CN101629217A

CN101629217A - 猪流感病毒rt-lamp检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN101629217A
Application number: CN200910087563A
Authority: CN
Inventors: 刘业兵; 张磊; 宁宜宝; 陈蕾
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2009-06-30
Filing date: 2009-06-30
Publication date: 2010-01-20
Anticipated expiration: 2029-06-30
Also published as: CN101629217B

Abstract

本发明涉及一种猪流感病毒RT－LAMP检测试剂盒及其检测方法。根据GenBank公布的SIV不同亚型的基因序列，针对PA序列相对保守区域设计了SIV RT－LAMP简并引物6条，以猪流感H1、H3、H5、H9亚型毒株为模板，建立了可以检测所有亚型猪流感毒的RT－LAMP方法。利用LA－320 LAMP Tubidimeter仪分析反应过程并判定结果，显示在LA－320 LAMP Tubidimeter仪中63℃反应45min，所有实验用的4种亚型SIV样品RNA均获得了高效的特异性扩增。通过敏感性试验证明：本方法可对100TCID₅₀ SIV样品RNA进行10^－4稀释后仍可高效扩增，显示出本方法高度的敏感性；通过特异性实验和19份临床样品的SIV病原的RT－LAMP检测，有5份样品检测到病料中SIV核酸为阳性，与RT－PCR、鸡胚分离结果一致，经基因芯片分型鉴定验证，综合结果符合率为100％。显示本方法特异、敏感、快速，适合用于各种试验条件下SIV的检测。

Description

猪流感病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种猪流感病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法，属于兽用生物制品领域中疫病诊断技术。

背景技术

猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)属正黏病毒科，它可引起猪的一种急性、高度接触性呼吸道传染病——猪流感。猪在禽-猪-人的流感病毒跨种属障碍而感染新宿主的过程流感种间传播过程中，起着中间宿主及多重宿主的作用。由于猪上皮细胞具有唾液酸α-2，3半乳糖苷(SAα-2，3-Gal)和唾液酸α-2，6半乳糖苷(SAα-2，6-Gal)，人流感病毒可与前者结合，而禽流感病毒与后者结合。因此，猪上皮细胞就能够被人流感病毒和禽流感病毒感染，而成为毒株间基因重排的活载体。由于流感病毒可直接感染人，导致人类患病或死亡，其公共卫生意义日渐显著。

在临床中，猪流感病毒常见以H1、H3亚型为主(李海燕等.部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定[J]动物医学进展，2003，03)，后来又有从猪体分离到H5N1、H9N2亚型流感毒株的报道(李海燕等.中国猪源H5N1和H9N2亚型流感病毒的分离鉴定[J]中国预防兽医学报，)。在SIV的检测工作当中，目前多使用病毒分离、HI、ELASA和RT-PCR方法。由于这些方法检测周期长、特异性与敏感性方面存在一定局限性，限制了在基层的推广使用。

环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi等发明的一种新型核酸扩增技术(Notomi，T.，et al.，Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000，28，e63.)，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(2007)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其他与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、彩虹病毒、人类疱疹病毒8型、造血组织坏死病毒(IHHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒等。目前国内外均未见有用于检测猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒及RT-LAMP方法在猪流感病毒检测中的应用的报道。

发明内容

本发明的目的是建立检测猪流感病毒的RT-LAMP检测方法，并提供一种用于以上目的的RT-LAMP试剂盒。

本发明的技术方案

本发明的原理及技术路线

新型的核酸扩增(LAMP)技术在检测工作中具有速度快、特异性强、敏感度高的优势，但是由于猪流感病毒不同亚型间的基因序列差异比较大，难以设计猪流感病毒不同亚型通用的RT-LAMP检测引物，对LAMP技术在SIV的检测中应用造成了很大的困难。

本发明人为解决RT-LAMP在猪流感通用检测上存在的困难，在猪流感病毒PA基因上截取长300bp相对保守的序列基因设计SIV RT-LAMP的工作引物，并进行了简并处理，增加了引物对不同亚型SIV中存在的目的序列扩增的敏感性。建立针对SIV的环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测方法，本方法具有多引物同时扩增，并在两端形成了带有引物功能的环状结构，这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等特点，由于RT和LAMP反应在同管中同时进行简化了操作步骤，同时因为RT-LAMP反应的产物中包含大量核酸和焦磷酸镁的沉淀，可以用荧光剂显色肉眼来判定，适用于各种实验条件下检测工作的使用。

本发明的方法具体实施

1SIV RT-LAMP检测方法的建立和验证

(1)反应用试剂的制备

1)SIV RT-LAMP引物设计根据GenBank公布的SIV包括多种亚型HA和NA序列共54株，利用DNAMAN5.9和DNAstar5.0进行序列分析。在54株SIV毒株的比对中发现其PA序列中550nt～780nt之间的突变较少，其长度适合RT-LAMP实验要求。参考H1N1型SIV序列设计引物。将设计的引物和54株SIV的序列再次进行比对，将引物靠近5’端和3’处各亚型SIV中存在差异的序列采取简并处理(图1)，按照RNA LAMP kit的说明建立SIV RT-LAMP的反应体系对各套引物进行试验筛选，通过试验筛选结果的分析，确定以下这套引物为本方法的工作引物，序列1、2、3、4、5和6如下：

序列1(F3-PA)：AGGGGTCTATGGGATTCCTT

序列2(B3-PA)：GAAAGCTTGCCCTCAATG

序列3(FIP-PA)：WCGCATGGTTCCTGCGATTTCATCGTCAGTCCGAAAGAGGC

序列4(BIP-PA)：RRCTTGCCGACCAAAGTCTCTCGGTTCGAATCCATCCACA

序列5(LF-PA)：AATCTTTCTTCAATTGTGTC

序列6(LB-PA)：CCGAACTTCTCCAGCCTTGA

2)RT-LAMP反应体系中试剂的配制(50个反应量)

①引物混合液PM：取100pmol/μl F3-PA 2.5μl、100pmol/μl B3-PA 2.5μl、100pmol/μlFIP-PA 20.0μl，100pmol/μl BIP-PA 20.0μl、100pmol/μl LF-PA 10.0μl、100pmol/μlLB-PA 10.0μl混合，灭菌去离子水定容至总体系75.0μl。每个反应需取1.5μl PM。

②反应缓冲混合液RM：取4mmol/μl硫酸镁取50μl、1.6mol/μl甜菜碱50μl、10mmol/μldNTPs 50μl，溶于475μl PCR级水中定溶至625μl。每个反应需取12.5μl RM。

③反应酶混合液EM：取16U/μl Bst大片段DNA聚合酶24μl，400U/μl AMV反转录酶24μl，1μmol/μl DTT 2μl。每个反应需要取1μl EM。

④显色剂：，取1μlSYBRgreenI(购自Invitrogen公司)溶于49μl PCR级水。每个反应加1μl。

(2)样品RNA的制备

1)RNA提取试剂(LBBII-RNA)

RA：取1％2-巯基乙醇0.60ml、1％Tris-HCL(pH 8.0)0.60ml、10mmol/ml EDTA 1ml溶于5.0ml灭菌双蒸水中。

RB：6mmol/ml异硫氰酸胍35ml.

RC：无水乙醇15ml。

RD：100u/μl DNAse A 20μl溶于10ml DEPC H₂O。

2)样品RNA的提取

取100μl细胞培养物(或鼻腔拭子浸出样品)，经反复冻融3次后，按如下步骤进行操作：

样品中加入样品等体积RA，涡旋15s，12000g离心1min，取上清置于新管中；

在1中上清液中加入3倍的RB溶液，涡旋或剧烈震荡90s，静置3min；

加入1/3体积的RC溶液，涡旋1min，12000g离心1min。弃去上清液；放置5min后样品干燥，再加入11μl RD，溶解沉淀，即为样品RNA，作为扩增用的RNA模板。

(3)样品检测

1)本发明的反应体系为20μl

①配制RT-LAMP反应液：RM 12.5μl，EM 1.0μl，PM 1.5μl；

②取5.0μl样品RNA加到①项配制的RT-LAMP反应液中；

③混和后在63℃恒温水浴锅中作用45min。

④结果判定：反应结束后在SIV RT-LAMP反应产物中加入1μL的显色剂，肉眼观察反应液颜色变化。阴性反应的反应液呈现橘红色，阳性样品的反应液呈绿色。

(4)反应结果的验证

1)SIV RT-LAMP产物的Tubidimeter real-time的鉴定按照以上本发明确定的引物及建立的反应体系，对不同亚型SIV毒株的RT-LAMP产物进行Tubidimeter real-time吸光度鉴定，图2为SIV RT-LAMP产物的Tubidimeter real-time吸光度鉴定曲线图和柱形图。其中CH1为阴性对照，2～7分别为各亚型SIV毒株，CH8水为模版扩增对照，图2显示结果与预期相符。CH2～7各亚型SIV毒株RNA模版SIV RT-LAMP反应达到阳性判定值时最快耗时23min，全部反应结束共用时45min。

2)SIV RT-LAMP特异性试验图3为Tubidimeter LA-320LAMP反应的柱形结果图，横轴数字表示1～8为样品，纵轴为反应产物吸光度值。图3表明：以SIV参考株H1N1、H3N2作为阳性对照，DEPC处理的水作为阴性对照，检测按本发明提出的方法提取的RRSV、CHLV、PRV、PPV、PCV2核酸模板，验证所建立LAMP方法的特异性，结果阳性、阴性对照成立，SIV两个亚型参考毒株RNA模版RT-LAMP反应呈阳性，其它试验样品呈阴性，说明该引物及建立的SIV RT-LAMP方法具有很高的特异性

3)SIV-RT-LAMP敏感性试验用建立的SIV RT-LAMP方法扩增按本发明提出的提取SIV参考毒株(H1N1)的RNA模板(10ng/μl)，稀释成1～10^-5稀释度，用TubidimeterLA-320分析结果。结果见图4，表明：按照45分钟作为判定时限，100TCID₅₀的SIV病毒RNA模板稀释到10^-4时仍能快速有效的扩增。通过敏感性试验的曲线分析图(图5)发现，随着模版的稀释度增加只反应起点时间延长，而反应的速率和峰值变化很小。

4)SIV-RT-LAMP检测应用实验结果对临床采集19份疑似SIV的发病猪病料，按照本发明提出的方法抽提样品的总RNA，用建立的SIV RT-LAMP方法检测同RT-PCR、鸡胚分离鉴定进行比较，其中的阳性样品用基因芯片分型鉴定(委托韩雪清博士鉴定HanXueqing，Lin Xiangmei，et al..Simutaneously subtyping of all influenza A viruses using DNAmicroarrays.Journal of Virological Methods，2008，152117-121)，结果见表3。

表3.几种方法对19份病料部分检测结果比较(阳性+/阴性-)

样品名称	RT-LAMP	RT-PCR	病毒分离	基因芯片分型鉴定
样品名称	RT-LAMP	RT-PCR	病毒分离	基因芯片分型鉴定	H1N1(参考株)H3N2(参考株)SD12SX4223TJ2231HB2325HN14HN33GD1092	+++-++-++	+++-++-++	+++--+-+-	H1N1H3N2H1N1-H3N2H1N1-H5N1H9N2

采用SIV RT-AMP方法对19份疑似SIV的发病猪病料检测，结果显示：其中检测出有5份样品检测到病料中SIV核酸为阳性，与RT-PCR、鸡胚分离综合结果一致，经基因芯片分型鉴定结果为4中不同亚型，验证结果符合率为100％。

2试剂盒的制备(50个反应量/盒)

(1)提取样品RNA的所需试剂LBBII-RNA的配制：

RA：取1％2-巯基乙醇0.6ml、pH 8.0 1％Tris-HCL 0.6ml、10mmol/ml EDTA 1ml溶于5.0ml灭菌双蒸水中，装至无核酶的塑料容器中。

RB：6mmol/ml异硫氰酸胍35ml，装至无核酶的塑料容器中。

RC：无水乙醇15ml，装至无核酶的塑料容器中。

RD：100u/μl DNAse A 20μl溶于10ml DEPC H₂O，装至无核酶的塑料容器中。

(2)反应用试剂的制备

1)SIV RT-LAMP引物的扩增将本发明设计的如下序列引物分别扩增后备用：

F3-PA：AGGGGTCTATGGGATTCCTT

B3-PA：GAAAGCTTGCCCTCAATG

FIP-PA：WCGCATGGTTCCTGCGATTTCATCGTCAGTCCGAAAGAGGC

BIP-PA：RRCTTGCCGACCAAAGTCTCTCGGTTCGAATCCATCCACA

LF-PA：AATCTTTCTTCAATTGTGTC

LB-PA：CCGAACTTCTCCAGCCTTGA

2)RT-LAMP反应体系中试剂的配制

①PM：取100pmol/μl F3-PA 2.5μl、100pmol/μl B3-PA 2.5μl、100pmol/μl FIP-PA20.0μl，100pmol/μl BIP-PA 20.0μl、100pmol/μl LF-PA 10.0μl、100pmol/μl LB-PA10.0μl，加灭菌去离子水定容至总体系75.0μl。每个反应需取1.5μl PM。

②RM：取4mmol/μl硫酸镁取50μl、1.6mol/μl甜菜碱50μl、10mmol/μl dNTPs 50μl，溶于475μl PCR级水中定溶至625μl，装至无核酶的塑料容器中。

③EM：取16U/μl Bst大片段DNA聚合酶24μl，400U/μl AMV反转录酶24μl，1μmol/μlDTT 2μl，装至无核酶的塑料容器中。

④显色剂：取1μlSYBRgreenI(购自Invitrogen公司)溶于49μl PCR级水，装至无核酶的塑料容器中。

3.试剂盒的使用

1)使用LBBII-RNA提取样品RNA

取100μl细胞培养物(或血清、组织研磨样品)，经反复冻融3次后，按如下步骤操作：

样品中加入样品等体积RA，涡旋15s，12000g离心1min，取上清置于小管中；在上清液中加入3倍的RB溶液，涡旋或剧烈震荡90s，静置3min；加入1/3体积的RC溶液，涡旋1min，12000g离心1min。弃去上清液；待样品干燥后加入11μl RD，溶解沉淀，即为样品RNA。

2)RT-LAMP反应

①配制RT-LAMP反应液：RM 12.5μl，EM 1.0μl，PM 1.5μl；

②取5.0μl样品RNA加到①项配制的反应液中

③混和后在63℃恒温水浴锅中作用45min。

3)结果判定：反应后在SIV RT-LAMP反应产物中加入1μL的显色剂，肉眼观察反应液颜色变化。阴性反应的反应液呈现橘红色，阳性样品的反应液呈绿色。

附图说明

图1：简并引物设计图示R＝A/G，W＝A/T

图2：为SIV RT-LAMP产物的Tubidimeter real-time吸光度鉴定曲线图(2-1)和柱形图(2-2)其中CH1为阴性对照，CH 2～7分别为各亚型SIV毒株，CH8水为模版扩增对照，。

图3：特异性试验SIV RT-LAMP Tubidimeter LA-320柱形图 CH1：SIV H1N1，CH2：PRRSV，CH3：SIV H3N2，CH4：CHLV，CH5：PRV，CH6：PPV，CH7：PCV2，CH8：DEPCH2O(横轴数字表示1～8为样品，纵轴为反应产物吸光度值)。

图4：SIV H1N1参考毒株的敏感度试验Tubidimeter LA-320结果分析柱形图其中CH1为水对照，CH2为10^-1，CH3为10^-2，CH4为10^-3，CH5为10^-4，CH6为10^-5。

图5：SIV H1N1参考毒株的敏感度试验Tubidimeter LA-320结果分析曲线图其中：LINE1为10^-1，LINE2为10^-2，LINE3为10^-3，LINE4为10^-4。

图6：SIV-RT-LAMP反应产物混合显色剂后显色图例。1：阳性样品，2：阴性样品

本发明的积极意义

本发明涉及一种猪流感病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法。根据GenBank公布的SIV不同亚型的基因序列，针对PA序列相对保守区域设计了SIV RT-LAMP简并引物6条，以猪流感H1、H3、H5、H9亚型毒株为模板，建立了可以检测所有亚型猪流感毒的RT-LAMP方法。利用LA-320LAMP Tubidimeter仪分析反应过程并判定结果，显示在LA-320LAMPTubidimeter仪中63℃反应45min，所有实验用的4种亚型SIV样品RNA均获得了高效的特异性扩增。通过敏感性试验证明：本方法可对100TCID₅₀SIV样品RNA进行10^-4稀释后仍可高效扩增，显示出本方法高度的敏感性；通过特异性实验和19份临床样品的SIV病原的RT-LAMP检测，有5份样品检测到病料中SIV核酸为阳性，与RT-PCR、鸡胚分离结果一致，经基因芯片分型鉴定验证，综合结果符合率为100％。显示本方法特异、敏感、快速，适合用于各种试验条件下SIV的检测。

实施例

以下实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

SIV RT-LAMP引物设计与筛选

根据GenBank公布的SIV包括多种亚型HA和NA序列共54株，利用DNAMAN5.9和DNAstar5.0进行序列分析。在54株SIV毒株的比对中发现其PA序列中550nt～780nt之间的突变较少，长度适合RT-LAMP实验的要求。参考H1N1型SIV序列设计引物。将设计的引物和54株SIV的序列再次进行比对，将引物靠近5’端和3’处各亚型SIV中存在差异的序列采取简并处理(图1)，按照RNA LAMP kit的说明建立SIV RT-LAMP的反应体系对各套引物进行试验筛选，通过试验筛选结果的分析，确定以下这套引物为本方法的工作引物，序列如下：

F3-PA：AGGGGTCTATGGGATTCCTT

B3-PA：GAAAGCTTGCCCTCAATG

FIP-PA：WCGCATGGTTCCTGCGATTTCATCGTCAGTCCGAAAGAGGC

BIP-PA：RRCTTGCCGACCAAAGTCTCTCGGTTCGAATCCATCCACA

LF-PA：AATCTTTCTTCAATTGTGTC

LB-PA：CCGAACTTCTCCAGCCTTGA

并确定以上引物在引物混合液(PrimerMix，PM)各成分的比例：

取100pmol/μl F3-PA 2.5μl、100pmol/μl B3-PA 2.5μl、100pmol/μl FIP-PA 20.0μl，100pmol/μl BIP-PA 20.0μl、100pmol/μl LF-PA 10.0μl、100pmol/μl LB-PA 10.0μl混合，总体系75.0μl。每个反应需取1.5μl PM。

实施例2

试剂盒内组分的配制：

按以下各种组分的配方(50个反应量)配制成各种组分并分装到玻璃或塑料小容器中并用相应的塞子密封：

1.LBB II-RNA，本试剂组由RA、RB、RC、RD四部分构成：

RA：取1％2-巯基乙醇0.6ml、pH 8.01％Tris-HCL 0.6ml、10mmol/ml EDTA 1ml溶于5.0ml灭菌双蒸水中。

RB：6mmol/ml异硫氰酸胍35ml。

RC：无水乙醇15ml。

RD：100u/μl DNAse A 20μl溶于10ml DEPC H₂O，

2.RT-LAMP反应试剂

1)PM：取100pmol/μl F3-PA 2.5μl、100pmol/μl B3-PA 2.5μl、100pmol/μl FIP-PA20.0μl，100pmol/μl BIP-PA 20.0μl、100pmol/μl LF-PA 10.0μl、100pmol/μl LB-PA10.0μl，加灭菌去离子水定容至总体系75.0μl。每个反应需取1.5μl PM。

2)RM：取4mmol/μl硫酸镁取50μl、1.6mol/μl甜菜碱50μl、10mmol/μl dNTPs 50μl，溶于475μl PCR级水中定溶至625μl。每个反应需取12.5μl RB。

3)EM：取16U/μl Bst大片段DNA聚合酶24μl，400U/μlAMV反转录酶24μl，1μmol/μlDTT 2μl。每个反应需要取1μl EB。

4)显色剂：取1μlSYBRgreenI(购自Invitrogen公司)溶于49μl PCR级水。每个反应加1μl。

实施例3

SIV RT-LAMP试剂盒的使用

1.使用LBBII-RNA提取样品RNA

取100μl细胞培养物(或拭子、组织研磨样品)，经反复冻融3次后，按如下步骤操作：

2.SIV RT-LAMP反应

①配制RT-LAMP反应液：将RM 12.5μl，EM 1.0μl，PM 1.5μl加到反应管中；

②取5.0μl样品RNA加到①项配制的反应液的管中；

③混和后将反应管置于63℃恒温水浴锅中作用45min。

3结果判定：反应后在SIV RT-LAMP反应产物中加入1μL的显色剂，肉眼观察反应液颜色变化。阴性反应的反应液呈现橘红色，阳性样品的反应液呈绿色。

序列表

<110>中国兽医药品监察所

<120>猪流感病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法

<160>4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>引物F3-PA

<223>人工序列

<400>1

AGGGGTCTAT GGGATTCCTT 20

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>引物B3-PA：

<223>人工序列

<400>2

GAAAGCTTGC CCTCAATG 18

<210>3

<211>42

<212>DNA

<213>引物FIP-PA：

<223>人工序列

<400>3

AWCGCATGGT TCCTGCGATT TCATCGTCAG TCCGAAAGAG GC 42

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>引物BIP-PA

<223>人工序列

<400>4

ARRCTTGCCG ACCAAAGTCT CTCGGTTCGA ATCCATCCAC A 41

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>引物LF-PA：

<223>人工序列

<400>5

AATCTTTCTT CAATTGTGTC 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>引物LB-PA

<223>人工序列

<400>6

CCGAACTTCT CCAGCCTTGA 20

Claims

1.一种检测猪流感病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征包含提取RNA试剂LBB II-RNA；含有序列1、2、3、4、5和6三对引物配制成引物混合液的RT-LAMP反应试剂两个组分。

2.如权利要求1所述的一种检测猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于所述的提取RNA试剂LBB II-RNA含有以下溶液组成：

RA：取1％2-巯基乙醇0.6ml、pH 8.01％Tris-HCL 0.6ml、10mmol/ml EDTA 1ml灭菌双蒸水5.0ml；

RB：6mmol/ml异硫氰酸胍35ml；

RC：无水乙醇15ml；

RD：100u/μl DNAseA 20μl、10ml DEPC H2O。

3.如权利要求1所述的一种检测猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于所述的反应试剂含有引物混合液PM、反应缓冲混合液RM、反应酶混合液EM及显色剂，其中引物混合液所用的引物序列1、2、3、4、5和6及其在混合液中各自的浓度为：

F3-PA：AGGGGTCTATGGGATTCCTT

B3-PA：GAAAGCTTGCCCTCAATG

FIP-PA：WCGCATGGTTCCTGCGATTTCATCGTCAGTCCGAAAGAGGC

BIP-PA：RRCTTGCCGACCAAAGTCTCTCGGTTCGAATCCATCCACA

LF-PA：AATCTTTCTTCAATTGTGTC

LB-PA：CCGAACTTCTCCAGCCTTGA

按总体系75.0μl含：100pmol/μl F3-PA 2.5μl、100pmol/μl B3-PA 2.5μl、100pmol/μlFIP-PA 20.0μl，100pmol/μl BIP-PA 20.0μl、100pmol/μl LF-PA 10.0μl、100pmol/μlLB-PA 10.0μl，灭菌去离子水定容至75.0μl。

4.一种检测猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒的检测方法，其特征是包括以下步骤：

1)提取待测样品中的核酸；

2)配制RT-LAMP反应液：RM 12.5μl，EM 1.0μl，PM 1.5μl；

3)取5.0μl样品RNA加到①项配制的RT-LAMP反应液中；

4)混和后在63℃恒温水浴锅中作用45min；

5)结果判定：反应结束后在SIV RT-LAMP反应产物中加入1μL的显色剂，肉眼观察反应液颜色变化。阴性反应的反应液呈现橘红色，阳性样品的反应液呈绿色。

5.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP试剂盒的检测方法，其特征是用LBB II-RNA提取样品RNA包括以下步骤：

取100μl细胞培养物或鼻腔拭子浸出样品，经反复冻融3次后，样品中加入样品等体积RA，涡旋15s，12000g离心1min，取上清置于新管中；在上清液中加入3倍的RB溶液，涡旋或剧烈震荡90s，静置3min；加入1/3体积的RC溶液，涡旋1min，12000g离心1min，弃去上清液放置5min后样品干燥，再加入11μl RD，溶解沉淀，即为样品RNA。