CN101724712B - 动物虫媒病多重rt-pcr鉴别检测试剂及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域。尤其是一种能够同时鉴别检测四种动物虫媒病的试剂，以及这种试剂的制备方法和应用。本发明所述的动物虫媒病多重RT-PCR鉴别检测试剂包含四对特异性引物，BTV、EHDV、VSV、AKV各自的扩增目标片段长度为351bp、536bp、300bp和250bp。本发明系分别选择蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血病病毒(EHDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、赤羽病病毒(AKV)的VP7和N基因的保守片段为靶目标，应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计合成引物。将设计的多对引物进行最佳配对筛选实验和多重RT-PCR试验，并经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，得到如上所述的可进行四种动物虫媒病鉴别检测的扩增效率高和特异性好的四对引物。本试剂所组成的试剂盒可在收到样品后6小时之内作出定性、鉴别检测结果。该多重RT-PCR鉴别检测试剂是一种检测临床样品中BTV、EHDV、VSV、AKV的敏感和可靠的方法。

Description

动物虫媒病多重RT-PCR鉴别检测试剂及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。尤其是一种能够同时鉴别检测四种动物虫媒病的试剂，以及这种试剂的制备方法和应用。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue disease，BLU)是由呼肠孤病毒科(reoviridae)环状病毒属(Obivirusgenus)的蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的一种烈性动物传染病，由库蠓传播，主要危害绵羊、山羊、牛等家畜，并在世界范围内广泛流行，世界动物卫生组织(World organisationfor animal health，OIE)将BLU列为重要动物传染病。在很多国家动物贸易协定中，BLU是必须进行检疫的传染病之一。近年来，随着气候变暖，BLU在欧洲许多国家的发病率增加，严重影响着国际动物贸易。BTV共有24个血清型，BTV基因组含有10个双链RNA片段(dsRNA)，由19218bp组成，编码7种结构蛋白(VP1-VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3A)，7种结构蛋白的4种形成双层蛋白衣壳，外壳主要由VP2和VP5构成，而内壳主要由VP3和VP7构成。VP7是核芯衣壳表面壳粒的主要成分，约占病毒总蛋白的1/3，是病毒可溶性群特异性抗原。VP7基因也是BTV群特异性分子检测的靶基因。

鹿流行性出血病(epizootic haemorrhagic disease of deer，EHD)是一种季节性、非接触性的病毒性传染病。鹿流行性出血病病毒(EHDV)也是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)的成员，是通过节肢动物(主要是库蠓)传播的双股RNA病毒。在自然条件下，鹿流行性出血病病毒可引起牛、绵羊等家畜及白尾鹿、糜、大角羚羊等多种驯养和野生反刍动物感染。临床特征为体温短暂升高，呈休克症状，粘膜和浆膜出血，于昏迷状态下死亡。病变呈广泛性充血、出血、严重水肿和血管坏死，有时出现腹膜水肿。目前EHD共发现8个血清型，分别是EHDV-1、EHDV-2、EHDV-3、EHDV-4，EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8等。EHDV在形态结构上与蓝舌病病毒极为相似，血清学上与蓝舌病有明显交叉，其VP7蛋白是病毒可溶性群特异性抗原，VP7基因也是EHDV群特异性分子检测的靶基因。本病目前尚无有效疫苗和治疗措施，控制和消灭EHD必须花费大量的人力物力，出口贸易也因此受限，给EHDV流行的国家带来很大的经济损失。EHDV的快速检测方法和试剂是动物检疫中急需解决的关键技术问题。

水泡性口炎(Vesicular stomatitis，VS)是由水泡性口炎病毒(VSV)引起的牛、猪、马、鹿等多种动物和人感染的一种病毒性人畜共患病。VSV属于弹状病毒科水泡病毒属的病毒。分为两个血清型：新泽西型(VSV-NJ)和印第安那型(VSV-IND)。它是牛、猪、马的流行性和散发性疾病，还可感染其它许多哺乳动物。人对此病毒易感，可产生类似流感样症状和口腔、手足的水泡。牛、猪、马感染后引起严重的口腔粘膜、乳头皮肤及蹄冠皮肤出现水泡及糜烂，造成巨大的经济损失。临床症状与口蹄疫(FMD)、水泡病(SVD)和水泡疹(VE)很相似，不易区别。

赤羽病是由赤羽病病毒(Akabane virus，AKV)引起的牛、羊等动物流产、死产、死胎、胎儿畸形、以及先天性关节弯曲一积水性无脑综合征的一种动物虫媒传染病。1990年时证实该病在我国存在。赤羽病病毒属于布尼病毒科(Bunyaviridae)布尼病毒属辛布(simbu)病毒血清群的一个亚群，为单股负链RNA病毒。目前，赤羽病的诊断主要通过病毒分离、琼脂免疫扩散试验(AGID)、中和试验和ELISA试验等方法。AKA给畜牧业造成了严重的经济损失，是我国动物疾病防制和国际动物贸易中的重点检疫对象。因此有必要加强对该病的研究与检测监控，防止该病在我国的发生、传播和大规模流行。

近年来，随着全球气候的变化、生态环境的改变、世界经济一体化进程的加快、人员交往频繁和国际间动物贸易的逐年增加，重要动物虫媒病如蓝舌病、鹿流行性出血热病、水泡性口炎和赤羽病在全球范围内大范围流行和传播，严重威胁着动物健康和畜牧业发展，对人类健康、社会稳定和农业经济发展也带来不良影响。这四种疫病症状相似，需要进行实验室鉴别诊断。这四种疫病的常规诊断方法是病原分离鉴定和血清学方法，但这些方法存在敏感性低、特异性差，操作费时费力等局限性。因此，建立一种可同时对四种病毒进行快速、特异、敏感和简便的分子生物学鉴别检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种能够同时鉴别检测蓝舌病病毒、鹿流行性出血病病毒、水泡性口炎病毒和赤羽病病毒的动物虫媒病多重RT-PCR鉴别检测试剂。

本发明的另一目的是提供这种检测试剂的制备方法。

本发明的再一目的是提供这种检测试剂的应用。

本发明所述的动物虫媒病多重RT-PCR鉴别检测试剂包含四对特异性引物，BTV、EHDV、VSV、AKV各自的扩增目标片段长度为351bp、536bp、300bp和250bp，引物序列为：

BTV引物：BTV-P1：5’-CTTCCTTGAAACTGAGGAAACCTT-3’

BTV-P2：5’-ATTTGCACCATCGCATTCTG-3’；

EHDV引物：EHDV-P1：5’-CCAGAATGTTACTACATCAATCGTATCCT-3’

EHDV-P2：5’-GGCGCCAATACGCTAAAGG-3’；

VSV引物：VSV-P1：5’-GGCTTCCCATCTACATCCTAGG-3’

VSV-P2：5’-TGCCCAAATGTTGCAAGTG-3’；

AKV引物：AKV-P1：5’-CAACGATGTTCCACAACGG-3’

AKV-P2：5’-GGCAGTGTCTGACACTGGATT-3’。

本发明系分别选择蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血病病毒(EHDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、赤羽病病毒(AKV)的VP7和N基因的保守片段为靶目标，应用primer Express软件和primerprere5.0软件，设计合成引物。将设计的多对引物进行最佳配对筛选实验和多重RT-PCR试验，并经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，得到如上所述的可进行四种动物虫媒病鉴别检测的扩增效率高和特异性好的四对引物。

本发明所述的动物虫媒病多重RT-PCR鉴别检测试剂的制备方法由以下步骤组成：

一、选择蓝舌病病毒VP7基因序列的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

CTTCCTTGAAACTGAGGAAACCTTCCAACCAGGGAGGTGGTTCATGCGCGCCGCTCAAGCAGTAACTG

CAGTAGTGTGCGGTCCGGATATGATTCAAGTGTCACTTAATGGCGGAGCGAGAGGAGATGTACAACAG

ATATTTCAGGGTCGTAATGATCCCATGATGATATATTTAGTGTGGAGGAGAATCGAAAACTTTGCGATG

GCGCAAGGTAATTCACAGCAAACTCAAGCGGGTGTGACTGTCAGTGTTGGTGGAGTTGACATGAGGGC

GGGACGCATTATAGCATGGGATGGACAGGCCGCGCTGCATGTGCATAATCCGACACAACAGAATGCGA

TGGTGCAAAT；

二、选择鹿流行性出血病病毒VP7基因序列的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

CCAGAATGTTACTACATCAATCGTATCCTCGACTTTAGCTCAGGTTTCAATGAATGCTGGGGCACGGGG

TGATATCCAGGCGCTATTTCAAAATCAAAATGATCCTGTAATGATTTACTTTGTGTGGAGACGAATTGG

GACTTTTTCGAATGCAGCGGGTAATGCACAAGATACACCTCAGGGCGTGACTCTGAACGTGGGGGGTG

TAAACATGAGGGCTGGTGTGATAATAGCTTATGATGGGCAAGCGCCGGTTAATGTGAATAACCCAGGT

CTAGGACAAGGTATGATCGAGATTGAAGTGATCTATTATTTGAGTTTAGACAAAACCATGACCCAGTAT

CCATCATTACAAGCACATATATTCAATGTTTACTCATATAAGAATCCTTTGTGGCATGGACTACGAGCT

GCGATTCTTAACAGAACAACGCTACCAAACAATATACCGCCCATTTATCCGCCTCATGATCGCGAGAAC

GTTTTGTTGATAATATTGCTGTCAGCTTTAGCAGATGCCTTTAGCGTATTGGCGCC；

三、选择水泡性口炎病毒N基因序列的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

GGCTTCCCATCTACATCCTAGGTCTTTACAGAGTGGGCAGATCTAAAGTTACGGATTACAGAAAGAAACT

ACTGGACGGGCTTGAAAATCAGTGCAAAGTGGCGTCAACCAGATTTGAGAGTCTAGTCGAGGATGGTCT

CGACTTCTTTAACATATGGGAGAATGATCCAAATTTCACCAAGATAGTTGCTGCAGTGGATATGTTCTTCC

ACATGCTCAAAAAGCATGAACGTGCTCCAATCAGATACGGAACCATAGTCTCAAGATTCAAGGACTGTG

CAGCACTTGCAACATTTGGGCA；

四、选择赤羽病病毒N基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

CAACGATGTTCCACAACGGAATGCAGCTACATTTAACCCGGATGCAGGGTATGTGGCATTTATCAGTA

AGTATGGGCAGCAGCTCAACTTTACTGTTGCTAGAGTCTTCTTCCTCAACCAGAAGAAGGCCAAGATGG

TCTTACATAAGACGCCACAACCAAGTGTCGATCTTACTTTTGCAGGGGTCAAATTTACAGTGGTTAATA

ACCATTTTCCCCAGTACACTGCAAATCCAGTGTCAGACACTGCC。

五、应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物；

六、引物的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

七、将设计合成的多对引物进行最佳配对筛选实验后，确定并得到扩增效率高和特异性好的四对引物。

本发明所述的蓝舌病、鹿流行性出血病、水泡性口炎和赤羽病病毒快速有效的多重RT-PCR鉴别检测方法是在同一PCR体系中，放入BTV、EHDV、VSV和AKV的四对引物，对四种病毒的目的基因同时扩增的分子生物学诊断方法，它具有快速、敏感、特异等优点。通过对各血清型和流行病毒株基因进行全面分析，确定出扩增病毒基因的靶序列，设计出适用于对蓝舌病、鹿流行性出血病、水泡性口炎和赤羽病病毒进行多重RT-PCR检测的特异性扩增引物，并通过PCR实验优化出了引物浓度，建立了稳定、高效、快速地检测蓝舌病、鹿流行性出血病、水泡性口炎和赤羽病病毒的多重RT-PCR检测方法，再进一步通过各反应组份的优化来制备鉴别检测试剂。

本发明涉及动物虫媒病多重RT-PCR鉴别检测试剂在制备试剂盒中的应用。

本发明的优点和积极效果为：

1、本多重RT-PCR鉴别检测试剂与常规的RT-PCR相比较，该方法具有快速、特异、敏感、可同时检测和鉴别四种动物虫媒病病毒等优点。对肉食品中低含量的BTV、EHDV、VSV、AKV病毒样品、隐性感染或持续带毒宿主和发病动物进行准确检测。

2、本多重RT-PCR鉴别检测试剂可对细胞培养物、组织、水泡液及分泌物、血液、肉品等多种样品中的BTV、EHDV、VSV、AKV进行快速检测，样品适用范围广，试剂中均为无感染性的、没有生物安全隐患的成份，使用安全的优点。

3、本试剂所组成的试剂盒可在收到样品后6小时之内作出定性、鉴别检测结果。该多重RT-PCR鉴别检测试剂是一种检测临床样品中BTV、EHDV、VSV、AKV的敏感和可靠的方法。

具体实施方式

1、设计引物

本发明选择BTVVP7基因、EHDVVP7基因、VSVN基因和AKVN基因的保守片段为靶目标，通过对GenBank中报道的BTV、EHDV、VSV、AKV基因的cDNA序列进行同源性分析比较，分别选定BTVVP7基因、EHDVVP7基因、VSVN基因和AKVN基因的保守片段，应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物，引物的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA引物的合成。将设计合成的多对引物进行最佳配对筛选实验和交叉反应试验后，确定四种病毒各自的扩增效率和特异性均最好的四对引物，扩增目标片段长度分别为351bp、536bp、300bp和250bp。

2、RNA提取

BTV、EHDV、VSV、AKV病毒RNA和标准品同时制备。参照黄祯祥主编《医学病毒学基础及实验技术》，科学出版社(1990年)第143-146页，先测定毒价，以Reed和Muench氏法计算TCID₅₀。取100μL病毒原液，参照卢圣栋主编《分子生物学实验室常用技术》，科学出版社(1999年)第61-62页，酚/氯仿核酸抽提法提取RNA。用无RNA酶的超纯水溶解总RNA，稀释成相当于10000、1000、100、10、1、0.1TCID₅₀的每个反应管。分泌液、血液(抗凝血)、血清和细胞组织等材料直接提取RNA。

3、BTV VP7基因、EHDV VP7基因、VSV N基因和AKV N基因重组质粒的构建和标准品的制备

按照胡福泉等《现代基因操作技术》，人民军医出版社(2000年)，第142～145页，进行BTV VP7、EHDV VP7、VSV N、AKV N基因的克隆、测序，构建BTV VP7、EHDV VP7、VSVN、AKV N基因重组质粒，经质粒的抽提，浓度的测定，计算出拷贝数，以制备标准品。

4、cDNA的反转录

取一支200μL PCR反应管，反应总体积为20μL，RT 5×buffer 4μL，(5U/μL)RNA酶抑制剂0.5μL，10mM dNTPs 6μL，下游引物1μL，AMV(5U/μL)逆转录酶0.5μL，灭菌双蒸水补足至20μL。置室温10min，42℃水浴60min，最后94℃5min灭活AMV逆转录酶，后置冰盒，则反转录为cDNA。

5、常规PCR及其扩增条件优化和单对引物扩增的特异性

PCR反应时，分别将上述VSV、BTV、EHDV和AKV的cDNA产物作为模板，在管内分别加入相对的4对引物进行PCR扩增。反应条件为：以5μL为模板，稀释好的引物P1、P2各1μL，10mM dNTP 1μL，10×Buffer5μL，25mM Mgcl₂5μL，5U rTaq酶1μL，加水补足50μL。PCR反应循环参数为：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃复性40s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。取10μL PCR产物在2％琼脂糖凝胶电泳检测。

按上述建立了常规PCR及其扩增条件优化后，先进行单对特异性引物进行扩增，并对引物浓度进行优化。VSV检测引物浓度为20pM，BTV检测引物为25pM，EHDV检测引物浓度为40pM，AKV检测引物为25pM时，可以准确地诊断出四种动物虫媒病病毒。

6、多重RT-PCR和多对引物扩增的特异性

引物浓度和其它反应组份的浓度进行精确筛选，以获得扩增效率高、产量高、特异性好、无非特异性条带的各反应组份的最佳浓度和最佳反应条件。每次检测时，设立用水代替病毒RNA样品的3个阴性对照(或正常组织、细胞阴性对照)；设立不同稀释度的阳性标准品对照；每个样品检测做3管平行试验。在3个阴性对照为阴性、阳性对照为阳性时，整个试验有效，可进一步判定结果。每个样品须作多个备份，以进行稳定性、重复性试验。

在单对引物扩增条件的基础上，分别以VSV、BTV、EHDV和AKV cDNA产物作为模板，在同一管内同时加入4对引物进行PCR扩增，并在其中一管加入4种病毒RNA，反应条件及PCR反应参数如上述5。PCR扩增结束后取10uL扩增产物于2％的琼脂糖凝胶(含0.5ug/mL溴化乙锭)中电泳检测。经多重PCR同时扩增出了VSV(300bp)、BTV(351bp)、EHDV(536bp)and AKV(250bp)的特异性片段。从附图可见4种病毒扩增的各个片段与预期设计的片段大小一致。

7、多重RT-PCR的敏感性

用VSV、BTV、EHDV、AKV四种病毒的BHK21细胞培养物，各取250μL混合，提取总RNA，系列稀释成10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，以4种病毒的4对引物混合液对其进行多重PCR扩增检测。结果四种病毒均可检测到稀释成10^-7的样品。

8、对样品的检测

应用多重RT-PCR对BTV、EHDV、VSV和AKV细胞培养物总RNA样品、送检样品以及正常BHK-21细胞、猪牛羊的上皮组织等50份样品的检测结果表明，BTV阳性样品出现351bp的特异性扩增片段，EHDV阳性样品出现536bp的特异性扩增片段，VSV阳性样品出现300bp的特异性扩增片段，AKV阳性样品出现250bp的特异性扩增片段。多重RT-PCR对BTV、EHDV、VSV和AKV样品的检测特异性强、敏感性高、重复性很好。

9、动物虫媒病多重RT-PCR鉴别检测的标准化试剂和应用时的检测程序

9.1试剂盒组成：根据上述1～8试验结果，按照反应条件优选、对比试验和验证试验确定的反应条件和各组份浓度，配制如下试剂盒组份：

溶液I(TrizoL)	25ml
		溶液II(三氯甲烧)	5ml
溶液III(异丙醇)	12.5ml
		溶液IV(75％乙醇)	25ml
溶液V(本试剂+RT混合液)	200μl
		溶液VI(RT酶混合液)	50μl
溶液VII(本试剂+PCR混合液)	625μl
		溶液VIII(Taq DNA聚合酶)	25μl
溶液IX(DEPC-H20)	20ml
		溶液X-1(BTV阳性cDNA)	50μl
溶液X-2(EHDV阳性cDNA)	50μl
		溶液X-3(VSV阳性cDNA)	50μl
溶液X-4(AKV阳性cDNA)	50μl
		溶液XI(电泳加样缓冲液)	1000μl

9.2应用操作方法

9.2.1总RNA提取

(1)取1ml～1.5ml组织样品研磨上清液或液体样品置1.5ml eppendorf管中，12000rpm，4℃，离心5min，弃上清液。

(2)加入1ml溶液I，充分振荡混匀，置室温5min，彻底裂解。

(3)加200μl溶液II，小心盖上帽盖，用力快速振荡15sec，室温放置3min。

(4)12000rpm，4℃，离心15min。

(5)小心吸取上层水相，转移至一新的1.5ml eppendorf管中，加入500μl溶液III，混匀，室温放置10min。

(6)13000rpm，4℃，离心10min，弃上清液。

(7)加1000μl溶液IV，充分振荡混匀，12000rpm，4℃，离心5min。小心充上清液。管底部可见有乳白色胶样RNA沉淀。

(8)小心打开管盖，室温自然干燥沉底的RNA。

(9)取11μl溶液IX置入已半干燥的沉底RNA，溶解RNA。可直接用于反转录或-70℃保存备用。

9.2.2反转录

取一支200μl PCR反应管，反应总体积为20μl，向反应管中加入下列反应物：

8.2.3PCR扩增

取一支200μl PCR反应管，反应总体积为50μl，向反应管中加入下列反应物：

9.2.4结果分析和判定

(1)用TBE或TAE电泳缓冲液配制2％的琼脂糖(含0.5μg/mL EB)平板。

称取2g琼脂糖，加入100ml 1×TAE或TBE(配制方法：三羟甲基氨基甲烷54g，硼酸27.5g，乙二胺四乙酸2.922g，用去离子水1000mL溶解；用5mol/L的盐酸调到pH8.0；使用时用去离子水稀释至1倍的TBE电泳缓冲液)缓冲液中。微波炉中加热融化后加5μl(10mg/ml)溴化乙锭(配制方法：溴化乙锭用去离子水配制成10mg/mL，用时每100mL琼脂中加5μL)，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘平扳中，胶板厚为5mm左右。按照样品数量选择适宜的梳子，待凝胶冷却凝固后拔出梳子，将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将8μL样品和2μL溶液XI混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照，推荐使用100bp DNALadder Marker和150bp DNA Ladder Marker。5V/cm电泳约30min，当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察有无特异性DNA片段扩增产物。

(2)结果观察和判定

电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪或紫外图像分析仪上打开紫外灯观察。阳性和阴性对照成立，检测样品无非特异性条带产生，则该试验成立。可进行结果判定。

A、BTV阳性对照：PCR后会出现一条351bp的DNA片段。

B、EHDV阳性对照：PCR后会出现一条536bp的DNA片段。

C、VSV阳性对照：PCR后会出现一条300bp的DNA片段。

D、AKV阳性对照：PCR后会出现一条250bp的DNA片段。

如某一待检样品扩增产物的DNA带有一条或一条以上与阳性对照相应的DNA带，即在一条直线上，它们与加样孔的距离相同，同时阴性对照无扩增条带，则该样品相应地判定为阳性。

——泳道1：100bp DNA Ladder Marker(1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)；

——泳道2：VSV(300bp)；

——泳道4：BTV(351bp)；

——泳道6：EHDV(536bp)；

——泳道8：AKV(250bp)；

——10：VSV、BTV、EHDV、AKV病毒混合液，在同一个PCR反应管中同时扩增出四条DNA片段，分别是EHDV(536bp)、BTV(351bp)、VSV(300bp)、AKV(250bp)；

——泳道3、泳道5、泳道7、泳道9和泳道11：阴性对照；

——泳道12：150bp DNA Ladder Marker(1200bp、900bp、750bp、600bp、450bp、300bp、150bp)。

Claims (3)

1.一种动物虫媒病多重RT-PCR鉴别检测试剂，其特征在于包含四对特异性引物，蓝舌病病毒、鹿流行性出血病病毒、水泡性口炎病毒、赤羽病病毒各自的扩增目标片段长度为351bp、537bp、301bp和250bp，引物序列为：

BTV引物：BTV-P1：5’-CTTCCTTGAAACTGAGGAAACCTT-3’

BTV-P2：5’-ATTTGCACCATCGCATTCTG-3’；

EHDV引物：EHDV-P1：5’-CCAGAATGTTACTACATCAATCGTATCCT-3’

EHDV-P2：5’-GGCGCCAATACGCTAAAGG-3’；

VSV引物：VSV-P1：5’-GGCTTCCCATCTACATCCTAGG-3’

VSV-P2：5’-TGCCCAAATGTTGCAAGTG-3’；

AKV引物：AKV-P1：5’-CAACGATGTTCCACAACGG-3’

AKV-P2：5’-GGCAGTGTCTGACACTGGATT-3’。

2.如权利要求1所述的动物虫媒病多重RT-PCR鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

一、选择蓝舌病病毒VP7基因序列的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：CTTCCTTGAAACTGAGGAAACCTTCCAACCAGGGAGGTGGTTCATGCGCGCCGCTCAAGCAGTAACTGCAGTAGTGTGCGGTCCGGATATGATTCAAGTGTCACTTAATGGCGGAGCGAGAGGAGATGTACAACAGATATTTCAGGGTCGTAATGATCCCATGATGATATATTTAGTGTGGAGGAGAATCGAAAACTTTGCGATGGCGCAAGGTAATTCACAGCAAACTCAAGCGGGTGTGACTGTCAGTGTTGGTGGAGTTGACATGAGGGCGGGACGCATTATAGCATGGGATGGACAGGCCGCGCTGCATGTGCATAATCCGACACAACAGAATGCGATGGTGCAAAT；

二、选择鹿流行性出血病病毒VP7基因序列的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

CCAGAATGTTACTACATCAATCGTATCCTCGACTTTAGCTCAGGTTTCAATGAATGCTGGGGCACGGGGTGATATCCAGGCGCTATTTCAAAATCAAAATGATCCTGTAATGATTTACTTTGTGTGGAGACGAATTGGGACTTTTTCGAATGCAGCGGGTAATGCACAAGATACACCTCAGGGCGTGACTCTGAACGTGGGGGGTGTAAACATGAGGGCTGGTGTGATAATAGCTTATGATGGGCAAGCGCCGGTTAATGTGAATAACCCAGGTCTAGGACAAGGTATGATCGAGATTGAAGTGATCTATTATTTGAGTTTAGACAAAACCATGACCCAGTA TCCATCATTACAAGCACATATATTCAATGTTTACTCATATAAGAATCCTTTGTGGCATGGACTACGAGCTGCGATTCTTAACAGAACAACGCTACCAAACAATATACCGCCCATTTATCCGCCTCATGATCGCGAGAACGTTTTGTTGATAATATTGCTGTCAGCTTTAGCAGATGCCTTTAGCGTATTGGCGCC；

三、选择水泡性口炎病毒N基因序列的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：GGCTTCCCATCTACATCCTAGGTCTTTACAGAGTGGGCAGATCTAAAGTTACGGATTACAGAAAGAAACTACTGGACGGGCTTGAAAATCAGTGCAAAGTGGCGTCAACCAGATTTGAGAGTCTAGTCGAGGATGGTCTCGACTTCTTTAACATATGGGAGAATGATCCAAATTTCACCAAGATAGTTGCTGCAGTGGATATGTTCTTCCACATGCTCAAAAAGCATGAACGTGCTCCAATCAGATACGGAACCATAGTCTCAAGATTCAAGGACTGTGCAGCACTTGCAACATTTGGGCA；

四、选择赤羽病病毒N基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：CAACGATGTTCCACAACGGAATGCAGCTACATTTAACCCGGATGCAGGGTATGTGGCATTTATCAGTAAGTATGGGCAGCAGCTCAACTTTACTGTTGCTAGAGTCTTCTTCCTCAACCAGAAGAAGGCCAAGATGGTCTTACATAAGACGCCACAACCAAGTGTCGATCTTACTTTTGCAGGGGTCAAATTTACAGTGGTTAATAACCATTTTCCCCAGTACACTGCAAATCCAGTGTCAGACACTGCC；

五、应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物；

六、引物的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

七、将设计合成的多对引物进行最佳配对筛选实验后，确定并得到权利要求1所述的四对引物。

3.权利要求1所述的动物虫媒病多重RT-PCR鉴别检测试剂在制备试剂盒中的应用。