脉血置10ml带垫圈的螺口塑料离心管中(不含抗凝剂)，以1,000g离心10min，在无菌条件下吸取血清，并分装到若干个1ml带垫圈的螺口塑料血清管中(100μl/管)，于48h内冷藏(4～8℃)运输到实验室。

咽拭子和鼻咽拭子标本：先用生理盐水将棉拭子沾湿(不要用含有青霉素的标本运输液，以防过敏)，鼻咽拭子采集是将棉签平行于上颚插入鼻孔，停留几秒钟，吸收分泌物，拭抹双侧鼻孔；咽拭子采集是用棉签适度用力擦拭双侧咽后壁部位，应避免触及舌部。采完咽拭子和鼻咽拭子后，迅速将拭子放入含有3ml标本运输液的10ml带垫圈的螺口塑料离心管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖。在48h内冷藏(4～8℃)运输到实验室。如无病毒保存液，也可用生理盐水替代。

病料组织：采集新鲜病料，如猪的内脏，大小1～2cm见方即可，存放在消毒过的容器内，若用于病理组织学检查，则要采集病灶及临近正常组织，并存放于10％福尔马林溶液中。采集的样品于24h内送达实验室。

长期保存血清样品存于-20℃以下冰箱，拭子和病料组织保存于-70℃或以下冰箱。

(2)RNA提取：取已处理的样本200μl，加600μl溶液1，充分震荡混匀，室温静置10min；加150μl溶液2，再次充分震荡混匀，室温静置5min，13,000rpm离心15min，取上清置等体积预冷的溶液3中，温和颠倒混匀，静置10min，12,000rpm离心10min，弃上清，加入1,000μl 75％溶液4洗涤沉淀2次，8,000rpm离心5min。去上清，干燥2～5min，加15～30μl溶液5溶解，-80℃保存；

(3)加样：向装有45μl PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品，阴性质控品，阳性质控品，临界阳性质控品，工作标准品5μl，盖好管盖，5,000rpm离心10s；

(4)PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，按下列条件进行PCR扩增；

42℃60min，1个循环；

94℃5min，1个循环；

94℃30s，58℃45s，5个循环；

94℃30s，58℃45s，35个循环；收集荧光信号，在反应程序的第四步的终了读取荧光值。

(5)分析判断：Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于等于28且小于等于32的为临界阳性。

当需要绘制标准曲线时，另取4个反应管，直接加入不同浓度梯度的工作标准品5μl，5,000rpm离心10s，同样本一起进行荧光定量PCR反应。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明试剂盒利用特异性的TaqMan探针来检测甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒，检测完成后无需开盖电泳，避免了产物污染及对实验室人员的伤害。

本发明使用LNA探针，也可用MGB探针，AllGloTM探针来代替。

本发明实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时检测克服了扩增产物终点检测所存在的“平台效应”对产物定量的影响，它具有高度的特异性、灵敏度与准确性(如实施例4、实施例5所示)，且技术操作简便、自动化程度高，由于采用闭管操作，不需要PCR产物后处理，有效解决PCR污染问题等特点，结果可靠。同时，采用将逆转录及荧光定量PCR法结合起来，大大简化了实验步骤，在实际操作及推广上具有重大意义。在此基础上，同时特异性的检测三种疫病病毒，解决了混合感染或非典型感染中检测多次重复问题，达到了省时省力的目的。

附图说明

图1是本发明实施例2中提供的实验结果图；

图2是本发明实施例3中提供的实验结果图；

图3、4是本发明实施例4中提供的实验结果图；

图5、6是本发明实施例5中提供的实验结果图；

图7是重组质粒PMD18-T载体图。

图中：图1、图2、图3、图5的横坐标表示：表示循环数(Cycle number)，纵坐标表示：荧光值(Delta Rn)；图4、图6纵坐标表示：Ct值。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例1试剂盒的组成

该试剂盒含有：PCR反应液，其中包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的HotStart Taq DNA聚合酶、M-MLV反转录酶、dNTP Mix、10×PCR Buffer、MgCl2溶液、甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒正向引物、甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒反向引物、甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒探针；溶液1为Trizol试剂，溶液2为氯仿，溶液3为异丙醇，溶液4为75％乙醇，溶液5为DEPC处理水；阴性质控品，为不含甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因的PMD18-T载体质粒DNA片段；阳性质控品，为含1.0×10⁸copy/ml浓度的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的DNA片段；临界阳性质控品，为含1.0×10⁴copy/ml浓度的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的DNA片段；工作标准品，为含有甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒的致病机理相关决定基因，即H1N1 Matrix基因的127个碱基对、H1N1 Haemagglutinin基因的的114个碱基对、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的146个碱基对以及猪瘟病毒E2基因的127个碱基对的核苷酸片段的PMD18-T重组质粒，该质粒在大肠杆菌DH5α中增殖；

试剂盒的制造：

1.试剂

本试剂盒制造过程中所用的试剂主要购自江苏硕世生物科技有限公司及上海生工生物科技有限公司。

2.PCR反应液制备

(1)引物及探针设计与合成：

选择甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)(http://wwwncbi.nlm.nih.gov)，选择并下载有代表性的甲型H1N1流感病毒Matrix基因22条序列，Haemagglutinin基因的20条序列、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因40条序列及猪瘟病毒基因E2基因44条序列，使用MAGA 4.0软件进行比对分析，在基因区选择一段相对保守序列，序列如序列表中SEQ ID NO.13～16所示：

No.13：Matrix Gene

5’-CATGGAGTGGCTAAAGACAAGGCCAATCTTGTCACCTCTGACCAAGGGA

ATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAG

CGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTA-3’

No.14：Haemagglutinin Gene

5’-TGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATAC

AACTTGTCAGACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAA

TATACATCCGAT-3’

No.15：GP5Gene

5’-CTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTCTATCGTTGGCGGTCACCCGTCA

TTGTGGAGAAAGGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTC

AAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAG-3’

No.16：E2 Gene

5’-AACGGTAGTGCTTTCTACCTAGTCTGCCCAAGAGGATGGACAGGTGTCA

TAGAGTGCACGGCAGTAAGCCCCACAACCTTGAGAACAGAAGTGGTGAAG

ACCTTCAAGAGAGAGAAGCCTTTCCCAC-3’

在本发明中，甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒探针的5’端修饰的荧光染料可选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修饰的荧光染料可选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。本实施例中荧光报告基团设计为甲型H1N1流感病毒Matrix Gene。甲型H1N1流感病毒Matrix基因LNA探针荧光探针的5’端和3’端分别使用荧光基团VIC和BHQ1修饰，VIC的激发波长为535nm，接收波长为556nm，接收针对甲型H1N1流感病毒haemagglutinin基因LNA探针的5’端和3’端分别使用荧光基团ROX和BHQ2修饰，ROX的激发波长为575nm，接收波长为602nm，针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因LNA探针的5’端和3’端分别使用荧光基团CY5和BHQ3修饰，CY5的激发波长为649nm，接收波长为670nm，而针对猪瘟病毒E2基因LNA探针的5’端和3’端分别使用荧光基团FAM和BHQ1修饰，FAM的激发波长为495nm，接收波长为521nm；所述引物序列中，Y＝(C/T)，R＝(A/G)，W＝(A/T)；

设计结果如下表所示：

注：“Y”、“R”、“W”为兼并碱基。

Y＝(C/T)，R＝(A/G)，W＝(A/T)。

表中：F：forward，正向；甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒-F表示甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒正向引物。

R：reverse，反向；甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒-R表示甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒反向引物。

P：probe，探针；甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒-P表示甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒探针，探针既可为LNA探针，也可为MGB探针，本例探针为LNA探针，大写碱基为LNA修饰。

VIC、ROX、CY5和FAM：荧光报告基团。

BHQ1、2及3：荧光淬灭基团。

按照上表的设计结果，委托江苏硕世生物科技有限公司合成引物和探针。

(2)PCR反应液配制：DEPC处理水用量4μl；5U/μl的热启动Taq酶0.9μl；200U/μl M-MLV反转录酶2.0μl；Rnase抑制剂1.0μl；10mmol/l的dNTPMix 12μl；10×一步法RT-PCR Buffer 5μl；50mmol/l的MgCl₂溶液用量10μl；浓度为20μmol/l的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因正向引物各0.7μl、浓度为20μmol/l的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因反向引物0.7μl、浓度为20μmol/l的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因LNA探针0.5μl。

3.阴性质控品制备：为不含甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因PMD18-T载体质粒DNA片段。

取阴性质控品，为不含甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因的DNA片段溶液于样本准备区预处理，定量稀释至浓度为1.0×10⁷copy/ml(比浊法)，吸取质粒溶液于离心管中，混匀，直接吸取5μl作模板。

4.阳性质控品制备：为含1.0×10⁸copy/ml浓度(各基因均为该浓度)的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的DNA片段。

取感染甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和经典猪瘟病毒的MDCK细胞悬浮液，200μl，提取RNA，逆转录为cDNA，使用分光光度计测A260定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁸copy/ml，即可作为阳性质控品模板。

5.临界阳性质控品制备：低浓度含甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因的溶液。

取感染甲型H1N1流感病毒和、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒以及猪瘟病毒的MDCK细胞悬浮液200μl，提取RNA，逆转录为cDNA，使用分光光度计测A₂₆₀定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁴copy/ml，即可作为临界阳性质控品模板。

6.RNA提取液分为溶液1，溶液2，溶液3，溶液4及溶液5。溶液1为Trizol试剂，溶液2为氯仿，溶液3为异丙醇，溶液4为75％乙醇，溶液5为DEPC处理水。

7.工作标准品1，约1.0×10⁹copy/ml的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的非传染性DNA片段；

9.工作标准品2，约1.0×10⁸copy/ml的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的非传染性DNA片段；

10.工作标准品3，约1.0×10⁷copy/ml的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的非传染性DNA片段；

11.工作标准品4，约1.0×10⁶copy/ml的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的的非传染性DNA片段；

工作标准品，为含甲型H1N1流感病毒Matrix基因(SEQ ID No.13)和Haemagglutinin基因(SEQ ID No.14)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因(SEQ ID No.15)及猪瘟病毒E2基因(SEQ ID No.16)的PMD18-T重组质粒(质粒委托上海生工生物科技有限公司合成，质粒图谱如图7所示)，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A₂₆₀定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁹copy/ml，-20℃保存。贮存浓度为1.0×10⁹copy/ml，使用前用无菌生理盐水或0.01mol/l PBS进行10倍梯度的系列稀释。工作浓度依次为1.0×10⁹copy/ml，1.0×10⁸copy/ml，1.0×10⁷copy/ml和1.0×10⁶copy/ml，使用前，12,000rmp离心1min，取上清液作模板。

本发明的试剂盒可以按照下表进行配置(24人份/盒)：

本发明的试剂盒在-10℃±5℃避光储存，避免反复冻融；有效期6个月。适用仪器(ABI7500，ABI7300，Bio-Rad iQ5^TM，Stratagene Mx3000P、StratageneMx3005P，达安7000)等。

实施例2

用本发明的试剂盒在ABI 7300荧光定量PCR仪上检测甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒核酸的方法

(1)采集样品：采集血清、鼻咽拭子、咽拭子或是病料组织；

(2)RNA提取：取已处理的样本200μl，加600μl溶液1，充分震荡混匀，室温静置10min；加150μl溶液2，再次充分震荡混匀，室温静置5min，13,000rpm离心15min，取上清置等体积预冷的溶液3中，温和颠倒混匀，静置10min，12,000rpm离心10min，弃上清，加入1000μl 75％溶液4洗涤沉淀2次，8,000rpm离心5min。去上清，干燥2～5min，加15～30μl溶液5溶解，-80℃保存；

(3)加样：向装有45μl PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品5μl，盖好管盖，5,000rpm离心10s；

DEPC处理水用量4μl；5U/μl的热启动Taq酶0.9μl；200U/μl M-MLV反转录酶2.0μl；Rnase抑制剂1.0μl；10mmol/l的dNTP Mix 12μl；10×一步法RT-PCR Buffer 5μl；50mmol/l的MgCl₂溶液用量10μl；、浓度为20μmol/l的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因正向引物各0.7μl、浓度为20μmol/l的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因反向引物0.7μl、浓度为20μmol/l的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因LNA探针0.5μl；

甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒FQ-PCR反应体系如下表：

(4)PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，选择要用的LNA探针(本产品荧光报告基团为VIC，CY5，ROX，FAM，荧光淬灭基团为BHQ1、2及3)，定义样品孔：阴性质控品选NTC；待检样品、阳性质控品及临界阳性质控品选Unknown。

按下表进行PCR扩增；

在反应程序的第三步的终了读取荧光值；

(5)分析判断：

Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于和等于28且小于和等于32的为临界阳性。本发明实施例2的试验结果如图1所示，具体检测结果见下表：

序号	Ct
		1.1	2.21785
1.2	2.06356
		1.3	2.03591
1.4	2.12024
		2.1	30.3778
2.2	30.4813
		2.3	30.1306
2.4	30.3707
		3.1	Undet.
3.2	Undet.
		3.3	Undet.
3.4	Undet.

其中，样本1.1～1.4在阳性范围内，为阳性样本；样本2.1～2.4在临界阳性范围内，为临界阳性样本；样本3.1～3.4在阴性范围内，为阴性样本。

实施例3

用本发明的试剂盒按照实施例2的方法检测临床确诊样本的甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒核酸。样本来源××检测单位已测定的样品，本发明实施例3的试验结果如图2所示，检测结果见下表：

序号	Ct
		1.1	Undet.
1.2	21.2626
		1.3	5.1246
1.4	23.8802
		2.1	16.3118
2.2	23.1865
		2.3	5.08192
2.4	22.1521
		3.1	Undet.
3.2	Undet.
		3.3	Undet.
3.4	Undet.

临床确诊样本1.2、1.3、1.4、2为阳性，1.1、3为阴性，本研究诊断与确诊样本相符，准确率为100％。

实施例4

利用本发明的试剂盒进行定量检测时，需绘制标准曲线，除8个样本反应管外，另取3个反应管分别为阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品，还有4个反应管，给每个反应管中对应加入试剂盒中不同浓度梯度的工作标准品5μl，5000rpm离心10s，以工作标准品为模板，按照实施例2的方法配制反应体系，然后放入仪器样品槽进行PCR扩增。工作标准品选Standard。对于Standard，需要在Quantity栏中分别输入1.0×10⁹copy/ml、1.0×10⁸copy/ml、1.0×10⁷copy/ml、1.0×10⁶copy/ml。

使用仪器ABI 7300参照结果：

a.如果扩增曲线不呈S型或Ct值＞32，判定样品病毒DNA含量小于检测下限；

b.如果扩增曲线S型不明显或28≤Ct值≤32，则样品病毒DNA含量处于临界阳性范围；

c.如果扩增曲线呈S型且Ct值＜28，则按以下方法进行定量：

工作标准品的荧光扩增曲线如图3所示，选取其中的CSFV扩增为代表，绘制标准曲线，如图4所示，■是标准品。

工作标准品	Ct	C(初始浓度)
			1.0e+009	3.347	1.0e+009
1.0e+008	6.294	1.0e+008
			1.0e+007	9.671	1.0e+007
1.0e+006	13.365	1.0e+006
			slope	-3.343074	-
intercept	33.242611	-
			R²	0.997493	-

具体检测过程中可将工作标准品和样本在一起检测，根据扩增后得到的Ct值，分析换算，得到样本的原始浓度。

扩增曲线均呈光滑″S″型，标准曲线为一条直线，Ct值在3-14之间，每个浓度梯度的Ct值差约为3左右。

实施例5

重复实施例4。

工作标准品的荧光扩增曲线如图5所示，选取其中的CSFV扩增为代表，绘制标准曲线，如图6所示，■是标准品。

工作标准品	Ct	C(初始浓度)
			1.0e+009	3.7541	1.0e+009

1.0e+008	6.76272	1.0e+008
			1.0e+007	10.0734	1.0e+007
1.0e+006	13.8102	1.0e+006
			slope	-3.347902	-
intercept	33.709377	-
			R2	0.997627	-

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 四重同步核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> R为A或G

<400> 1

catggartgg ctaaagac 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> W为A或T

<400> 2

wagggcattt tggacaaa 18

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccaatcttgt cacctct 17

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgctggatct ggtattatc 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> W为A或T

<400> 5

wagggcattt tggacaaa 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcagatacac cagtccac 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Y为C或T

<400> 7

cttycttctg gacactaag 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> W为A或T

<400> 8

ctctggttaw aggggttg 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> R为A或G

<400> 9

aaccrtcaag cacaactc 18

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Y为C或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> Y为C或T

<400> 10

aacggyagtg ctttctayc 19

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> R为A或G

<400> 11

gtggraaagg cttctctc 18

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Y为C或T

<400> 12

accacttctg tyctca 16

<210> 13

<211> 127

<212> DNA

<213> Influenza virus A

<400> 13

catggagtgg ctaaagacaa ggccaatctt gtcacctctg accaagggaa ttttgggatt 60

tgtattcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa 120

tgcccta 127

<210> 14

<211> 114

<212> DNA

<213> Influenza virus A

<400> 14

tgctggatct ggtattatca tttcagatac accagtccac gattgcaata caacttgtca 60

gacacccaag ggtgctataa acaccagcct cccatttcag aatatacatc cgat 114

<210> 15

<211> 146

<212> DNA

<213> Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

<400> 15

cttccttctg gacactaagg gcagactcta tcgttggcgg tcacccgtca ttgtggagaa 60

agggggtaag gttgaggtcg aaggtcacct gatcgacctc aagagagttg tgcttgatgg 120

ttccgcggca acccctttaa ccagag 146

<210> 16

<211> 127

<212> DNA

<213> Hogcholera virus

<400> 16

aacggtagtg ctttctacct agtctgccca agaggatgga caggtgtcat agagtgcacg 60

gcagtaagcc ccacaacctt gagaacagaa gtggtgaaga ccttcaagag agagaagcct 120

ttcccac 127

Claims

1.一种甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与综合征病毒及猪瘟病毒核酸定量检测引物和探针，包括如下的序列组：

1）包括下述正向引物，反向引物和荧光探针的四组序列：

a）针对甲型H1N1流感病毒matrix基因

正向引物：5'- CATGGARTGGCTAAAGAC -3'，

反向引物：5'- WAGGGCATTTTGGACAAA -3'，

荧光探针：5'- ccaAtcTtgTcaCctct -3'，下标为LNA修饰；

b）针对甲型H1N1流感病毒haemagglutinin基因

正向引物：5'- TGCTGGATCTGGTATTATC -3'，

反向引物：5'- ATCGGATGTATATTCTGAAATG -3'，

荧光探针：5'- tcaGatAcaCcaGtccac -3'，下标为LNA修饰；

c）针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因

正向引物：5'- CTTYCTTCTGGACACTAAG -3'，

反向引物：5'- CTCTGGTTAWAGGGGTTG -3'，

荧光探针：5'- aacCrtCaaGcaCaactc -3'，下标为LNA修饰；

d）针对猪瘟病毒E2基因

正向引物：5'- AACGGYAGTGCTTTCTAYC -3'，

反向引物：5'- GTGGRAAAGGCTTCTCTC -3'，

荧光探针：5'- accActTctGtyCtca -3'，下标为LNA修饰；

2）上述1）中序列的5’ 端和/或3’ 端有延长的核苷酸片段的一组序列；

3）与上述1）或2）中序列的同源性大于85%，且具有特异性的一组序列；

4）与上述1）或2）或3）中序列的碱基互补的一组序列；

5）上述1）、2）和3）中任何三个或多个序列形成的具有正向引物、反向引物以及与之向对应的荧光探针的分别对应上述a）~d）中所述基因的四组序列；

其中，所述4种探针分别使用四种激发不同荧光信号的荧光基团；所述序列中, Y为C或T，R为A或G，W为A或T。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，其中，所述针对甲型H1N1流感病毒Matrix基因荧光探针的5’端和3’端分别使用荧光基团VIC和BHQ1修饰，针对甲型H1N1流感病毒Haemagglutinin基因荧光探针的5’端和3’端分别使用荧光基团ROX和BHQ2修饰，针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因荧光探针的5’端和3’端分别使用荧光基团CY5和BHQ3修饰，而针对猪瘟病毒E2基因荧光探针的5’端和3’端分别使用荧光基团FAM和BHQ1修饰。

3.含有权利要求1或2所述引物和探针的三重同步核酸定量检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种：

（1）PCR反应液；

（2）RNA提取液；

（3）阴性质控品，为不含甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因的PMD18-T载体质粒DNA片段；

（4）阳性质控品，为含1.0×10⁸ copy/ml浓度的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的cDNA片段；

（5）临界阳性质控品，为含1.0×10⁴ copy/ml浓度的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的cDNA片段；

（6）工作标准品，为含有甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒的致病机理相关决定基因，即H1N1 Matrix基因的127个碱基对、H1N1 Haemagglutinin 基因的114个碱基对、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的146个碱基对以及猪瘟病毒E2基因的127个碱基对的核苷酸片段的PMD18-T重组质粒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其中，（1）PCR反应液，包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的HotStart Taq DNA聚合酶、M-MLV反转录酶、RNase抑制剂、dNTP Mix、10×PCR Buffer、MgCl₂溶液，所述引物及探针溶于PCR反应液中。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA提取液分为溶液1，溶液2，溶液3，溶液4及溶液5，其中溶液1为Trizol试剂，溶液2为氯仿，溶液3为异丙醇，溶液4为75%乙醇，溶液5为DEPC处理水。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：

a、工作标准品1，含有1.0×10⁹ copy/ml的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的非传染性DNA片段；

b、工作标准品2，含有1.0×10⁸ copy /ml的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的非传染性DNA片段；

c、工作标准品3，含有1.0×10⁷ copy /ml的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒基因E2基因的非传染性DNA片段；

d、工作标准品4，含有1.0×10⁶ copy /ml的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因的非传染性DNA片段。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分含量的配比为：DEPC处理水用量4 μl；5 U/μl的热启动Taq酶0.9 μl； 200 U/μl M-MLV反转录酶2.0 μl; RNase抑制剂1.0 μl；10 mmol/l 的dNTP Mix 12 μl；10×一步法RT-PCR Buffer 5 μl；50 mmol/l的 MgCl₂溶液用量10 μl；浓度为20 μmol/l的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因正向引物各0.7 μl；浓度为20 μmol/l的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因反向引物0.7 μl；浓度为20 μmol/l的甲型H1N1流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪瘟病毒E2基因荧光探针0.5 μl。

9.权利要求1或2所述引物及探针，或权利要求3~8任一所述试剂盒在检测甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒核酸中的应用。

10.一种利用权利要求3~8任一项所述的试剂盒检测甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒核酸的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）样品预处理:采集血清、鼻咽拭子、咽拭子或是病料组织；

（2）样品处理：取已处理的样本200 μl，加600 μl溶液1，充分震荡混匀，室温静置10 min；加150 μl溶液2，再次充分震荡混匀，室温静置5 min，13,000 rpm离心15 min，取上清置等体积预冷的溶液3中，温和颠倒混匀，静置10 min，12,000 rpm离心10 min，弃上清，加入1,000 μl 75%溶液4洗涤沉淀2次，8,000 rpm离心5 min，去上清，干燥2～5 min，加15～30 μl溶液5溶解，-80℃保存；其中溶液1为Trizol试剂，溶液2为氯仿，溶液3为异丙醇，溶液4为75%乙醇，溶液5为DEPC处理水；

（3）加样：向装有45 μl PCR 反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品，阴性质控品，阳性质控品，临界阳性质控品，工作标准品各5 μl，盖好管盖，5,000 rpm离心10 s；

（4）PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，按下列条件进行PCR扩增；

42℃ 60 min，1个循环；

94℃ 5 min， 1个循环;

94℃ 30 s ，58℃ 45 s，5个循环；

94℃ 30 s ，58℃ 45 s，35个循环；收集荧光信号，在反应程序的第四步的终了读取荧光值;

（5）分析判断：Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于或等于28且小于或等于32的为临界阳性。