CN105349541A - 用于检测唐菖蒲伯克霍尔德菌的实时荧光pcr引物和探针 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测唐菖蒲伯克霍尔德菌的荧光PCR扩增引物和探针，包括上游引物、下游引物及荧光探针。本发明适用于快速检测食品或者植物中的唐菖蒲伯克霍尔德菌，可广泛应用于农业生产及食品中的疫情监控及进出口贸易中该病原菌的监测及检测，操作极为简便，所需样品量小、要求较低。该引物和探针也可以试剂盒的形式和其他试剂一起提供，用于核酸扩增反应。

Description

用于检测唐菖蒲伯克霍尔德菌的实时荧光PCR引物和探针

技术领域：

本发明涉及一种利用核酸扩增技术进行唐菖蒲伯克霍尔德菌快速检测的方法，具体是一种唐菖蒲伯克霍尔德菌的实时荧光PCR检测用的引物和探针序列。

背景技术：

唐菖蒲伯克霍尔徳氏菌（ Burkholderiagladioli ）为植物致病菌、人的条件致病菌（可导致人产生肺炎症状），也是食品中关键中毒、致病菌。印尼的椰毒发酵食物，中国东北等地的酵米面，养殖的鲜银耳因污染此菌导致食物中毒，已引广泛重视。其所引起的食物中毒致死率极高，在我国东北和西南的发酵米面食物中毒事件中，死亡率达到40%以上。唐菖蒲伯克霍尔德菌首先于1921年作为一种能够侵染唐菖蒲和其他花类植物的植物病原细菌而被提及。该种病菌可能导致囊纤维化和免疫力低下的部分病人发生肺炎症状。但最近，Khan和他的同事们报道由唐菖蒲伯克霍尔德菌引起的脓血症和菌血症。然而，感染通常发生于肺移植时，期间通过胸腔侵染。还有一些报道相继描述了唐菖蒲伯克霍尔德菌肺炎和严重的脓毒症。唐菖蒲伯克霍尔德菌最早的名称是Pseudomonasgladioli，Severini在1913年首次描述了这种病原菌。后来P.gladioli与其他6个同属于假单胞菌属rRNAGroup11的菌种一起被划分到了一个新属伯克霍尔德菌属(Burkholderia)，从而被命名为Burkholderiagladioli。目前，唐菖蒲伯克霍尔德菌共包括4个致病型，分别是B．gladiolipv．gladioli、B．gladiolipv．alliicola、B．gladiolipv．agaricicola和B．gladiolipv．cocovenerans。当前，基于DNA的病原细菌检测方法中，实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，得到研究者的普遍认可，成为检测的重要工具。这对于加强环境中的的监控，提高检测效率和确证的准确度，对有效控制唐菖蒲伯克霍尔德菌的传播,在现阶段具有重要的实际意义。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是针对唐菖蒲伯克霍尔德菌ITS基因序列，设计一组特异性引物和探针，进而建立一种快速检测唐菖蒲伯克霍尔德菌DNA的方法，以克服现有的检测方法在某些食品和植物检测中的局限性，为唐菖蒲伯克霍尔德菌检测提供有效工具，从而确保食品和植物安全性，保护消费者利益。

本发明的主要原理为：针对保守序列设计一组引物和探针。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94-95℃一定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman探针与模板特异性结合。探针的5端标记有报告荧光集团，3端有淬灭荧光集团。当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告集团远离淬灭集团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。

本发明涉及的唐菖蒲伯克霍尔德菌实时荧光PCR检测用的引物和探针，其序列如下：

(1)上游引物：5′-GTCTTGATAAGGCGGGGGTC-3′；

(2)下游引物：5′-GCTTGACCCGAACGTTTGTC-3′；

(3)TaqMan探针：5′-TTGCAAGCAGGGGGTCGTCG-3′，其5′端标记FAM报告荧光集团，3′端标记TAMRA淬灭荧光集团；

在应用中，上游引物、下游引物、TaqMan探针的体积比为：1∶1∶1；

本发明还提供一种唐菖蒲伯克霍尔德菌的检测试剂盒，包括如下试剂：

(1)2×PCRMasterMix

包括0.05u/μLTaqDNA聚合酶，反应缓冲液，4mmol/L氯化镁，0.4mmol/LdNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)；

其中反应缓冲液含有20mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾和2％曲拉通X-100；

(2)上游引物：10μmol/L，序列为：5′-GTCTTGATAAGGCGGGGGTC-3′；

(3)下游引物：10μmol/L，序列为：5′-GCTTGACCCGAACGTTTGTC-3′；

(4)Taqman探针：10μmol/L，序列为：5′-TTGCAAGCAGGGGGTCGTCG-3′，其5′端标记FAM报告荧光集团，3′端标记TAMRA淬灭荧光集团。

本发明还提供一种使用上述引物和探针检测细菌的方法，依次包括下列步骤(1)-(3)：

(1)待检菌株DNA的提取

DNA提取可采用普通裂解抽提法或使用DNA提取试剂盒。

(2)唐菖蒲伯克霍尔德菌的实时荧光PCR扩增

A.在反应管中加入2×PCRMasterMix12.5μL，上游引物和下游引物各0.5-1μL，Taqman探针0.5-1μL，100ng/μL待测样品的DNA1-2μL，补充双蒸水至25μL，混匀；

B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

94-95℃5min，1个循环，预变性；

94-95℃10-20sec；60℃20-40sec，45个循环，PCR扩增。

扩增时，应设立三个对照：阳性对照(取唐菖蒲伯克霍尔德菌提取的基因组DNA)、阴性对照(非唐菖蒲伯克霍尔德菌基因组DNA)、空白对照(不含DNA模板，可以水代替)。

(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。

如待测样品出现扩增曲线，且Ct值小于或等于41，阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立(即阳性样品出现典型阳性扩增曲线，阴性样品和空白对照无扩增)，则可判定该样品检出唐菖蒲伯克霍尔德菌。

如待测样品未出现扩增曲线，无Ct值，阴性对照、阳性对照和空白对照都成立，则可判定该样品未检出唐菖蒲伯克霍尔德菌。

如待测样品Ct值在41-45之间，应重作实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于45，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该样品检出唐菖蒲伯克霍尔德菌；再次扩增后的结果为无扩增曲线无Ct值，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该样品未检出唐菖蒲伯克霍尔德菌。

ITS基因是细菌体内重要遗传信息载体，位于细菌基因组16SrRNA和23SrRNA之间，具有进化速度快、种属特异性等特点。ITSDNA基因序列目前已被广泛用于菌种鉴定。本发明根据唐菖蒲伯克霍尔德菌ITS基因序列，使用Biodet软件和PrimerExpress3.0软件进行了序列分析和引物、探针设计。该基因序列通过对Genebank登录的伯克霍尔德菌属其他细菌种类核酸序列的比对获得，并对设计出的引物和探针进行了在线Blast比对查询，可保证唐菖蒲伯克霍尔德菌的检出。本发明采用实时荧光PCR技术，该技术特异性强、灵敏度高、操作简便，特别适用于一些成分复杂的食品与植物源性产品中唐菖蒲伯克霍尔德菌的检测。

本发明根据唐菖蒲伯克霍尔德菌的ITS序列高度保守区的设计了两个特异性引物及荧光探针，该保守基因序列为具有唐菖蒲伯克霍尔德菌的不同致病变种所共有，以保证从种的水平上检测不同来源的唐菖蒲伯克霍尔德菌的可靠性。本发明适用于对唐菖蒲伯克霍尔德菌进行快速检测确证，可广泛应用于生产和环境中的病害监控、进出口贸易中该病菌的确证。

与现有普通PCR技术相比，本发明的有益效果包括：

第一，精确度高。该发明酶循环反应的循环数少，不需高温变性步骤，相对于RT-PCR错配率较低，更适于检测和定量特异DNA。

第二，灵敏度高。该发明比起PCR技术，能用较少的循环便扩增出大量的目的基因，保证了检测的高敏感性。

第三，生物安全性高。荧光PCR扩增检测一体化，无需后续电泳检测，在减少了检测时间的同时，降低了对环境与人体的污染机率，具有更高地生物安全性。

附图说明：

图1为本发明对病株样品中实时荧光PCR扩增图谱：其中1：唐菖蒲伯克霍尔德菌感病材料；2：健康玉米材料及水对照。

图2为本发明特异性结果图：其中1：唐菖蒲伯克霍尔德菌；2：非唐菖蒲伯克霍尔德菌菌株。非唐菖蒲伯克霍尔德菌菌株包括：香石竹细菌性萎蔫病菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、新洋葱伯克霍尔德氏菌、稳定伯克霍尔德氏菌、根瘤伯克霍尔德氏菌、热带伯克霍尔德氏菌、乌拉姆伯克霍尔德氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌。

图3为本发明敏感性结果图：其中以1ng/μLDNA模板溶液按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、、10^-6做梯度稀释，唐菖蒲伯克霍尔德菌DNA。1.100pg/μL模板液；2.10pg/μL模板液；3.1pg/μL模板液；4.100fg/μL模板液；5.10fg/μL模板液；6.1fg/μL模板液。

具体实施方式：

为了更充分地解释本发明的实施方法，提供了用于检测唐菖蒲伯克霍尔德菌引物及探针的实施实例。这些实施实例仅仅是解释，而不是限制本发明的范围。其中dNTP、PCR扩增试剂、DNAmarker及等均购于北京天根公司。下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

按下列配方制作唐菖蒲伯克霍尔德菌的实时荧光PCR检测试剂盒，其中的试剂包括如下：

(1)2×PCRMasterMix

包括0.05u/μLTaqDNA聚合酶，反应缓冲液，4mmol/L氯化镁，0.4mmol/LdNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)；

其中反应缓冲液含有20mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾和2％曲拉通X-100；

(2)上游引物：10μmol/L，序列为：5′-GTCTTGATAAGGCGGGGGTC-3′；

(3)下游引物：10μmol/L，序列为：5′-GCTTGACCCGAACGTTTGTC-3′；

(4)Taqman探针：10μmol/L，序列为：5′-TTGCAAGCAGGGGGTCGTCG-3′，其5′端标记FAM报告荧光集团，3′端标记TAMRA淬灭荧光集团。

按照以下程序进行检测：

(1)待测菌株DNA的提取

DNA提取可采用普通裂解抽提法或使用DNA提取试剂盒。-20℃保存备用。

(2)待测菌株DNA的实时荧光PCR扩增

A.在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2×PCRMasterMix12.5μL，上游引物和下游引物各0.5μL，Taqman探针0.5μL，100ng/μL待测样品的DNA1μL，补充双蒸水至25μL，混匀；

B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

95℃2min，1个循环，预变性；

95℃15sec；60℃40sec，45个循环，PCR扩增。

(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。

样品出现阳性扩增曲线，Ct值15.8，阴性对照(健康玉米材料DNA)和空白对照(水)无扩增，阳性对照唐菖蒲伯克霍尔德菌产生典型阳性扩增曲线，见图1，据此可判定该菌株为唐菖蒲伯克霍尔德菌。

实施例2特异性实验

按下列配方制作唐菖蒲伯克霍尔德菌的实时荧光PCR检测试剂盒，其中的试剂包括如下：

(1)2×PCRMasterMix

包括0.05u/μLTaqDNA聚合酶Polymerase，反应缓冲液，4mmol/L氯化镁，0.4mmol/LdNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)；

其中反应缓冲液含有20mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾和2％曲拉通X-100；

(2)上游引物：10μmol/L，序列为：5′-GTCTTGATAAGGCGGGGGTC-3′；

(3)下游引物：10μmol/L，序列为：5′-GCTTGACCCGAACGTTTGTC-3′；

(4)Taqman探针：10μmol/L，序列为：5′-TTGCAAGCAGGGGGTCGTCG-3′，其5′端标记FAM报告荧光集团，3′端标记TAMRA淬灭荧光集团。

按照以下程序进行检测：

(1)待测菌株DNA的提取

DNA提取可采用普通裂解抽提法或使用DNA提取试剂盒。-20℃保存备用。

(2)待测菌株DNA的实时荧光PCR扩增：

A.在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2×PCRMasterMix12.5μL，上游引物和下游引物各0.5μL，Taqman探针0.5μL，100ng/μL待测样品的DNA1μL，补充双蒸水至25μL，混匀；

B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

95℃2min，1个循环，预变性；

95℃15sec；60℃40sec，45个循环，PCR扩增。

(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。

样品未出现阳性扩增曲线，10种非唐菖蒲伯克霍尔德菌菌株和空白对照(水)无扩增，阳性对照(唐菖蒲伯克霍尔德菌)产生典型阳性扩增曲线，见图2，据此可判定该样品未检出唐菖蒲伯克霍尔德菌。

实施例3敏感性实验

1、用DEPC水将唐菖蒲伯克霍尔德菌DNA模板液向下做10倍梯度稀释，依次为1×10⁰、1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6ng/μL，各取1μL为模板分别进行实时荧光PCR扩增反应。

2、按下列配方制作唐菖蒲伯克霍尔德菌的实时荧光PCR检测试剂盒，其中的试剂包括如下：

(1)2×PCRMasterMix

包括0.05u/μLTaqDNA聚合酶Polymerase，反应缓冲液，4mmol/L氯化镁，0.4mmol/LdNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)；

其中反应缓冲液含有20mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾和2％曲拉通X-100；

(2)上游引物：10μmol/L，序列为：5′-GTCTTGATAAGGCGGGGGTC-3′；

(3)下游引物：10μmol/L，序列为：5′-GCTTGACCCGAACGTTTGTC-3′；

(4)Taqman探针：10μmol/L，序列为：5′-TTGCAAGCAGGGGGTCGTCG-3′，其5′端标记FAM报告荧光集团，3′端标记TAMRA淬灭荧光集团。

3、按照以下程序进行检测：

(1)待测菌株DNA的提取

DNA提取可采用普通裂解抽提法或使用DNA提取试剂盒。-20℃保存备用。

(2)待测菌株DNA的实时荧光PCR扩增：

A.在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2×PCRMasterMix12.5μL，上游引物和下游引物各0.5μL，Taqman探针0.5μL，待测样品的DNA1μL，补充双蒸水至25μL，混匀；

B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

95℃2min，1个循环，预变性；

95℃15sec；60℃40sec，45个循环，PCR扩增。

(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。

实时荧光PCR扩增结果显示，空白对照(水)无扩增，使用实时荧光PCR方法能够在唐菖蒲伯克霍尔德菌DNA模板为100fg/μL模板液时，检测得到典型阳性扩增曲线（见图3）。

实施例4实际样品检测及对比实验

将从国外进口的兰花、皮毛样品及玉米分离得到的菌株，分别采用实时荧光PCR、普通PCR进行检测，比较两种方法的效果，以进一步评估实时荧光PCR方法的可靠性。

1、实际样品实时荧光PCR检测

将从国外进口的兰花、皮毛样品及玉米分离得到的菌株，各取1μL为模板分别进行实时荧光PCR扩增反应。

2、按下列配方制作唐菖蒲伯克霍尔德菌的实时荧光PCR检测试剂盒，其中的试剂包括如下：

(1)2×PCRMasterMix

包括0.05u/μLTaqDNA聚合酶Polymerase，反应缓冲液，4mmol/L氯化镁，0.4mmol/LdNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)；

其中反应缓冲液含有20mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾和2％曲拉通X-100；

(2)上游引物：10μmol/L，序列为：5′-GTCTTGATAAGGCGGGGGTC-3′；

(3)下游引物：10μmol/L，序列为：5′-GCTTGACCCGAACGTTTGTC-3′；

(4)Taqman探针：10μmol/L，序列为：5′-TTGCAAGCAGGGGGTCGTCG-3′，其5′端标记FAM报告荧光集团，3′端标记TAMRA淬灭荧光集团。

3、按照以下程序进行检测：

A.在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2×PCRMasterMix12.5μL，上游引物和下游引物各0.5μL，Taqman探针0.5μL，100ng/μL待测样品的DNA1μL，补充双蒸水至25μL，混匀；

B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

95℃2min，1个循环，预变性；

95℃15sec；60℃40sec，45个循环，PCR扩增。

C.应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。

实时荧光PCR扩增结果显示，空白对照(水)无扩增，使用实时荧光PCR方法能够在3份样品中得到典型阳性扩增曲线。

2、PCR扩增

1）方法：普通RT-PCR反应条件为50℃反转录30min；94℃预变性2min;94℃30s，53℃30s，72℃30s，循环反应35次；65℃延伸10min。

2）琼脂糖凝胶电泳结果：在8份样品中，3份为阳性，其余为5份。

结论：利用上述实时荧光PCR和普通PCR方法同时检测实际样品，两种方法的符合率100%。

目前，唐菖蒲伯克霍尔德菌是我国较为普遍、危害较为严重的植物病害，引起的洋葱、兰花病害往往与其他腐烂病易混淆，还可引起食物中毒、人体条件致病。本发明的应用将有助于在诸多形态相近的病原症状中实现唐菖蒲伯克霍尔德菌的快速鉴别。本发明可应用于幼苗的培育过程中，通过对病原的快速高效检测，可以确保脱毒幼苗的质量和增产效果。本发明可对唐菖蒲伯克霍尔德菌进行特异性鉴定，可应用于兰花、皮毛的进出口检疫及食品检验、国内地区间调运以及病害调查等过程中。

核苷酸序列表

<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>用于检测唐菖蒲伯克霍尔德菌的实时荧光PCR引物和探针

<160>3

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<400>1

GTCTTGATAAGGCGGGGGTC20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<400>2

GCTTGACCCGAACGTTTGTC20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<400>3

TTGCAAGCAGGGGGTCGTCG20

Claims (3)

1.一种唐菖蒲伯克霍尔德菌快速检测用的上游引物和下游引物，其特征在于：

上游引物序列为：5′-GTCTTGATAAGGCGGGGGTC-3′；

下游引物序列为：5′-GCTTGACCCGAACGTTTGTC-3′。

2.一种唐菖蒲伯克霍尔德菌快速检测用的的Taqman探针，其特征在于：

序列为：5′-TTGCAAGCAGGGGGTCGTCG-3′，其5′端标记FAM报告荧光集团，3′端标记TAMRA淬灭荧光集团。

3.一种唐菖蒲伯克霍尔德菌的检测试剂盒，其特征在于：包括如下试剂：

(1)2×PCRMasterMix

包括0.05u/μLTaqDNA聚合酶，反应缓冲液，4mmol/L氯化镁，0.4mmol/LdNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)；

其中反应缓冲液含有20mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾和2％曲拉通X-100；

(2)上游引物：10μmol/L，序列为：5′-GTCTTGATAAGGCGGGGGTC-3′；

(3)下游引物：10μmol/L，序列为：5′-GCTTGACCCGAACGTTTGTC-3′；

(4)Taqman探针：10μmol/L，序列为：5′-TTGCAAGCAGGGGGTCGTCG-3′，其5′端标记FAM报告荧光集团，3′端标记TAMRA淬灭荧光集团。