CN101871004A - 成熟miRNA定量检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物标本中成熟miRNA的定量检测方法及试剂盒。其主要步骤为：提取总RNA(含miRNA)，以发卡结构式引物在逆转录酶的催化下合成cDNA，以miRNA特异性正向引物及通用反向引物进行实时荧光PCR定量检测成标本中成熟miRNA的含量。本发明具有适用范围广、高特异性、高灵敏度及超宽的线性检测范围等优点。该方法简便快速，可广泛用于成熟miRNA的表达量分析及临床检验。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域中一种标本中成熟miRNA的定量检测方法及试剂盒，可用于标本中成熟miRNA的表达量分析及临床检测。
背景技术
miRNA(microRNA)是一类非编码、内源性的小RNA，长约21～25核苷酸(nucleotides，nt)。目前已经被发现并被miRBase数据库收录的人类miRNA有695种，绝大多数miRNA可以通过与靶基因的3-UTR区互补结合，抑制靶基因翻译成蛋白质，进而在细胞及组织水平影响生物体的发育，并参与多种疾病的发生发展过程。一系列的研究表明miRNA在细胞成长、细胞分化及凋亡、同源异性盒基因调节、神经元极性、胰岛素分泌、胚胎发育中的大脑形成及心脏发生、代谢等过程中都发挥着重要作用。成熟miRNA作为体液中客观存在的标志物，其表达量的检测也将有很重要的临床意义。
自1993年首次发现miRNA以来，检测其表达水平的技术方法也发展了许多种，目前已有的检测方法主要有：(1)Northern杂交法：从1993年始，Northern杂交法就被应用于miRNA表达谱研究，也是首个用于半定量检测miRNA的实验技术，通过将已知浓度梯度的寡核苷酸参照物与待测样品进行平行杂交，实现对miRNA的半定量检测。而后，Northern杂交法成为检测细胞中miRNA表达的常规研究方法之一。但Northern杂交法最大的缺点是对样品的需求量较高，需要微克级样品才能避免假阴性，有时样品量需要达到40μg才会出现明显杂交信号；(2)原位杂交法：原位杂交分为细胞和组织内原位杂交，该技术检测miRNA表达，可更直观的展示出miRNA的时空表达模式。该技术可以检测同一细胞系中单个细胞中的miRNA表达，也可在不经分类和分离的情况下，比较不同细胞系中miRNA的表达水平，是分析miRNA表达的组织和时序特异性的有力工具。但其同样存在跟Northern杂交的缺点，那就是对样品的需求量高，很难在一般的检测实验中推广；(3)基因芯片：最初的miRNA基因芯片，是将反义DNA探针点在尼龙膜上，然后以5′端放射性标记的miRNA样品杂交，再经放射自显影获得信号。经过发展，基因芯片技术敏感度有了很大提高，且可用于多个miRNA同时检测，但仍有很多不足之处：基因芯片的制作和检测需要昂贵的仪器设备、结果是半定量的、重复性较差、不能同时优化所有待测miRNA的杂交环境、不能区分高度类似的miRNA等；(4)半定量RT-PCR：RT-PCR作为半定量检测miRNA表达的常用实验方法，在研究miRNA表达的过程中不断得到改进。半定量RT-PCR是常用的一种简洁、快速、特异的相对定量的RNA检测技术，有研究用该技术成功对比了待测和对照样本之间特异miRNA的表达差异，但只能测定miRNA的相对含量。该技术有以下优点：可在较短时间内获得结果；高通量，可同时检测多种miRNA的表达；与Northern杂交相比，仅需少量RNA，且不用放射性同位素标记；操作过程简单。但该技术检测miRNA表达时也有以下缺点：有的miRNA和其他miRNA具有同源区域，它们的引物序列就是miRNA基因序列5′端的一部分，检测的特异性不容易控制，不能很好的区分标本中的成熟miRNA和前体miRNA。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种可以特异性定量检测标本中成熟miRNA的简便、实用的方法及成套的试剂盒，可用于多种类型标本中成熟miRNA的表达量分析及临床检测。
本发明所涉及的miRNA检测方法，其特征在于：提取总RNA(含miRNA)，以发卡结构引物在逆转录酶的催化下合成cDNA，以miRNA特异性正向引物及通用反向引物进行实时荧光PCR定量检测成标本中成熟miRNA的含量。该检测方法通过以下技术方案实现：(1)总RNA提取：A、样品处理；B、RNA分离；C、RNA沉淀；D、RNA洗涤；E、RNA溶解；F、RNA浓度测定；G、RNA电泳检测。(2)RNA的逆转录：以一个包含20-230nt长度的发卡序列和6-30nt特异性序列的引物进行逆转录反应，扩增相应的成熟miRNA的第一链cDNA。(3)荧光定量PCR检测：以miRNA特异性正向引物及通用反向引物进行实时荧光PCR定量检测标本中成熟miRNA的含量。检测的基本原理示意图见附图1，下面将通过一个具体实施方式详细描述该技术方案。
该技术有以下优点：高度特异性，特异的发卡反转录引物确保反应不受其前体及基因组DNA污染等因素的干扰，对序列高度同源的miRNA也可精确区分；超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度，从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围跨越7个数量级；样品消耗少，仅需1～10ng的总RNA；适用范围广，总RNA、细胞裂解物以及纯化的RNA都可作为标本用于miRNA的定量检测，也可用于其他小分子RNA的检测，如siRNA。
附图说明
图1是检测的基本原理示意图；
图2是RNA的电泳结果图。
具体实施方式
实施例一
人血液中hsa-miR-29a miRNA的定量检测
1、总RNA提取
(1)样品处理：取100μL～500μL血液标本，加imL TRIzol试剂，反复混匀；
(2)RNA分离：室温放置上述样品液10分钟，加入氯仿200μL，剧烈振荡约1分钟，室温静置5分钟，4℃12000g离心15分钟，小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA组份；
(3)RNA沉淀：小心吸取上清液约450μL至含有600μL冰冷异丙醇的新离心管中，混匀，4℃12000g离心10分钟；
(4)RNA洗涤：去上清，加入500μL冷冻的75％乙醇，弹起沉淀，4℃12000g离心5分钟，去上清，4℃12000g再离心5分钟，吸去上清液；
(5)RNA溶解：风干约5～10分钟，加入DEPC处理水约30μL，溶解RNA；
(6)RNA浓度测定：吸取1μL RNA用DEPC水稀释10倍后，在微量分光光度计上测定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其OD260/OD280，按照公式计算RNA浓度，RNA浓度＝40ng/μL×OD260×稀释倍数；
(7)RNA电泳检测：A、变性胶制备：取1.2g琼脂糖加75mL去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10mL 10×Mops和15mL甲醛及适量溴化乙锭，倒胶至插有梳子的胶板上；B、电泳缓冲液配制(1×Mops)：取50mL 10×Mops，用去离子水稀释至500mL，倒入电泳槽中；C、RNA样品处理：取RNA样品约9μL，65℃变性10min后立即冷却，加入1μL10×RNA上样缓冲液；D、RNA电泳：把RNA胶放入电泳槽中，100V作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的RNA样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处，取胶观察或拍照；
(8)RNA抽提结果：RNA电泳图见附图2；
(9)所得总RNA可立即使用或放-80℃保存；
2、检测用相关引物设计
根据hsa-miR-29a的序列ACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAG设计实验所需的引物如下：
(1)发卡结构逆转录引物为：
5’GACCGACATCACGTACACTCCGAGGTACTTACGTGATGTC GGTCCTGAAC 3’，前面55nt的序列是发卡结构区，后面6nt的序列是针对miRNAhsa-miR-29am的特异性序列；
(2)正向引物为：5’ACTGATTTCTTTTGGTGTTCAG 3’；
(3)反向引物为：5’GACCGACATCACGTACACTCC 3’；
3、RNA的逆转录
(1)在冰上按如下比例配制RNA及引物混合液：上述所得总RNA2μL，10μM逆转录引物1μL，去RNA酶超纯水7μL，总体积为10μL；
(2)混匀上述RNA及引物混合液，短暂离心，放65℃变性10分钟，置冰上2分钟；
(3)按如下比例配制反转录反应液：RNA及引物混合液10μL，5×逆转录反应缓冲液5μL，10mM dNTPs 4μL，25U/μL RNA酶抑制剂1μL，200U/μL M-MLV逆转录酶1μL，去RNA酶超纯水4μL，总体积为25μL；
(4)混匀上述反应混合物，短暂离心，置42℃反应60分钟，95℃5分钟灭活处理；
(5)所得产物是单链cDNA，可立即使用或放置于-20℃保存。
4、荧光定量PCR检测反应
(1)在冰上按如下比例配制荧光定量PCR的反应液：10×荧光定量PCR缓冲液2μL，5U/μL DNA聚合酶0.5μL，40×荧光定量染料0.5μL，10mM dNTPs 2μL，2μM正向引物2μL，2μM反向引物2μL，单链cDNA 2μL，去RNA酶超纯水9μL，总体积为20μL；
(2)混匀上述荧光定量PCR的反应液，移至PCR反应管，短暂离心使所有试剂到反应管底部；
(3)荧光定量PCR反应：使用标准的三步法进行检测，反应循环设定如下：95℃预变性10分钟；95℃变性10秒钟，57℃退火20秒钟，72℃延伸10秒钟；40个循环；
(4)扩增分析：按照所用仪器的软件分析扩增曲线及溶解曲线，确定标本中的has-miR-29a的量。
Claims (8)
1.一种生物标本中成熟miRNA的定量检测方法，其特征在于：提取总RNA(含miRNA)，以发卡结构引物在逆转录酶的催化下合成cDNA，以miRNA特异性正向引物及通用反向引物进行实时荧光PCR定量检测标本中成熟miRNA的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，所采用的检测标本包含提纯的总RNA、提纯的小RNA及未纯化的全血、血清、血浆、唾液、尿液、组织液原液。
3.根据权利要求1所述的方法，反转录引物采用的是发卡式结构设计，包含发卡互补区、发卡环状区和特异性序列区。发卡序列的总长度为20-230nt，其中发卡互补区序列长度为10-100nt，发卡环状区序列长度为10-100nt，成熟miRNA特异性序列区的序列长度为6-30nt。
4.一种生物标本中成熟miRNA的定量检测试剂盒，其特征是包含以下组份：(1)发卡结构逆转录引物；(2)逆转录反应混合物；(3)荧光定量PCR反应混合物；(4)无RNA酶超纯水。
5.如权利要求4所述的逆转录反应混合物，其特征在于含有以下任何一种或多种组份的组合：(1)逆转录反应缓冲液，(2)dNTPs，(3)RNA酶抑制剂，(4)逆转录酶，(5)超纯水。
6.如权利要求4所述的荧光定量PCR反应混合物，其特征在于含有以下任何一种或多种组份的组合：(1)荧光定量PCR缓冲液，(2)DNA聚合酶，(3)荧光染料，(4)dNTPs，(5)正向引物，(6)反向引物，(7)超纯水。
7.上述任一项权利要求所述的内容，用于任一种成熟miRNA的检测试剂盒。
8.上述任一项权利要求所述的内容，用于任一种成熟miRNA表达水平的分析及临床检测。
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