CN101392295A - 直接的mRNA富集定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种生物工程技术领域的直接的mRNA富集定量方法，不需要进行RNA抽提，在待检测的菌体或组织破碎后，利用特异性的核酸探针液相杂交保护特异性的mRNA部分片段后，用S1和RNAse酶切除去单链DNA，未保护的RNA，过量的探针和错配的杂交体，完全配对的mRNA片段经生物素－链亲和素交互作用被磁珠富集后，用双链结合染料直接线性放大定量。本发明不需要进行RNA抽提，快速简便，易于自动化，特异性强，在常规的实验条件下即可完成对RNA的定量检测。

Description

直接的mRNA富集定量方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的方法，具体是一种直接的mRNA富集定量方法。

背景技术

RNA在生物遗传信息的传递上起着重要作用。目前，有许多基于首先进行RNA抽提，然后间接进行mRNA定量方法，例如：northern印迹、实时定量RT-PCR检测和DNA芯片等。在现有常规方案中，虽然northern印迹分析可用于量化多目标基因，但是其灵敏度较低，杂交需要大量的总RNA且检测周期长。

经对现有技术的文献检索发现，经典的mRNA定量法是实时定量RT-PCR(Bustin等：Quantitative real-time RT-PCR--a perspective，Journal ofMolecular Endocrinology(分子内分泌学杂志)2005年34卷597-601页)。该法的特征在于：先提取RNA，然后将mRNA反转录成cDNA，再PCR扩增定量。需要至少1个小时的反转录及两个小时PCR扩增，总检测时间太长；存在反转录酶非线性转录，Taq酶非线性放大的倾向，RNA模板易降解，很难自动化等难题。微阵列芯片技术，可同时进行数以千计的基因表达水平的分析，但是由于杂交条件非特异而灵敏度相对较低。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种直接的mRNA富集定量方法，不需要进行RNA抽提，快速简便，易于自动化，特异性强，在常规的实验条件下即可完成对RNA的定量检测，可以迅速直接地监测的mRNA水平的变化。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明不需要进行RNA抽提，在待检测的菌体或组织破碎后，利用特异性的核酸探针液相杂交保护特异性的mRNA部分片段后，用S1和RNAse酶切除去单链DNA，未保护的RNA，过量的探针和错配的杂交体，完全配对的mRNA片段经生物素-链亲和素交互作用被磁珠富集后，用双链结合染料直接线性放大定量。

本发明包括如下步骤：

第一步，探针设计：利用待检测的mRNA序列设计和合成互补的DNA或RNA探针，5’端或3’端用生物素标记；

所指的待检测的mRNA包括各种生物体基因经转录产生的核酸产物，包括tRNA，microRNA或sRNA等。

第二步，保护杂交：待检测的菌体或组织样品在缓冲液中经破碎后，用设计的探针进行杂交，同时保护待检测的mRNA部分片段。

所述的待检测的菌体或组织样品包括细菌、真菌、植物组织、动物组织等。

所述的缓冲液包括各种杂交缓冲液。

第三步，用S1和RNAse酶切除去单链DNA、未保护的RNA、过量的探针、错配的杂交体，留下完全配对的，带生物素标记的探针和mRNA杂交体。

第四步，用链亲和素包被的磁珠富集带生物素标记的探针和mRNA杂交体，同时去除各种细胞碎片、蛋白等杂质。

所述的链亲和素包被的磁珠是指用链亲和素经物化处理包被的磁性材料，包括纳米磁性材料。

第五步，用双链结合染料直接定量mRNA。

所述的双链结合染料包括各种能与RNA/RNA，DNA/RNA杂交体结合或附着的染料。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：1)可以迅速直接地监测的mRNA水平的变化，不需要进行RNA抽提；2)结果稳定，可重复性好。避免了RNA降解，非线性反转录，非线性PCR扩增带来的偏差。3)方法简单，易于自动化。

本发明实施例所使用的荧光假单胞菌M18，已在中国专利局指定的保藏单位：北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCCNO.0462，保藏时间：2000.6.27。

附图说明

图1为本发明方法的流程图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

如以下实施例按照如图1所示的流程进行实施。

实施例1 定量phzC基因的mRNA水平

第一步，根据GenBank中phzC基因序列(EF491207)，用Oligo 6.0设计特异性DNA探针。探针序列为：5’-biotin-GACAGCTCGTAGTCGAGCAGCAGCATCTCGTGGCTGGTCCAGACCGGCGAGGCATTCGC。5’端用生物素标记。利用Pseudomonas aeruginosa PA01(AE004091)的基因组序列进行BLAST分析其特异性。

第二步，1mL King’s B培养基液体培养的荧光假单胞菌M18发酵液经8，000rpm离心收集菌体。用液氮冻存于-70℃冰箱。为了避免RNA降解，冻存菌体需尽快使用。2mL杂交缓冲液(1×SSC：4.385g/LNaCl，2.205g/Ltrisodium citrate dehydrate，pH7.2)和20μL 2μM的设计探针同时添加到冻存的菌体(探针需在菌体化冻之前加入以保护检测mRNA不被RNAse降解)。在冰浴中用超声细胞破碎机进行菌体细胞破碎。94℃变性10min后，32℃温育2小时。

第三步，加入1000U S1酶(Promega，USA)，10μg RNase酶(上海生工)和1mL S1酶缓冲液。42℃温育4小时。酶和酶缓冲液加入量可调整，酶加入量多，酶解时间可缩短，酶加入量少，酶解时间需延长。

第四步，所有溶液转入装有链亲和素包被的磁珠(Promega，USA)(使用前用1mL 1×SSC清洗三次)的离心管中。若溶液体积大于离心管体积，可分次加入。轻轻混匀10分钟后，利用磁铁，用1×SSC清洗磁珠三次。

第五步，最后用94μL 1X SSC重悬磁珠，加入6μL SYBR Green I(捷瑞生物工程(上海)有限公司)，用荧光测定仪(Fluoroskan Ascent FL，ThermoFisher Scientific Inc.USA)，在485nm和527nm波长下进行荧光强度定量。测定结果为1.115。因为一个链亲和素分子可高度亲和结合4个生物素分子，若需提高测定值，可增加检测样品量，不过酶解时间需延长。

实施例2 定量gacA基因的mRNA水平

第一步，根据GenBank中gacA基因序列(NC_002516)，用Oligo 6.0设计特异性DNA探针。探针序列为：5’-biotin-AGTTCCAGCACCATCAGTGGCAGACGCTTCTCCTAGGCAAGGGGTGGGCGGAGTACGTC。5’端用生物素标记。利用Pseudomonasaeruginosa PA01(AE004091)的基因组序列进行BLAST分析其特异性。

第二步，1mL King’s B培养基液体培养的荧光假单胞菌M18发酵液经8，000rpm离心收集菌体。用液氮冻存于-70℃冰箱。为了避免RNA降解，冻存菌体需尽快使用。2mL杂交缓冲液(1×SSC：4.385g/L NaCl，2.205g/Ltrisodium citrate dehydrate，pH7.2)和20μL 2μM的设计探针同时添加到冻存的菌体(探针需在菌体化冻之前加入以保护检测mRNA不被RNAse降解)。在冰浴中用超声细胞破碎机进行菌体细胞破碎。94℃变性10min后，32℃温育2小时。

第三步，加入1000U S1酶(Promega，USA)，10μg RNase酶(上海生工)和1mL S1酶缓冲液。42℃温育4小时。酶和酶缓冲液加入量可调整，酶加入量多，酶解时间可缩短，酶加入量少，酶解时间需延长。

第四步，所有溶液转入装有链亲和素包被的磁珠(Promega，USA)(使用前用1mL 1×SSC清洗三次)的离心管中。若溶液体积大于离心管体积，可分次加入。轻轻混匀10分钟后，利用磁铁，用1×SSC清洗磁珠三次。

第五步，最后用94μL 1X SSC重悬磁珠，加入6μL SYBR Green I(捷瑞生物工程(上海)有限公司)，用荧光测定仪(Fluoroskan Ascent FL，ThermoFisher Scientific Inc.USA)，在485nm和527nm波长下进行荧光强度定量。测定结果为0.823。因为一个链亲和素分子可高度亲和结合4个生物素分子，若需提高测定值，可增加检测样品量，不过酶解时间需延长。

实施例3 定量rsmX基因的mRNA水平

第一步，根据GenBank中rsmX基因序列(DQ137846)，用Oligo 6.0设计特异性DNA探针。探针序列为：5’-biotin-GATCAGGGAAGGTCGACCATTAGCACGGATGCTGCAGACAGGAAGTCATGATGGTCTTG。5’端用生物素标记。利用Pseudomonas aeruginosa PA01(AE004091)的基因组序列进行BLAST分析其特异性。

第二步，1mL King’s B培养基液体培养的荧光假单胞菌M18发酵液经8，000rpm离心收集菌体。用液氮冻存于-70℃冰箱。为了避免RNA降解，冻存菌体需尽快使用。2mL杂交缓冲液(1×SSC：4.385g/L NaCl，2.205g/Ltrisodium citrate dehydrate，pH 7.2)和20μL 2μM的设计探针同时添加到冻存的菌体(探针需在菌体化冻之前加入以保护检测mRNA不被RNAse降解)。在冰浴中用超声细胞破碎机进行菌体细胞破碎。94℃变性10min后，32℃温育2小时。

第三步，加入1000U S1酶(Promega，USA)，10μg RNase酶(上海生工)和1mL S1酶缓冲液。42℃温育4小时。酶和酶缓冲液加入量可调整，酶加入量多，酶解时间可缩短，酶加入量少，酶解时间需延长。

第四步，所有溶液转入装有链亲和素包被的磁珠(Promega，USA)(使用前用1mL1×SSC清洗三次)的离心管中。若溶液体积大于离心管体积，可分次加入。轻轻混匀10分钟后，利用磁铁，用1×SSC清洗磁珠三次。

第五步，最后用94μL 1X SSC重悬磁珠，加入6μL SYBR Green I(捷瑞生物工程(上海)有限公司)，用荧光测定仪(Fluoroskan Ascent FL，ThermoFisher Scientific Inc.USA)，在485nm和527nm波长下进行荧光强度定量。测定结果为1.079。因为一个链亲和素分子可高度亲和结合4个生物素分子，若需提高测定值，可增加检测样品量，不过酶解时间需延长。

实施例4 定量qscR基因的mRNA水平

第一步，根据GenBank中qscR基因序列(AF516903)，用Oligo 6.0设计特异性DNA探针。探针序列为：5’-biotin-AATGGCGAAGACTTCCAGGAGAACCGTTTCTTCTGGGAGGAAGCGCTGCATCACGGCAT。5’端用生物素标记。利用Pseudomonas aeruginosa PA01(AE004091)的基因组序列进行BLAST分析其特异性。

第二步，1mL King’s B培养基液体培养的荧光假单胞菌M18发酵液经8，000rpm离心收集菌体。用液氮冻存于-70℃冰箱。为了避免RNA降解，冻存菌体需尽快使用。2mL杂交缓冲液(1×SSC：4.385g/L NaCl，2.205g/Ltrisodium citrate dehydrate，pH7.2)和20μL 2μM的设计探针同时添加到冻存的菌体(探针需在菌体化冻之前加入以保护检测mRNA不被RNAse降解)。在冰浴中用超声细胞破碎机进行菌体细胞破碎。94℃变性10min后，32℃温育2小时。

第三步，加入1000U S1酶(Promega，USA)，10μg RNase酶(上海生工)和1mL S1酶缓冲液。42℃温育4小时。酶和酶缓冲液加入量可调整，酶加入量多，酶解时间可缩短，酶加入量少，酶解时间需延长。

第四步，所有溶液转入装有链亲和素包被的磁珠(Promega，USA)(使用前用1mL 1×SSC清洗三次)的离心管中。若溶液体积大于离心管体积，可分次加入。轻轻混匀10分钟后，利用磁铁，用1×SSC清洗磁珠三次。

第五步，最后用94μL 1X SSC重悬磁珠，加入6μL SYBR Green I(捷瑞生物工程(上海)有限公司)，用荧光测定仪(Fluoroskan Ascent FL，ThermoFisher Scientific Inc.USA)，在485nm和527nm波长下进行荧光强度定量。测定结果为0.952。因为一个链亲和素分子可高度亲和结合4个生物素分子，若需提高测定值，可增加检测样品量，不过酶解时间需延长。

实施例5 定量rsmA基因的mRNA水平

第一步，根据GenBank中rsmA基因序列(AY730556)，用Oligo 6.0设计特异性DNA探针。探针序列为：5’-biotin-AGACCCTGATGGTAGGTGACGACGTCACCGTGACGGTACTGGGTGTCAAAGGGAACCAG。5’端用生物素标记。利用Pseudomonas aeruginosa PA01(AE004091)的基因组序列进行BLAST分析其特异性。

第二步，1mL King’s B培养基液体培养的荧光假单胞菌M18发酵液经8，000rpm离心收集菌体。用液氮冻存于-70℃冰箱。为了避免RNA降解，冻存菌体需尽快使用。2mL杂交缓冲液(1×SSC：4.385g/L NaCl，2.205g/Ltrisodium citrate dehydrate，pH 7.2)和20μL 2μM的设计探针同时添加到冻存的菌体(探针需在菌体化冻之前加入以保护检测mRNA不被RNAse降解)。在冰浴中用超声细胞破碎机进行菌体细胞破碎。94℃变性10min后，32℃温育2小时。

第三步，加入1000U S1酶(Promega，USA)，10μg RNase酶(上海生工)和1mL S1酶缓冲液。42℃温育4小时。酶和酶缓冲液加入量可调整，酶加入量多，酶解时间可缩短，酶加入量少，酶解时间需延长。

第四步，所有溶液转入装有链亲和素包被的磁珠(Promega，USA)(使用前用1mL 1×SSC清洗三次)的离心管中。若溶液体积大于离心管体积，可分次加入。轻轻混匀10分钟后，利用磁铁，用1×SSC清洗磁珠三次。

第五步，最后用94μL 1X SSC重悬磁珠，加入6μL SYBR Green I(捷瑞生物工程(上海)有限公司)，用荧光测定仪(Fluoroskan Ascent FL，ThermoFisher Scientific Inc.USA)，在485nm和527nm波长下进行荧光强度定量。测定结果为2.385。

由上述实施例可以看出，本发明的实施不需要进行RNA抽提，快速简便，易于自动化，特异性强，在常规的实验条件下即可完成对RNA的定量检测，而且避免了RNA降解，非线性反转录，非线性PCR扩增带来的偏差。

Claims (6)

1.一种直接的mRNA富集定量方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，探针设计：利用待检测的mRNA序列设计和合成互补的DNA或RNA探针，5’端或3’端用生物素标记；

第二步，保护杂交：待检测的菌体或组织样品在缓冲液中经破碎后，用设计的探针进行杂交，同时保护待检测的mRNA部分片段；

第三步，用S1和RNAse酶切除去单链DNA、未保护的RNA、过量的探针、错配的杂交体，留下完全配对的，带生物素标记的探针和mRNA杂交体；

第四步，用链亲和素包被的磁珠富集带生物素标记的探针和mRNA杂交体，同时去除各种细胞碎片、蛋白杂质；

第五步，用双链结合染料直接定量mRNA。

2.根据权利要求1所述的直接的mRNA富集定量方法，其特征是，所述的待检测的mRNA包括各种生物体基因经转录产生的核酸产物。

3.根据权利要求1所述的直接的mRNA富集定量方法，其特征是，所述的待检测的菌体或组织样品包括细菌、真菌、植物组织、动物组织。

4.根据权利要求1所述的直接的mRNA富集定量方法，其特征是，所述的缓冲液包括各种杂交缓冲液。

5.根据权利要求1所述的直接的mRNA富集定量方法，其特征是，所述的链亲和素包被的磁珠是指用链亲和素经物化处理包被的磁性材料，包括纳米磁性材料。

6.根据权利要求1所述的直接的mRNA富集定量方法，其特征是，所述的双链结合染料包括各种能与RNA/RNA，DNA/RNA杂交体结合或附着的染料。

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