CN101914621A - 一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法 - Google Patents
一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101914621A CN101914621A CN201010255889XA CN201010255889A CN101914621A CN 101914621 A CN101914621 A CN 101914621A CN 201010255889X A CN201010255889X A CN 201010255889XA CN 201010255889 A CN201010255889 A CN 201010255889A CN 101914621 A CN101914621 A CN 101914621A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- myhc
- adsorption column
- quantitative
- cdna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 title claims abstract description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 title abstract description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 41
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 37
- 238000013461 design Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 39
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 31
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 28
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 18
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 15
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 14
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 12
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 claims description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 9
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 6
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 5
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 5
- 238000010606 normalization Methods 0.000 claims description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 3
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 claims description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 3
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 claims description 3
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 claims description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 3
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 claims description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100503668 Sus scrofa GAPDH gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 abstract description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 102000005604 Myosin Heavy Chains Human genes 0.000 abstract 2
- 108010084498 Myosin Heavy Chains Proteins 0.000 abstract 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 30
- 238000011160 research Methods 0.000 description 12
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102100034404 Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710151542 Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100028960 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 2
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- 108010060054 peroxisome-proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1 Proteins 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101150107475 MEF2C gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明的目的在于提供一种建立在肌球蛋白重链不同亚型基因mRNA表达基础上的比组织化学染色法更为准确、可靠的猪肉肌纤维类型组成的定量分子检测方法。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，其步骤包括引物与探针设计、总RNA提取与质量检测和cDNA第一链的合成，其特征在于：所述引物设计的探针是根据猪MyHC基因不同亚型cDNA上游序列差异合成TaqMan探针。通过上述技术方案，可以通过建立在肌球蛋白重链不同亚型基因mRNA表达基础上的猪肉肌纤维类型组成的定量分子检测方法比组织化学评定更为准确、可靠，本方法采用这种分子定量分型的方法，可以对不同品种猪不同部位肌肉中不同类型肌纤维进行定量测定及分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，具体为一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法。
背景技术
我国的猪种资源丰富，分为地方品种、培育品种及外来品种三大类，不同的猪种之间具有很大的差异。北京黑猪是我国较为成熟的培育品种之一，具有体型较大、生长速度较快等优点，但其与外来品种在肉品质上的差异研究较为稀少。肉品质是一个综合的、相对模糊的复杂概念，因此在不同国家、不同地区都具有不同的评价体系与标准。国内通常选用的评价指标与测量方法对引进猪品种及中国地方猪品种的常规肉品质性状进行了测定，并进行对测定结果进行了比较分析，为研究影响猪肉品质候选基因提供研究基础。
与此同时，越来越多的研究表明，肌纤维作为肌肉基本组成单位，其自身理化性质在很大程度上可能影响肉品质性状。有关肌纤维性质的研究早在上世纪70年代就已经开始，但目前的研究主要集中于肌纤维性质的生物学特点以及简单的肌纤维类型分布状况的探索。传统的研究肌纤维性质的方法主要为免疫组织化学方法，不同的染色方法得到的结论不尽相同无法准确定义肌纤维类型。传统的研究肌纤维性质的方法多为组织化学染色方法，不同染色方法得出的结论不尽相同，无法准确定义肌纤维类型。近年，随着功能基因组学的发展，对肌球蛋白重链研究的逐渐深入，一种更为准确的分子分型方法被引入到肌纤维类型组成的研究中。在哺乳动物的骨骼肌和心肌上总共发现了8种肌球蛋白异构体，分别由不同基因编码。Schiaffino(Schiaffino and Reggiani，1994，Schiaffino and Reggiani，1996)和Weiss(Weiss and Leinwand，1996)等在对啮齿类和人类的研究中，确认了与肌纤维类型相对应的四种肌球蛋白重链亚型。Chang和Femandes等人研究发现在猪的骨骼肌上表达的MyHC有四种类型，I、II a、II b和II x，分别由不同的基因编码，并依据肌纤维特有的MyHC类型将猪的肌纤维分为四种类型，从基因表达水平对猪骨骼肌中各种类型肌纤维的组成情况进行研究，发现四种MyHC亚型表达比例不同的肌肉表现出不同的收缩能力和ATP酶活性(Chang，et al.，2003，Klont，et al.，1998)。因此，根据不同类型骨骼肌纤维肌球蛋白重链基因上游序列差异，设计特异引物，对肌肉组织中不同类型肌球蛋白重链基因mRNA表达量进行测定，进而分析肌肉中不同类型肌纤维的组成比例。这种建立在肌球蛋白重链基因mRNA表达基础上的分子分型比组织化学评定更为准确、可靠。
发明内容
本发明的目的在于提供一种建立在肌球蛋白重链基因mRNA表达基础上的，比组织化学染色法更为准确、可靠的猪肉肌纤维类型组成的定量分子分型方法。
为了达到上述目的，本实用新型采用以下技术方案：
一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，其步骤包括引物与探针设计、总RNA提取与质量检测和cDNA第一链的合成，其特征在于：所述引物与探针是根据猪MyHC基因不同亚型cDNA上游序列差异设计合成的TaqMan探针。
进一步，猪MyHC I基因引物序列(5’-3’)为“GGGAAAATCTGAACAAGCTGATGACTCTATTACCCCTGGAGACTTTGTCT”，其TaqMan探针为“TTGCGCTCCACACATC”，其参考序列GenBank登录号为“U75316”。
进一步，猪MyHC II a基因引物序列(5’-3’)为“CCAAGAAAGGTGGCAAGAAGAAGGGTCATCAGCTTGTTCAGATTCTCT”，其TaqMan探针为“CCGTGTCTGCCCTTTT”，其参考序列GenBank登录号为“AB025260”。
进一步，猪MyHC II b基因引物序列(5’-3’)为“ACTTTGTGCGCTGCATCATCGGACGAGTTCGTGCTCCAT”，其TaqMan探针为“ATGAGACCAAAACTCC”，其参考序列GenBank登录号为“AB025261”。
进一步，猪MyHC II x基因引物序列(5’-3’)为“CTTCACTGCGCAGCAGGGGACGAGTTCGTGCTCCAT”，其TaqMan探针为“ATGAGACCAAAACTCC”，其参考序列GenBank登录号为“AB025262”。
进一步，检测中所用内参基因，猪GAPDH基因，参考序列GenBank登录号为“AF069649.1”。
进一步，所述的总RNA提取与质量检测分为如下步骤：
1)匀浆处理：每10-20mg肌肉组织加300μl裂解液RL，使用前加入β-巯基乙醇，用研磨杵将组织彻底研磨，可用匀浆器；之后想匀浆液中加入590μl RNase-free ddH2O和10μl蛋白酶K，混匀后56℃处理10-20分钟；
2)12,000rpm离心2-5分钟，取上清进行一下操作；
3)缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3，吸附柱放在收集管中，12,000rpm离心30-60秒，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；
4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
5)配制DNase I工作液：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-free离心管中，加入70μl RDD溶液，轻柔混匀；
6)向吸附柱CR3中央加入80μl DNase I 工作液，室温放置15分钟；
7)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
8)想吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，使用前加入乙醇，室温静置2分钟，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
9)重复步骤8；
10)12,000rpm离心2分钟，倒掉废液；将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
11)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-free ddH2O，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，得到RNA溶液；
12)RNA纯度及浓度检测：普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，28S rRNA量为18SrRNA的两倍左右，说明RNA完整性好；Nanodrop2000超微量分光光度计检测OD260、OD280及OD260/OD280比值，判定RNA的浓度与纯度，高质量的RNA OD260/OD280读数在1.8-2.1之间。
进一步，所述的cDNA第一链的合成(RT-PCR)采用High Capacity cDNA RT试剂盒进行cDNA第一链的合成，反应体系及反应程序如下：
10×RT Buffer 2.0μl
25×dNTP Mix(100mM) 0.8μl
10×RT Random Primers 2.0μl
MultiScribeTM Reverse Transcriptase 1.0μl
RNase Inhibitor 1.0μl
Nuclease-free H2O 3.2μl
总RNA 10.0μl
混匀后离心，置于ABI9700型PCR仪上，25℃10分钟，37℃延伸120分钟，85℃5秒钟后取下，保存于-20℃。
进一步，所述猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法还包括定量PCR反应体系和程序和cDNA样品质量和引物扩增效率的检测两步骤。
进一步，所述的定量PCR反应体系和程序如下所示：
所述的定量PCR反应体系采用20μl反应体系，成分如下：
TaqMan Gene Expression Master Mix(2×) 10μl
TayMan探针(20×) 1μl
cDNA样品及DEPC水 9μl
所述的定量PCR反应程序如下表所示：
进一步，所述的cDNA样品质量和引物扩增效率的检测步骤为：
在进行定量PCR试验前，应先进行预试验检测cDNA样品的质量，对cDNA样品使用参基因GAPDH进行rt-PCR试验，根据Ct值，评价cDNA样品质量，Ct＜25的可直接进行后期试验；若Ct≥30说明cDNA样品浓度偏低，需重新进行反转录；若无扩增结果，则cDNA质量存在问题，需重新进行反转录；
将cDNA模板从10倍到105倍梯度稀释，并以此为模板，对每对探针进行荧光定量PCR反应，反映结束后，以内参基因GAPDH的五个梯度反应制作标准曲线，将其他各对引物的曲线斜率和R2与内参基因进行比较，保证扩增效率一致。
进一步，所述猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法还包括荧光定量PCR数据标准化统计分析和各型肌纤维比例的换算两步骤，
进一步，所述的荧光定量PCR数据标准化统计分析为以GAPDH基因为内参基因校正不同样品初始模板量以及反转录效率的差异，每次反应，每个样本的目的基因和内参基因各重复三次，获得平均Ct值，利用美国ABI公司SDS RQManager Version 1.2软件计算样品ΔΔCt值，以2-ΔΔCt法计算得到目的基因的相对表达量RQ。
进一步，所述的各型肌纤维比例的换算为以不同类型MyHC相对表达量占全部MyHC相对表达量比例作为相应类型肌纤维在全部肌纤维中的比例，计算公式如下：
MyHC(i)＝[MyHC(i)/(MyHC I+MyHC II a+MyHC II b+MyHC II x)]×100％。
通过上述技术方案，可以通过建立在肌球蛋白重链基因表达基础上的分子分型的猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法比组织化学评定更为准确、可靠，本方法采用这种分子定量分型的方法，可以对不同品种猪不同部位肌肉中不同类型肌纤维进行定量测定及分析。
附图说明
图1猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法流程图；
图2不同类型MyHC融解曲线图
具体实施方式
1、样品采集
屠宰后迅速采集相关部位肌肉组织样存放于RNAfixer样品保存液中，-20℃冷冻保存备用。
2、药品、试剂和酶：
动物组织总RNA提取试剂盒：天根生化技术(北京)有限公司；
High Capacity cDNA RT Kit：美国Applied Biosystems公司；
TaqMan Gene Expression Master Mix：美国Applied Biosystems公司；
TaqMan探针的合成：美国Applied Biosystems公司；
3、主要仪器和设备：
Eppendorf5417R台式高速冷冻离心机：Eppendorf公司；
ABI9700型热循环仪：Applied Biosystems公司；
ABI7500型试试荧光定量定量PCR系统：Applied Biosystems公司；
Nanodrop2000超微量分光光度计：Thermo Scientific公司；
4、检测方法：
a)引物的设计与合成：
根据猪MyHC基因不同类型cDNA上游序列差异，利用Primer Express 3.0软件(Applied Biosystems)设计并交ABI公司合成TaqMan探针。探针序列如表1所示。
表1不同类型MyHC TaqMan探针引物
b)总RNA提取与质量检测：
采用天根生化技术有限公司生产的动物组织总RNA提取试剂盒提取肌肉组织中的总RNA。具体步骤如下：
1)匀浆处理：每10-20mg肌肉组织加300μl裂解液RL(使用前加入β-巯基乙醇)，用研磨杵将组织彻底研磨(如组织较难彻底研磨，可用匀浆器)；之后想匀浆液中加入590μl RNase-free ddH2O和10μl蛋白酶K，混匀后56℃处理10-20分钟。
2)12,000rpm离心2-5分钟，取上清进行一下操作。
3)缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3(吸附柱放在收集管中)，12,000rpm离心30-60秒，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
5)配制DNase I工作液：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-free离心管中，加入70μl RDD溶液，轻柔混匀。
6)向吸附柱CR3中央加入80μl DNase I工作液，室温放置15分钟。
7)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
8)想吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前加入乙醇)，室温静置2分钟，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
9)重复步骤8。
10)12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-free ddH2O，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，得到RNA溶液。
12)RNA纯度及浓度检测：普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，28S rRNA量约为18SrRNA的两倍，说明RNA完整性好；Nanodrop2000超微量分光光度计检测OD260、OD280及OD260/OD280比值，判定RNA的浓度与纯度，高质量的RNA OD260/OD280读数在1.8-2.1之间。
c)cDNA第一链的合成(RT-PCR)
采用Applied Biosystems公司的High Capacity cDNA RT试剂盒进行cDNA第一链的合成，反应体系及反应程序如下：
10×RT Buffer 2.0μl
25×dNTP Mix(100mM) 0.8μl
10×RT Random Primers 2.0μl
MultiScribeTM Reverse Transcriptase 1.0μl
RNase Inhibitor 1.0μl
Nuclease-free H2O 3.2μl
总RNA 10.0μl
混匀后离心，置于ABI9700型PCR仪上，25℃10分钟，37℃延伸120分钟，85℃5秒钟后取下，保存于-20℃。
d)定量PCR反应体系和程序
采用20μl反应体系，成分如下：
TaqMan Gene Expression Master Mix(2×) 10μl
TayMan探针(20×) 1μl
cDNA样品及DEPC水 9μl
定量PCR反应程序如下表所示：
e)cDNA样品质量和引物扩增效率的检测
在进行定量PCR试验前，应先进行预试验检测cDNA样品的质量。对cDNA样品使用参基因GAPDH进行rt-PCR试验，根据Ct值，评价cDNA样品质量。Ct＜25的可直接进行后期试验；若Ct≥30说明cDNA样品浓度偏低，需重新进行反转录；若无扩增结果，则cDNA质量存在问题，需重新进行反转录。
将cDNA模板从10倍到105倍梯度稀释，并以此为模板，对每对探针进行荧光定量PCR反应。反映结束后，以内参基因GAPDH的五个梯度反应制作标准曲线，将其他各对引物的曲线斜率和R2与内参基因进行比较，保证扩增效率一致。
5、荧光定量PCR数据标准化统计分析
本试验以GAPDH基因为内参基因校正不同样品初始模板量以及反转录效率的差异。每次反应，每个样本的目的基因和内参基因各重复三次，获得平均Ct值，利用美国ABI公司SDS RQ Manager Version 1.2软件计算样品ΔΔCt值，以2-ΔΔCt法计算得到目的基因的相对表达量RQ。
6、各型肌纤维比例的换算
以不同类型MyHC相对表达量占全部MyHC相对表达量比例作为相应类型肌纤维在全部肌纤维中的比例。计算公式如下，
MyHC(i)＝[MyHC(i)/(MyHC I+MyHC II a+MyHC II b+MyHC II x)]×100％。
7、统计分析
用SAS Version 8.02软件的GLM过程对不同品种猪不同类型肌纤维比例进行最小二乘分析，并对不同类型肌纤维比例与猪肉品质及胴体性状关系进行相关性分析，构建如下模型。
Y＝μ+B+e
其中，Y：性状值；
μ：群体均值；
B：品种效应；
e：随机残差。
8、实验结果
对不同类型MyHC基因mRNA相对表达量进行检测，融解曲线见图2。将不同类型肌球蛋白重链表达量换算为肌纤维类型比例，并以不同类型MyHC总表达量作为评价肌纤维数量与密度的指标，对不同类型肌纤维及MyHC表达量在品种及不同肌肉组织中的分布情况进行分析，结果表明不同类型肌纤维及MyHC表达量在品种及肌肉部位间存在差异见表1及图2。
表1不同品种和肌肉部位猪肌纤维类型组成及MyHC表达量差异
注：表中数据表示为：最小二乘均值±标准误。
同一行中数据标有不同上标，ab表示差异显著且水平达到P＜0.05，AB表示差异显著水平达到P＜0.01；＊P＜0.05；＊＊P＜0.01。
背最长肌及股二头肌中I型肌纤维比例在品种间均存在显著差异(P＜0.05)，北京黑猪背最长肌中I型肌纤维比例最高(0.376±0.028)，且与长大二元猪(0.281±0.022)差异极显著(P＜0.01)，而股二头肌中I型肌纤维比例以长白猪(0.575±0.023)为最高，显著高于长大二元猪(0.497±0.023)及大白猪(0.491±0.023)(P＜0.05)。此外，I型肌纤维比例在不同肌肉部位也存在差异。长白猪与长大二元猪股二头肌中I型肌纤维比例高于背最长肌，且达到极显著水平(P＜0.01)。
II a型肌纤维在不同品种猪股二头肌中的比例存在差异(P＜0.05)，长大二元猪最高(0.385±0.026)，与长白猪(0.238±0.026)差异达到极显著水平(P＜0.05)。长白猪背最长肌及股二头肌中II a型肌纤维比例存在显著差异(P＜0.05)。
IIb型肌纤维在不同品种猪背最长肌中比例存在差异(P＜0.05)，长大二元猪与大白猪(0.330±0.027和0.287±0.030)II b型肌纤维比例高于另外两个品种，北京黑猪中II b型肌纤维比例最低(0.197±0.024)。股二头肌II b型肌纤维比例在不同品种中不存在显著差异。长大二元猪背最长肌中IIb型肌纤维比例(0.330±0.027)高于股二头肌(0.118±0.028)，且达到极显著水平(P＜0.01)。
II x型肌纤维在背最长肌或股二头肌均几乎不表达，仅在长白猪背最长肌及股二头肌中存在少量表达，分别为0.102±0.031和0.060±0.033，高于其他品种猪(P＜0.05)，背最长肌中的差异达到极显著水平(P＜0.01)。长大二元猪背最长肌与股二头肌中II x型肌纤维比例存在显著差异(P＜0.01)。II b型肌纤维仅在个别长白猪肌肉组织中有少量表达，因此在之后的研究中不对候选基因多态或表达水平对其的影响以及其与肉品质性状的关系进行研究。
背最长肌及股二头肌MyHC表达量在不同品种的分布中不存在差异。但三个引进品种股二头肌中MyHC表达量均高于背最长肌，其中长大二元猪的差异达到极显著水平(P＜0.01)。
本研究对肌肉组织切片分别进行不同预孵环境下ATP酶活性染色以及NADH酶活性染色。根据ATP酶活性染色时酸性和碱性预孵育环境对肌纤维分型具有一定的对应“镜相”关系，可判断出不同类型肌纤维。在因在酸性及碱性环境中，II b及II x型肌纤维着色深浅程度变化不显著，故而分型效果不如I型及IIa型肌纤维。结合NADH酶活性染色结果，I型肌纤维呈深黑色，II b型肌纤维无色或淡染，II a与II x型肌纤维为中等染色程度，根据同一肌纤维在不同染色环境下着色深浅的变化，可判断出肌纤维类型。
对背最长肌中基因表达量与MyHC表达量及不同类型肌纤维比例进行相关性分析，结果如表2所示。分析结果显示，EPOR、PPARGC1、NFATc1、Mef2c及IGF1-r基因表达量与MyHC表达量均存在不同程度的正相关，而PPARGC1基因表达量与背最长肌中I型及II a型肌纤维比例存在正相关。NFATc1基因表达量与背最长肌中I型肌纤维比例存在正相关，IGF1-r基因表达量与背最长肌中I型肌纤维比例存在正相关，同时与II b型肌纤维比例存在负相关。
表2背最长肌中基因表达量与肌纤维类型组成的相关性
注：表中数据表示为交叉的两性状间相关系数及P值；＊P＜0.05；＊＊P＜0.01。
Claims (10)
1.一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，包括引物与探针设计、总RNA提取与质量检测和cDNA第一链的合成，其特征在于：所述引物和探针是根据猪MyHC I、MyHC II a、MyHC II b和/或MyHC II x基因cDNA上游序列差异设计的，所述探针为TaqMan探针，所述的猪MyHC I基因参考序列GenBank登录号为“U75316”，其基因引物序列为5’-GGGAAAATCTGAACAAGCTGATGACTCTATTACCCCTGGAGACTTTGTCT-3’，其TaqMan探针为5’-TTGCGCTCCACACATC-3’，所述的猪MyHCII a基因参考序列GenBank登录号为“AB025260”，其基因引物序列为5’-CCAAGAAAGGTGGCAAGAAGAAGGGTCATCAGCTTGTTCAGATTCTCT-3’，其TaqMan探针为5’-CCGTGTCTGCCCTTTT-3’，所述的猪MyHC II b基因参考序列GenBank登录号为“AB025261”，其基因引物序列为5’-ACTTTGTGCGCTGCATCATCGGACGAGTTCGTGCTCCAT-3’，其TaqMan探针为5’-ATGAGACCAAAACTCC-3’，所述的猪MyHC II x基因参考序列GenBank登录号为“AB025262”，其基因引物序列为5’-CTTCACTGCGCAGCAGG GGACGAGTTCGTGCTCCAT-3’，其TaqMan探针为5’-ATGAGACCAAAACTCC-3’。
2.根据权利要求1所述的mRNA定量检测方法，进一步地包括了内参基因的使用，所述的内参基因为猪GAPDH基因，其参考序列GenBank登录号为“AF069649.1”。
3.根据权利要求1或2所述的一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，其特征在于：，所述的总RNA提取与质量检测分为如下步骤：
1)匀浆处理：每10-20mg肌肉组织加300μl裂解液RL，使用前加入β-巯基乙醇，用研磨杵将组织彻底研磨，或使用匀浆器将组织匀浆；之后向研磨或匀浆过的组织中加入590μl RNase-free ddH2O和10μl蛋白酶K，混匀后56℃处理10-20分钟；
2)12,000rpm离心2-5分钟，提取上清；
3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3，吸附柱放在收集管中，12,000rpm离心30-60秒，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；
4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
5)配制DNase I工作液：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-free离心管中，加入70μl RDD溶液，轻柔混匀；
6)向吸附柱CR3中央加入80μl DNase I工作液，室温放置15分钟；
7)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
8)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，使用前加入乙醇，室温静置2分钟，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
9)重复步骤8)；
10)12,000rpm离心2分钟，倒掉废液；将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
11)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-free ddH2O，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，得到RNA溶液；
12)RNA纯度及浓度检测：普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，28S rRNA量为18SrRNA的两倍左右，说明RNA完整性好；Nanodrop2000超微量分光光度计检测OD260、OD280及OD260/OD280比值，判定RNA的浓度与纯度，高质量的RNA OD260/OD280读数在1.8-2.1之间。
4.根据权利要求3所述的mRNA定量检测方法，其特征在于：采用High CapacitycDNA RT试剂盒进行cDNA第一链的合成，反应体系及反应程序如下：
10×RT Buffer 2.0μl
25×dNTP Mix(100mM) 0.8μl
10×RT Random Primers 2.0μl
MultiScribeTMReverse Transcriptase 1.0μl
RNase Inhibitor 1.0μl
Nuclease-freeH2O 3.2μl
总RNA 10.0μl
混匀后离心，置于ABI9700型PCR仪上，25℃10分钟，37℃延伸120分钟，85℃5秒钟后取下，保存于-20℃。
5.根据权利要求4所述的mRNA定量检测方法，其特征在于：所述猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法还包括定量PCR反应体系和反应条件设定，以及cDNA样品质量和引物扩增效率的检测。
6.根据权利要求5所述的mRNA定量检测方法，其特征在于：所述的定量PCR反应体系和条件如下所示：
所述的定量PCR反应体系采用20μl反应体系，成分如下：
TaqMan Gene Expression Master Mix(2×) 10μl
TayMan探针(20×) 1μl
cDNA样品及DEPC水 9μl
所述的定量PCR反应条件如下表所示：
7.根据权利要求4或5所述的mRNA定量检测方法，其特征在于：所述的cDNA样品质量和引物扩增效率的检测步骤为：
在进行定量PCR试验前，应先进行预试验检测cDNA样品的质量，对cDNA样品使用参基因GAPDH进行rt-PCR试验，根据Ct值，评价cDNA样品质量，Ct＜25的可直接进行后期试验；若Ct≥30说明cDNA样品浓度偏低，需重新进行反转录；若无扩增结果，则cDNA质量存在问题，需重新进行反转录；
将cDNA模板从10倍到105倍梯度稀释，并以此为模板，对每对探针进行荧光定量PCR反应，反应结束后，以内参基因GAPDH的五个梯度反应制作标准曲线，将其他各对引物的曲线斜率和R2与内参基因进行比较，保证扩增效率一致。
8.根据权利要求7所述的mRNA定量检测方法，其特征在于：所述猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法还包括荧光定量PCR数据标准化统计分析和各型肌纤维比例的换算。
9.根据权利要求8所述的mRNA定量检测方法，其特征在于：所述的荧光定量PCR数据标准化统计分析为以GAPDH基因为内参基因校正不同样品初始模板量以及反转录效率的差异，每次反应，每个样本的目的基因和内参基因各重复三次，获得平均Ct值，利用美国ABI公司SDS RQ Manager Version 1.2软件计算样品ΔΔCt值，以2-ΔΔCt法计算得到目的基因的相对表达量RQ。
10.根据权利要求8或9所述的mRNA定量检测方法，其特征在于：所述的各型肌纤维比例的换算为以不同亚型MyHC相对表达量占全部MyHC相对表达量比例作为相应类型肌纤维在全部肌纤维中的比例，计算公式如下：
MyHC(i)＝[MyHC(i)/(MyHC I+MyHC II a+MyHC II b+MyHC II x)]×100％。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010255889XA CN101914621B (zh) | 2010-08-18 | 2010-08-18 | 一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010255889XA CN101914621B (zh) | 2010-08-18 | 2010-08-18 | 一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101914621A true CN101914621A (zh) | 2010-12-15 |
| CN101914621B CN101914621B (zh) | 2012-08-22 |
Family
ID=43322257
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201010255889XA Expired - Fee Related CN101914621B (zh) | 2010-08-18 | 2010-08-18 | 一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101914621B (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103173558A (zh) * | 2013-03-26 | 2013-06-26 | 四川川娇生态猪业股份有限公司 | 猪肉肉质的鉴定或预测方法 |
| CN103642793A (zh) * | 2013-11-01 | 2014-03-19 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种用于转录组测序的建鲤肌肉rna的提取方法 |
| CN105039515A (zh) * | 2015-06-05 | 2015-11-11 | 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 | 牦牛肌纤维类型组成的荧光定量pcr检测引物及检测方法 |
| CN105985948A (zh) * | 2015-02-28 | 2016-10-05 | 天津市农业质量标准与检测技术研究所 | 一种高效安全提取动物肌肉组织dna的方法 |
| CN106191237A (zh) * | 2016-07-10 | 2016-12-07 | 贵州大学 | 基于实时荧光定量pcr的猪lyrm1基因组织表达谱的建立方法 |
| CN109628562A (zh) * | 2019-01-18 | 2019-04-16 | 内蒙古农业大学 | 一种检测牛肌肉hsl基因表达量的方法 |
| CN111662988A (zh) * | 2020-06-03 | 2020-09-15 | 华南农业大学 | 一种与猪肌纤维类型相关的lncRNA标志物及其应用 |
| CN115152653A (zh) * | 2022-08-22 | 2022-10-11 | 青岛兴牧畜牧科技发展有限公司 | 具备饲料预消化功能的自动饲喂装置及其使用方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101463352A (zh) * | 2009-01-13 | 2009-06-24 | 中国农业大学 | 一种与猪肌内脂肪沉积量相关的dna片段及其应用 |
| CN101503688A (zh) * | 2009-03-18 | 2009-08-12 | 华中农业大学 | 与猪免疫性状相关的cd163基因片段克隆及作为分子标记的应用 |
| CN101629217A (zh) * | 2009-06-30 | 2010-01-20 | 中国兽医药品监察所 | 猪流感病毒rt-lamp检测试剂盒及其检测方法 |
-
2010
- 2010-08-18 CN CN201010255889XA patent/CN101914621B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101463352A (zh) * | 2009-01-13 | 2009-06-24 | 中国农业大学 | 一种与猪肌内脂肪沉积量相关的dna片段及其应用 |
| CN101503688A (zh) * | 2009-03-18 | 2009-08-12 | 华中农业大学 | 与猪免疫性状相关的cd163基因片段克隆及作为分子标记的应用 |
| CN101629217A (zh) * | 2009-06-30 | 2010-01-20 | 中国兽医药品监察所 | 猪流感病毒rt-lamp检测试剂盒及其检测方法 |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103173558A (zh) * | 2013-03-26 | 2013-06-26 | 四川川娇生态猪业股份有限公司 | 猪肉肉质的鉴定或预测方法 |
| CN103642793A (zh) * | 2013-11-01 | 2014-03-19 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种用于转录组测序的建鲤肌肉rna的提取方法 |
| CN105985948A (zh) * | 2015-02-28 | 2016-10-05 | 天津市农业质量标准与检测技术研究所 | 一种高效安全提取动物肌肉组织dna的方法 |
| CN105039515A (zh) * | 2015-06-05 | 2015-11-11 | 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 | 牦牛肌纤维类型组成的荧光定量pcr检测引物及检测方法 |
| CN105039515B (zh) * | 2015-06-05 | 2018-04-20 | 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 | 牦牛肌纤维类型组成的荧光定量pcr检测引物及检测方法 |
| CN106191237A (zh) * | 2016-07-10 | 2016-12-07 | 贵州大学 | 基于实时荧光定量pcr的猪lyrm1基因组织表达谱的建立方法 |
| CN109628562A (zh) * | 2019-01-18 | 2019-04-16 | 内蒙古农业大学 | 一种检测牛肌肉hsl基因表达量的方法 |
| CN111662988A (zh) * | 2020-06-03 | 2020-09-15 | 华南农业大学 | 一种与猪肌纤维类型相关的lncRNA标志物及其应用 |
| CN115152653A (zh) * | 2022-08-22 | 2022-10-11 | 青岛兴牧畜牧科技发展有限公司 | 具备饲料预消化功能的自动饲喂装置及其使用方法 |
| CN115152653B (zh) * | 2022-08-22 | 2023-06-23 | 青岛兴牧畜牧科技发展有限公司 | 具备饲料预消化功能的自动饲喂装置及其使用方法 |
| CN116439149A (zh) * | 2022-08-22 | 2023-07-18 | 青岛兴牧畜牧科技发展有限公司 | 具备饲料预消化功能的自动饲喂装置 |
| CN116439149B (zh) * | 2022-08-22 | 2024-06-07 | 青岛兴牧畜牧科技发展有限公司 | 具备饲料预消化功能的自动饲喂装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101914621B (zh) | 2012-08-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101914621B (zh) | 一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法 | |
| Hanson et al. | Identification of forensically relevant body fluids using a panel of differentially expressed microRNAs | |
| CN103003442A (zh) | 一种通过微小rna表达水平评估人同种异体移植物状况的方法 | |
| CN105112522A (zh) | Her2基因扩增的检测引物组及试剂盒 | |
| CN106987626A (zh) | 用于快速检测多种真菌并鉴定菌种的引物和探针及其应用 | |
| CN102206702A (zh) | miR-122作为肝脏疾病血清标志物 | |
| CN107267604A (zh) | 一种基于短链核酸探针和双链特异性核酸内切酶的高特异性microRNA荧光检测方法 | |
| CN108342464A (zh) | 一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒及其检测方法 | |
| CN101871004A (zh) | 成熟miRNA定量检测方法及试剂盒 | |
| CN108411007A (zh) | Snp标记及其应用 | |
| CN109321569B (zh) | 一种引物探针组合物及其应用 | |
| CN101988062A (zh) | 宫颈癌检测标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片 | |
| CN104073560B (zh) | 一种杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法 | |
| CN102027128A (zh) | 作为癌症标志物的结肠癌相关的转录物1(ccat-1) | |
| CN109652529A (zh) | 骨质疏松特异性miRNA、组合物及其诊疗用途 | |
| CN105648051A (zh) | 定量细胞端粒酶活性的方法 | |
| CN110396542A (zh) | 一种LncRNA标记物及其在糖尿病中的应用 | |
| CN108660193A (zh) | 人类lmna-ntrk1基因融合突变检测引物、探针及检测试剂盒 | |
| CN102094069A (zh) | 吉鲡鱼遗传特性甑别方法及其应用 | |
| CN102899390A (zh) | 小细胞肺癌标志物及其检测 | |
| CN103923981B (zh) | Hla-b*27等位基因检测方法及其试剂盒 | |
| CN104673927A (zh) | 绿脓杆菌pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| CN103436632A (zh) | 一种利用单核苷酸多态性检测鸡嫩度性状的方法及引物 | |
| CN109355370A (zh) | 一种circRNA标记物及其应用 | |
| CN107868818A (zh) | 用于酪氨酸激酶抑制剂相关基因igf1r表达水平检测的引物组、试剂盒及方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: HEBEI WUSHI RUNKANG ECOLOGICAL ANIMAL HUSBANDRY CO Free format text: FORMER OWNER: CHINA AGRICULTURAL UNIVERSITY Effective date: 20130419 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 100913 HAIDIAN, BEIJING TO: 056002 HANDAN, HEBEI PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20130419 Address after: 056002 Hebei Province, Handan city Congtai District People's road races 11 storey building room 1107 Patentee after: Hebei Wushi Runkang Animal Husbandry Co., Ltd. Address before: 100913 No. 2 Old Summer Palace West Road, Beijing, Haidian District Patentee before: China Agricultural University |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Method for mRNA quantitative detection of composition of porcine meat muscle fiber types Effective date of registration: 20171130 Granted publication date: 20120822 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd Handan branch Pledgor: Hebei Wushi Runkang Animal Husbandry Co., Ltd. Registration number: 2017990001105 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120822 Termination date: 20200818 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |