CN116162731B - 基于锁式探针的落叶松枯梢病菌滚环扩增引物组及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于锁式探针的落叶松枯梢病菌滚环扩增引物组及应用，本发明基于落叶松枯梢病菌的ITS片段序列差异，利用锁式探针能与模板DNA互补结合的特点，在落叶松枯梢病菌的特异性片段上设计出了用于检测落叶松枯梢病的特异性锁式探针，经过环化连接、外切酶消化未环化线性探针、再用扩增引物进行超分支滚环扩增，最后通过电泳验证实现落叶松枯梢病菌的检测。本发明可从真菌菌丝体中快速、准确地检测出落叶松枯梢病菌，缩短了传统落叶松枯梢病原真菌的检测时间，提高了检疫效率，同时具有特异性强、灵敏度高、操作简单、结果可靠等特点。因此，对于落叶松枯梢病的早期快速检疫及病害防控等具有重要意义。

Description

基于锁式探针的落叶松枯梢病菌滚环扩增引物组及应用

技术领域

本发明属于分子诊断领域，涉及植物真菌病害检测领域，特别涉及基于锁式探针的落叶松枯梢病菌滚环扩增引物组及应用。

背景技术

落叶松枯梢病是发生在落叶松上的一种严重病害，对落叶松人工林造成极大威胁，已被列为进境植物检疫对象和林业检疫性有害生物名单，属于2022年12月六部委联合发布的《重点管理外来入侵物种名录》中仅有的两种真菌性植物病害之一。林木染病后造成新梢枯死，严重者树冠秃顶，甚至死亡，给林业生产及生态环境建设造成了巨大损失。

落叶松染病后经历较长的潜伏期后才表现感病症状，当显病植株出现后，林间流行的菌量较大，很多枝梢已经被侵染处于潜伏期状态，且后续防治的效果也很不理想，难以彻底根治。同时，病菌可以通过带菌的无症状苗木进行远距离的传播。因此，对于带菌苗木以及林间染病未显症的病株进行早期快速鉴定显得尤为重要。^[1]目前国内针对该病害的检疫主要根据LY/T 2215-2013《落叶松枯梢病检疫技术规程》进行，其检验鉴定方法主要有直接检验法、保湿培养法及分离培养法。这些鉴定方法均是建立在具有典型症状的基础上，且需要组织分离培养病原菌，在一定程度上受人为因素和环境条件的干扰，且耗时长，已经难以对疑似带病落叶松开展早期快速的检测。

目前，我国对于落叶松枯梢病菌的检测仅依据落叶松枝梢栖真菌ITS序列设计引物，利用此引物对落叶松的枯枝和其它9种不同的枝栖真菌进行了分离，并初步建立了基本的PCR扩增方法，为落叶松枯梢病的快速诊断提供了实验依据，但这种引物容易形成发卡结构，设计难度大，且PCR检测易出现假阳性的结果，灵敏度不高，尚不能用于生产实践中。同时，由于样品预处理时间较长，试验时间较长，检测效率较低，而且测试地点仅限于有条件的实验室，难以适应对疑似病枝快速检测，也难以满足口岸重点植物检疫目标的监测和检测技术，必须达到准确、快速、简便的目的。

分子检测技术因其快速简便的优点，已被广泛用于植物病原菌的快速检测，并取得了很好的效果。而锁式探针及其滚环扩增法(rolling circle Amplification,简称RCA)是达到上述目标的方法之一。锁式探针独特的设计不仅具备PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)的高特异性、高灵敏度的优点，还能实现多靶标的平行检测，已越来越多的用于分子生物学基础理论研究和核酸实际检测。滚环扩增技术是借鉴自然界中环状病原生物体DNA分子滚环式的复制方式建立的核酸扩增技术，可在室温下进行，使用两个引物就可实现指数扩增。基于锁式探针(padlock probe)的超分支滚环扩增(hyper-branched rolling circle amplification，HR-CA)是一种恒温核酸扩增检测法。该方法的原理是，设计特异性的锁式探针与一对通用引物，锁式探针的两端与目标DNA通过互补连接成环，通用引物识别环状锁式探针，实现对锁式探针的超分支滚环扩增，从而达到信号放大的目的，具有快速、灵敏、特异、操作简单的特点。该技术依赖于探针，只有在两端的捕捉序列与目标DNA完全互补配对的前提下才能成环，因此检测特异性强，已成功应用于医学、食品、农业等领域。HRCA由于是恒温扩增，不需要昂贵的仪器，恒温水浴锅便可进行恒温扩增，并和纸基传感器技术相结合，可以直接读取结果。上述HRCA方法在落叶松真菌病害的诊断方面尚属于空白。

发明内容

针对背景技术中的技术问题，本发明的目的在于提供了基于锁式探针的落叶松枯梢病菌滚环扩增检测引物组及应用，解决了现有技术中落叶松真菌病检测所需周期长、特异性不高、灵敏度低等缺陷。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种基于锁式探针的落叶松枯梢病菌滚环扩增引物组，包括：锁式探针Padlock-NLPLP、滚环扩增第一引物PadN以及滚环扩增第二引物PadL，其中，

所述锁式探针Padlock-NLPLP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述滚环扩增第一引物PadN的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述滚环扩增第二引物PadL的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二方面提供了利用上述基于锁式探针的落叶松枯梢病菌滚环扩增引物组进行的落叶松枯梢病菌滚环扩增检测方法，包括以下步骤：

S1、从待检样品中提取真菌DNA，作为模板DNA；

S2、将步骤S1提取的真菌DNA与锁式探针Padlock-NLPLP采用热循环连接法进行连接环化反应；

S3、向步骤S2所得反应产物中加入预混液进行外切酶消化反应；

S4、以步骤S3所得外切酶消化反应产物作为模板，利用滚环扩增第一引物PadN以及滚环扩增第二引物PadL进行HRCA扩增反应；

S5、将所得HRCA扩增产物进行电泳验证，若电泳出现阶梯型条带，则说明待检的菌株为落叶松枯梢病菌，反之则不是落叶松枯梢病菌。

优选地，步骤S2中，所述连接环化反应体系为10μL，组成为：DNA模板2-5μL，40U/μLTaq DNA lipase buffer 1-2μL，40U/μL Taq DNA lipase 0.1-0.2μL，5pmol/L锁式探针Padlock-NLPLP 0.2-0.5μL，DNA模板1-2μL，Sterilized ddH₂O补足至10μL。

所述采用热循环连接法连接环化反应程序：94℃、4min；94℃、30s；65℃、5min，15个循环；95℃、15min、灭活Taq DNA连接酶。

优选地，步骤S3中，所述预混液为10μL，组成为：10×核酸外切酶Ⅰ缓冲液1-2μL；5U/μL的核酸外切酶Ⅰ2-3μL；Sterilized ddH₂O补足至10μL。

优选地，所述外切酶消化反应程序为：37℃、水浴2.5h；80℃、水浴20min。

优选地，步骤S4中，所述HRCA扩增反应体系为25μL，组成为：10×Bst DNA聚合酶缓冲液2-4μL、8U/μL的Bst DNA聚合酶0.5-1μL、10μmol/L的PadN 1-2μL、10μmol/L的PadL 1-2μL、10mmol/L的dNTPs 0.5-1μL、连接环化消化后产物4μL、Sterilized ddH₂O补足至25μL。

优选地，所述HRCA扩增反应程序为：61.5℃、1.5h；

优选地，步骤S4中，所述将所得HRCA扩增产物进行电泳验证，具体步骤为：取7μLHRCA扩增产物于2.0％的琼脂糖凝胶上电泳，染色，紫外凝胶成像系统照相分析，若电泳出现阶梯型条带，则说明待检菌株为落叶松枯梢病菌，反之则不是落叶松枯梢病菌。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

本发明基于落叶松枯梢病菌的ITS片段序列差异，利用锁式探针能与模板DNA互补结合的特点，在落叶松枯梢病菌的特异性片段上设计出了用于检测落叶松枯梢病的特异性锁式探针，经过环化连接、外切酶消化未环化线性探针、再用扩增引物进行超分支滚环扩增，最后通过电泳验证实现落叶松枯梢病菌的检测。本发明可从真菌菌丝体中快速、准确地检测出落叶松枯梢病菌，缩短了传统落叶松枯梢病原真菌的检测时间，提高了检疫效率，同时具有特异性强、灵敏度高(高达100fg/μL)、操作简单、结果可靠等特点。因此对于落叶松枯梢病的早期快速检疫及病害防控等具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为锁式探针的构成结构图；

图2为落叶松枯梢病滚环扩增锁式探针特异性的结果图；

图中，泳道M表示100bp DNA Marker；1表示落叶松枯梢病菌[Neofusicoccumlaricinum]；2表示Epicoccum属真菌；3表示Diaporthe属真菌；4表示Alternaria属真菌；5表示Didymella属真菌；6表示Pestalotiopsis属真菌；7表示无菌水对照；

图3为落叶松枯梢病滚环扩增灵敏度实验图；

图中，泳道M表示100bp DNA Marker，1-6表示落叶松枯梢病菌的DNA浓度依次为10ng/μl、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL；7表示无菌水对照；

图4为落叶松枯梢病滚环扩增锁式探针适用性的结果图；

图中，泳道M表示100bp DNA Marker，1表示NL7菌株；2表示NL8菌株；3表示NL9菌株；4表示NL10菌株；5表示NL11菌株；6表示NL12菌株；7表示无菌水对照。

具体实施方式

以下描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定系统结构、技术之类的具体细节，以便透彻理解本发明实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本发明。

实施例1

1、实验材料和方法

1.1实验材料及试剂

落叶松枯梢病菌[Neofusicoccum laricinum]、Taq DNA ligase、ExonucleaseⅠ、Bst DNA polymerase、dNTPs、Sterilized ddH₂O均购自New England Biolabs(NEB)公司。100bp DNA ladder购自Promega。

1.2实验方法

1.2.1设计锁式探针及引物：

本实施例中锁式探针依据落叶松枯梢病菌ITS的特异性片段而设计，通过Blast和Mega等软件与其近似种进行比对，得到一段与其近似种碱基差异较大的一段序列，以此作为锁式探针的特异性检测臂(T1、T2)，再根据锁式探针的设计原则，采用软件Oligo和premier5设计锁式探针，设计的锁式探针两端检测臂T1、T2和特异性片段碱基序列互补(见表1，锁式探针中的大写字母序列)，锁式探针中间的一段连接区域采用小鼠基因xist(NCBIReference Sequence；NR001463.3)一段序列作为连接序列和通用引物扩增的结合序列(见表1，锁式探针中的大写字母序列)，使用Mfold(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/)预测设计好的锁式探针的二级结构，确保二级结构能值最小，防止发夹结构的产生，同时对锁式探针5’端进行磷酸化修饰；然后将所设计的锁式探针序列和一对通用扩增引物P1和P2在NCBI数据库进行同源性比对，筛选出特异性强的锁式探针和性能稳定易于扩增的扩增引物。参见图1，本实施例设计的锁式探针为一条长约100-120bp个碱基长度的DNA单链，主要由五个部分构成：5‘端特异性检测臂T1、通用扩增引物区域P1、P2、特异性用于杂交的Zipcode区域、3’端特异性检测臂T2。针对落叶松枯梢病菌ITS的特异性区域，本发明设计了一条针对该病原的锁式探针Padlock-NLPLP及滚环扩增第一引物PadN和滚环扩增第二引物PadL。

表1.锁式探针和滚环扩增引物对信息

1.2.2DNA提取

根据基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作。

1.2.3连接环化反应

采用热循环连接法将锁式探针Padlock-NLPLP分别与落叶松枯梢病菌以及其他对照菌株的DNA模板进行连接环化反应，连接环化反应体系为10μL，组成为：DNA模板2-5μL，40U/μL Taq DNA lipase buffer 1-2μL，40U/μL Taq DNA lipase 0.1-0.2μL，5pmol/L锁式探针0.2-0.5μL，DNA模板1-2μL，Sterilized ddH₂O补足至10μL，采用热循环连接法环化连接的条件设置：94℃、4min；94℃、30s；65℃、5min、15个循环；95℃、15min、灭活Taq DNA连接酶。反应结束后，立即将PCR反应管置于冰浴5min后于-20℃冰箱保存备用。

1.2.4外切酶消化处理

由于连接反应体系中还有许多双链和单链DNA，会在扩增的过程中产生背景信号，可能导致假阳性的结果。本实施例采用核酸外切酶Ⅰ对产物进行消化处理，去除未环化的线性锁式探针和DNA模板。具体步骤为：向冰浴后的PCR反应管中加入10μL的酶切混合液，于37℃条件下反应2.5h，彻底消化未环化的线性锁式探针，再于80℃反应20min，灭活剩余的核酸外切酶Ⅰ；其中，酶切预混液为10μL，组成为：10×核酸外切酶Ⅰ缓冲液1-2μL；5U/μL的核酸外切酶Ⅰ2-3μL；Sterilized ddH₂O补足至10μL。

1.2.5HRCA扩增反应

以外切酶消化处理后的产物作为模板，利用滚环扩增第一引物PadN和滚环扩增第二引物PadL进行HRCA扩增反应，HRCA扩增反应体系为25μL，组成为：10×Bst DNA聚合酶缓冲液2-4μL、8U/μL的Bst DNA聚合酶0.5-1μL、10μmol/L的PadN 1-2μL、10μmol/L的PadL 1-2μL、10mmol/L的dNTPs 0.5-1μL、外切酶消化产物4μL、Sterilized ddH₂O补足至25μL。于61.5℃恒温条件下扩增反应1.5h。

1.2.6扩增产物凝胶电泳

取7μL HRCA扩增产物于2％(质量分数)的琼脂糖凝胶上电泳进行验证，染色，紫外凝胶成像系统照相分析判定。

2、特异性试验

取落叶松枯梢病菌培养物，提取其DNA，其余供试菌株活化并提取基因组DNA，以落叶松枯梢病病原菌[Neofusicoccum laricinum]作为标准菌株，以及落叶松枝干表面附生的其他真菌(Epicoccum、Diaporthe、Alternaria、Didymella、Pestalotiopsis)作为参照菌株，SterilizedddH₂O作为空白对照，分别取2μL按照上述1.2.3-1.2.6的步骤进行连接环化、外切酶消化、HRCA扩增并结合凝胶琼脂电泳分析，测试并比较超分支滚环扩增的特异性。HRCA特异性检测结果见图2。

由图2结果显示，在供试的6种真菌中，只有落叶松枯梢病菌被特异性可以检测出，琼脂凝胶电泳呈现明显的阶梯状条带，结果呈阳性；而其余5种对照菌株均不能检出，即落叶松上分布的常见真菌未出现典型的阶梯型条带，均呈阴性反应。这表明，HRCA检测体系可以特异性地检测出落叶松枯梢病菌，特异性良好，适用于落叶松枯梢病菌的检测。

3、灵敏度试验

选取落叶松枯梢病菌的DNA纯化，采用超纯水按十倍梯度稀释，依次为10ng/μl，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，将不同稀释度的菌液各提取2μL作为模板，进行HRCA扩增检测和常规PCR检测，以确定HRCA扩增检测的灵敏度。灵敏度实验结果见图3。

由图3结果可得，针对落叶松枯梢病菌的DNA，HRCA检测的最低检测浓度为100fg/μL，在该浓度时可以检测得到条带可见，而常规的PCR检测在此浓度时未检测到条带出现，与常规PCR检测的灵敏度相比，HRCA检测的灵敏度更高。

4、适用性试验

对来自不同地区的落叶松枯梢病菌及本研究中心保存的落叶松枯梢病菌样品共6个菌株的DNA样本进行检测，提取菌株DNA作为模板，取2μL进行HRCA检测，实验结果见图4。

由图4结果可得，本发明建立的针对落叶松枯梢病菌的检测方法对来源不同的落叶松枯梢病原菌株均具有较好的检测适用性。

本发明基于锁式探针的检测原理，具体为：锁式探针中，特异性检测臂T1、T2通过碱基互补对DNA序列进行识别，当T1、T2区域与目标DNA完全匹配时，在连接酶作用下将锁式探针连接成环形，未被连接的线性锁式探针会被外切酶消化降解，然后通过滚环扩增引物对已环化连接的锁式探针进行扩增，设计得到了一条针对落叶松枯梢病菌ITS的锁式探针及滚环扩增引物对，并基于此建立了落叶松枯梢病菌滚环扩增检测方法，相较于传统PCR方法，该方法不仅节省了时间成本，简化了操作，同时还表现出良好的敏感性和特异性，最低检测浓度为100fg/μL。

本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所做出的种种变换，均落在本明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于锁式探针的落叶松枯梢病菌滚环扩增引物组，其特征在于，由锁式探针Padlock-NLPLP、滚环扩增第一引物PadN、以及滚环扩增第二引物PadL组成，其中，

所述锁式探针Padlock-NLPLP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述滚环扩增第一引物PadN的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述滚环扩增第二引物PadL的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

2.一种利用权利要求1所述的滚环扩增引物组进行的落叶松枯梢病菌滚环扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、从待检样品中提取真菌DNA，作为模板DNA；

S2、将步骤S1提取的真菌DNA与锁式探针Padlock-NLPLP采用热循环连接法进行连接环化反应；

S3、向步骤S2所得反应产物中加入预混液进行外切酶消化反应；

S4、以步骤S3所得外切酶消化反应产物作为模板，利用滚环扩增第一引物PadN、以及滚环扩增第二引物PadL进行HRCA扩增反应；

S5、将所得HRCA扩增产物进行电泳验证，若电泳出现阶梯型条带，则说明待检的菌株为落叶松枯梢病菌，反之则不是落叶松枯梢病菌。

3.根据权利要求2所述的落叶松枯梢病菌滚环扩增检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述连接环化反应体系为10μL，组成为：DNA模板2-5μL，40U/μL Taq DNA lipase buffer1-2 μL，40U/μL Taq DNA lipase 0.1-0.2 μL，5pmol/L 锁式探针0.2-0.5μL，DNA模板1-2μL，Sterilized ddH₂O补足至10 μL；

所述采用热循环连接法连接环化反应程序为：94℃、4min；94℃、30s；65℃、5 min，15个循环；95℃、15min、灭活Taq DNA连接酶。

4.根据权利要求2所述的落叶松枯梢病菌滚环扩增检测方法，其特征在于，步骤S3中，所述预混液为10μL，组成为：10×核酸外切酶Ⅰ缓冲液1-2µL；5U/µL的核酸外切酶Ⅰ2-3 µL；Sterilized ddH₂O补足至10 µL。

5.根据权利要求2所述的落叶松枯梢病菌滚环扩增检测方法，其特征在于，所述外切酶消化反应程序为：37℃、水浴2.5h；80℃、水浴20min。

6.根据权利要求2所述的落叶松枯梢病菌滚环扩增检测方法，其特征在于，步骤S4中，所述HRCA扩增反应体系为25μL，组成为：10×Bst DNA聚合酶缓冲液2-4µL、8U/µL的Bst DNA聚合酶0.5-1µL、10µmol/L的PadN 1-2 µL、10µmol/L的PadL 1-2 µL、10mmol/L的dNTPs0.5-1 µL、连接环化消化后产物4 µL、Sterilized ddH₂O补足至25µL；

所述HRCA扩增反应程序为：61.5℃、1.5h。

7.根据权利要求2所述的落叶松枯梢病菌滚环扩增检测方法，其特征在于，步骤S4中，所述将所得HRCA扩增产物进行电泳验证，具体步骤为：取7µL HRCA扩增产物于2.0%的琼脂糖凝胶上电泳，染色，紫外凝胶成像系统照相分析，若电泳出现阶梯型条带，则说明待检菌株为落叶松枯梢病菌，反之则不是落叶松枯梢病菌。

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